一种红皮云杉体细胞胚诱导植株再生方法及应用

技术领域

本发明涉及一种红皮云杉植株再生方法及其应用。

背景技术

红皮云杉(Picea koraiensis Nakai)又名红皮臭，是松科云杉属常绿乔木，树冠尖塔形，大枝斜伸或平展，小枝上有明显的木针状叶枕；芽长圆锥形，叶锥形，先端尖，多辐射伸展，横切面菱形，四面有气孔线。球果卵状圆柱形或圆柱状矩圆形，熟后绿黄的褐或褐色；种鳞薄木质，三角倒卵形，种子上端有膜质长翅。分布于东北小兴安岭、吉林山区海拔1400--1800米地带，朝鲜及乌苏里地区亦产。较耐荫，浅根性。适应性较强，在分布区内除沼泽化地带及干燥的阳坡、山脊外，在不同立地条件下均能生长。该树种姿态优美，具观赏特性和园林布景。

体细胞胚胎发生是细胞工程中植株再生的重要途径之一，可作为遗传转化的受体系统，同时也是为研究全能性细胞分化及其形态而建成的理想试验体系。在应用上，体细胞胚胎发生是一种有效的大规模无性繁殖方法。在目前已成功诱导体胚形成的植物中，草本植物占了大多数，已有40多种木本植物获得了体细胞胚，尤其是用常规无性繁殖技术很难生根的针叶树的体胚发生研究取得了令人瞩目的进展，20多种不同的针叶树的外植体成功诱导出体细胞胚。

一个完整的植物体细胞胚胎发生技术包括胚性愈伤组织的诱导、胚性愈伤组织的增殖、体细胞胚的分化和成熟体细胞胚的萌发等四个阶段；其中，成熟体细胞胚的萌发阶段作为整个技术体系的最后一步，体细胞胚萌发率的高低及萌发质量，直接决定着最终体胚苗的收获量和整个体胚技术体系构建的成败。

但是，现有红皮云杉再生方法，繁育效率低，萌发率低，萌发周期长，不适于工业化生产问题，不利于红皮云杉的繁育。

而且，针对提高红皮云杉体细胞萌发率，现有方法并没有给出很好的解决方案，大部分手段均是在培养基以及培养条件方面进行改进，这样会增加成本，效果也并不十分显著。

另外，现有针对红皮云杉的黄酮类物质提取，并没有很好的方法能够提高其提取率。

发明内容

本发明为了解决上述存在的问题，而提供了一种红皮云杉体细胞胚诱导植株再生方法及应用。

本发明的一种红皮云杉体细胞胚诱导植株再生方法，它是按照以下步骤进行的：

一、在六月中旬至七月中旬，采摘无性系球果，消毒后，取种球未成熟合子胚，作为体细胞胚诱导外植体材料；

二、对步骤一的外植体材料进行干化处理：

1)将外植体材料置于放有多层滤纸的培养皿内，用封口膜将培养皿封口，然后将培养皿置于培养容器内，再向培养容器内倒入无菌水进行培养；

2)培养条件：在10～60μmol·m^-2·s^-1的光照、光照时间12h、温度为22～25℃条件下培养1～3周，取胚轴及红色胚根作为下步处理的外植体材料；

三、将步骤二干化处理后的外植体材料在无菌条件下，接入到诱导培养基上，在温度为22～26℃、黑暗条件下诱导培养出胚性愈伤组织；

所述的诱导培养基中6-BA的浓度为0～2.0mg/L、萘乙酸浓度为1.0～5.0mg/L、水解酪蛋白浓度为0.7～1.0g/L、谷氨酰胺浓度为450～500mg/L、蔗糖浓度为20～25g/L、凝胶浓度为2～4g/L、激动素浓度为0.5～2.0mg/L和活性炭1～3g/L；pH控制在5.6～5.8；

四、体细胞胚的培养：

1)将上一步骤获得的胚性愈伤组织，切取胚性愈伤组织按质量体积比为1g：10～20mL的比例将其加入到液体培养基中混合，然后过滤，过滤掉液体培养基，将剩余的胚性愈伤组织置于诱导培养基上，在温度为20～25℃、13～15h的光周期、光照强度为1200～1800LX的条件下进行培养20～30d，得愈伤组织；

诱导培养基为3/4MS培养基；其中，6-BA浓度为0.1～2.0mg/L、玉米素ZT浓度为0.3～1.5mg/L、蔗糖浓度为20～25g/L、水解酪蛋白浓度为0.7～1.0g/L、活性炭浓度为1mg/L以及凝胶浓度为2～4g/L；

2)将在上步诱导培养基上培养的愈伤组织转移至诱导出芽培养基上，在温度为18～22℃、10～12h的光周期、光照强度为1000～1500LX的条件下，培养15d；

诱导出芽培养基为1/2MS培养基；其中，赤霉素浓度为0.1～1.0mg/L、萘乙酸浓度为0.01～0.1mg/L、谷氨酰胺浓度为500mg/L、蔗糖浓度为30～40g/L、活性炭浓度为1mg/L以及凝胶浓度为7～8g/L；

3)将上步培养后长出的不定芽在温度为18～22℃、10～12h的光周期、光照强度为1000～1500LX的条件下培养4～5d，然后喷洒280～320mg/L的乙烯利，并用蓝光照射3～5h，继续在在温度为18～22℃、10～12h的光周期、光照强度为1000～1500LX的条件下培1d，然后转移至生根培养基上，在光照时间为15～20h、温度为22～25℃条件下培养20～30d；所述在生根培养基上培养的光照条件为：在第1～10d光照为5～10μM·m^-2·s^-1，在第11～18d光照为15～20μM·m^-2·s^-1，在第19～30d光照为25～40μM·m^-2·s^-1；

生根培养基为1/2MS培养基；其中，吲哚乙酸浓度为0.1～5.0mg/L、蔗糖浓度为10～30g/L以及凝胶浓度为2～8g/L；

五、炼苗：在不定根生长至1.0～1.5cm，打开试管瓶口，在自然光照下，炼苗3～5d，取出后，栽入到腐殖土+珍珠岩+蛭石+禽畜粪便按质量比6∶4∶3∶1的比例混合的基质上，即完成所述的红皮云杉体细胞胚诱导植株再生。

本发明的一种红皮云杉的应用，对上述获取的植株提取黄酮类化合物。

本发明包含以下有益效果：

本发明通过在红皮云杉体细胞诱导培养前，通过对其进行干化处理，同时将诱导、生根等培养基进行改进后，显著提高了红皮云杉繁育效率，萌发周期有效缩短(缩短45天左右)，而且，本发明采用低成本的原料作为培养基，适用于工业化大生产。

PAI是一种诱导酶，其与云杉中黄酮类化合物的含量有着直接的关系，是呈正相关；当植物受到外界刺激时，植物体通过其自身生长发育调节，使得PAI活性升高，从而促使黄酮类化合物的合成。影响PAI活性的因素很多，温度、光照、诱导剂等都可以刺激PAI，使其活性升高，从而提高黄酮类化合物的合成量；本发明发现在云杉组织培养阶段以及种子发芽阶段，是提高黄酮类化合物合成量的有效时期，尤其是种子萌发阶段，本发明通过将280～320mg/L的乙烯利，尤其是300mg/L的乙烯利喷洒到出芽的幼苗中，并通过迅速升温，降温，采用蓝光照射，可以显著提高PAI的活性，从而提高黄酮类化合物的合成量，本发明的黄酮类化合物的合成量提高30～70％。从而为后续提高黄酮类化合物提取率打下基础。

通过本发明的方法优化后培养的红皮云杉成树进行黄酮类化合物提取，黄酮类化合物提取率为5.012％～6.504％。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种红皮云杉体细胞胚诱导植株再生方法，它是按照以下步骤进行的；

一、在六月中旬至七月中旬，采摘无性系球果，消毒后，取种球未成熟合子胚，作为体细胞胚诱导外植体材料；

二、对步骤一的外植体材料进行干化处理：

1)将外植体材料置于放有多层滤纸的培养皿内，用封口膜将培养皿封口，然后将培养皿置于培养容器内，再向培养容器内倒入无菌水进行培养；

2)培养条件：在10～60μmol·m^-2·s^-1的光照、光照时间12h、温度为22～25℃条件下培养1～3周，取胚轴及红色胚根作为下步处理的外植体材料；

三、将步骤二干化处理后的外植体材料在无菌条件下，接入到诱导培养基上，在温度为22～26℃、黑暗条件下诱导培养出胚性愈伤组织；

所述的诱导培养基中6-BA的浓度为0～2.0mg/L、萘乙酸浓度为1.0～5.0mg/L、水解酪蛋白浓度为0.7～1.0g/L、谷氨酰胺浓度为450～500mg/L、蔗糖浓度为20～25g/L、凝胶浓度为2～4g/L、激动素浓度为0.5～2.0mg/L和活性炭1～3g/L；pH控制在5.6～5.8；

四、体细胞胚的培养：

1)将上一步骤获得的胚性愈伤组织，切取胚性愈伤组织按质量体积比为1g：10～20mL的比例将其加入到液体培养基中混合，然后过滤，过滤掉液体培养基，将剩余的胚性愈伤组织置于诱导培养基上，在温度为20～25℃、13～15h的光周期、光照强度为1200～1800LX的条件下进行培养20～30d，得愈伤组织；

诱导培养基为3/4MS培养基；其中，6-BA浓度为0.1～2.0mg/L、玉米素ZT浓度为0.3～1.5mg/L、蔗糖浓度为20～25g/L、水解酪蛋白浓度为0.7～1.0g/L、活性炭浓度为1mg/L以及凝胶浓度为2～4g/L；

2)将在上步诱导培养基上培养的愈伤组织转移至诱导出芽培养基上，在温度为18～22℃、10～12h的光周期、光照强度为1000～1500LX的条件下，培养15d；

诱导出芽培养基为1/2MS培养基；其中，赤霉素浓度为0.1～1.0mg/L、萘乙酸浓度为0.01～0.1mg/L、谷氨酰胺浓度为500mg/L、蔗糖浓度为30～40g/L、活性炭浓度为1mg/L以及凝胶浓度为7～8g/L；

4)将上步培养后长出的不定芽在温度为18～22℃、10～12h的光周期、光照强度为1000～1500LX的条件下培养4～5d，然后喷洒280～320mg/L的乙烯利，并用蓝光照射3～5h，继续在在温度为18～22℃、10～12h的光周期、光照强度为1000～1500LX的条件下培1d，然后转移至生根培养基上，在光照时间为15～20h、温度为22～25℃条件下培养20～30d；所述在生根培养基上培养的光照条件为：在第1～10d光照为5～10μM·m^-2·s^-1，在第11～18d光照为15～20μM·m^-2·s^-1，在第19～30d光照为25～40μM·m^-2·s^-1；

生根培养基为1/2MS培养基；其中，吲哚乙酸浓度为0.1～5.0mg/L、蔗糖浓度为10～30g/L以及凝胶浓度为2～8g/L；

五、炼苗：在不定根生长至1.0～1.5cm，打开试管瓶口，在自然光照下，炼苗3～5d，取出后，栽入到腐殖土+珍珠岩+蛭石+禽畜粪便按质量比6∶4∶3∶1的比例混合的基质上，即完成所述的红皮云杉体细胞胚诱导植株再生。

具体实施方式二：本实施方式的一种红皮云杉的应用，对具体实施方式一获取的植株提取黄酮类化合物。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：所述的植株是指：将具体实施方式一获得的再生植株移栽后，收获其种子进行萌发，再移栽，对移栽后的树木提取黄酮类化合物。其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二不同的是：所述的萌发是按照以下步骤进行的：

一、在8～10月收获种子，将种子与雪按照1:3的重量比混合后置于深、宽均为1m的沟内，上面覆盖雪和覆土，并覆盖秸秆；其中，沟底垫10～15cm的积雪；

二、在播种前5d将种子取出，取种子用40～50℃浸泡1～2d，浸泡期间搅动5～6次；然后在23～26℃温度下自然晾晒2～3d，

三、将湿沙与种子按照重量比为3:1的比例混合，放置于背阴处，在温度为5～8℃下培养至出芽，在出芽当天，首先，喷洒280～320mg/L的乙烯利，喷洒后将温度升温至15℃或20℃后，立即降温至5～8℃，然后采用蓝光照射3～4h，继续在温度为5～8℃下培养1～2d，即完成所述的萌发。

其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二不同的是：提取黄酮类化合物的过程如下：

一、将萌发后的幼苗移栽；

二、取步骤一移栽多年后风干的红皮云杉叶片粉碎，过筛，备用；

三、按物料比为1g:8～12mL的比例向过筛后的粉末中加入体积浓度为45～60％的乙醇，置于匀浆机中，在温度为60～70℃，匀浆2～6min，得匀浆液；将匀浆液中乙醇去除后，再按物料比为1g:18～20mL的比例加入体积浓度为50～70％的乙醇，浸泡0.5～1.5h，然后在微波功率为250～300W、温度为60～80℃的条件下，提取4～7min，得提取液；

四、按体积比为1:1的比例，向步骤二得到的提取液加入乙醚，振荡萃取30～35min，收集萃取相；对乙醚萃取余相进行重新按照上述体积比加入乙醚进行萃取；

五、重复步骤四操作2～3次，合并萃取相；

六、对步骤五的萃取相进行减压浓缩，将浓缩后的浓缩液过硅胶柱层析进行分离，收集洗脱液；减压浓缩，即完成所述的黄酮类化合物提取。

其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二不同的是：所述的黄酮类化合物为异黄酮、二氢异黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、查耳酮和二氢查耳酮。其它与具体实施方式二相同。

本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。

通过以下实施例验证本发明的有以效果：

实施例1

本实施例的一种红皮云杉体细胞胚诱导植株再生方法，它是按照以下步骤进行的：

一、在六月中旬至七月中旬，采摘无性系球果，消毒后，取种球未成熟合子胚，作为体细胞胚诱导外植体材料；

二、对步骤一的外植体材料进行干化处理：

1)将外植体材料置于放有多层滤纸的培养皿内，用封口膜将培养皿封口，然后将培养皿置于培养容器内，再向培养容器内倒入无菌水进行培养；

2)培养条件：在10～60μmol·m^-2·s^-1的光照、光照时间12h、温度为22～25℃条件下培养3周，取胚轴及红色胚根作为下步处理的外植体材料；

三、将步骤二干化处理后的外植体材料在无菌条件下，接入到诱导培养基上，在温度为22～26℃、黑暗条件下诱导培养出胚性愈伤组织；

所述的诱导培养基中6-BA的浓度为1.0mg/L、萘乙酸浓度为3.0mg/L、水解酪蛋白浓度为1.0g/L、谷氨酰胺浓度为500mg/L、蔗糖浓度为20g/L、凝胶浓度为2g/L、激动素浓度为1.0mg/L和活性炭2g/L；pH控制在5.6～5.8；

四、体细胞胚的培养：

1)将上一步骤获得的胚性愈伤组织，切取胚性愈伤组织按质量体积比为1g：12mL的比例将其加入到液体培养基中，然后过滤，过滤掉液体培养基，将剩余的胚性愈伤组织置于诱导培养基上，在温度为20～25℃、13～15h的光周期、光照强度为1200～1800LX的条件下进行培养23d；

诱导培养基为3/4MS培养基：6-BA浓度为2.0mg/L、玉米素ZT浓度为0.3mg/L、蔗糖浓度为20g/L、水解酪蛋白浓度为1.0g/L、活性炭浓度为1.0mg/L以及凝胶浓度为2g/L；

2)将在上述诱导培养基上培养的愈伤组织转移至诱导出芽培养基上，在温度为18～22℃、10～12h的光周期、光照强度为1000～1500LX的条件下，培养15d；

诱导出芽培养基为1/2MS培养基：赤霉素浓度为0.1mg/L、萘乙酸浓度为0.01mg/L、谷氨酰胺浓度为500mg/L、蔗糖浓度为35g/L、活性炭浓度为1mg/L以及凝胶浓度为7g/L；

5)将上述培养后长出的不定芽在温度为18～22℃、10～12h的光周期、光照强度为1000～1500LX的条件下培养4～5d，然后喷洒300mg/L的乙烯利，并用蓝光照射3～5h，继续在在温度为18～22℃、10～12h的光周期、光照强度为1000-1500LX的条件下培1d，然后转移至生根培养基上，在光照时间为15～20h、温度为22～25℃条件下培养20～30d；所述转移至生根培养基的光照条件为：在第1～10d光照为5～10μM·m^-2·s^-1，在第11～18d光照为15～20μM·m^-2·s^-1，在第19～30d光照为25～40μM·m^-2·s^-1；

生根培养基为1/2MS培养基：吲哚乙酸浓度为2.0mg/L、蔗糖浓度为20g/L以及凝胶浓度为5g/L；

五、炼苗：在不定根生长至1.0～1.5cm，打开试管瓶口，在自然光照下，炼苗3～5d，取出后，栽入到腐殖土+珍珠岩+蛭石+禽畜粪便按质量比6∶4∶3∶1的比例混合的基质上，即完成所述的红皮云杉体细胞胚诱导植株再生。

通过本实施例处理后的体细胞胚萌发率最高达80.5％。本实施例在诱导分化前，对体细胞胚进行干化处理，通过此种方法处理后的体细胞，显著提高了其诱导萌发率。同时，本实施例在生根培养阶段，对外植体进行处理，通过调节温度，光照，以及喷洒乙烯利的方式，提高红皮云杉黄酮类化合物生成量，为后续提高黄酮类化合物提取量打下基础。

通过本实施例的方法红皮云杉顶芽或带侧芽的茎段经12天左右培养便可得以诱导芽分化，25天左右为1个继代增殖周期，经10天培养便可得以诱导丛生芽，经20天左右培养便可生出根毛，整个繁殖周期最短达到了45天左右。

实施例2

本实施例提取黄酮类化合物的过程如下：

在提取前，先将实施例1获得的再生植株移栽后，收获其种子进行萌发，再移栽，对移栽后的树木提取黄酮类化合物。

所述的萌发是按照以下步骤进行的：

一、在8～10月收获种子，将种子与雪按照1:3的重量比混合后置于深、宽均为1m的沟内，上面覆盖雪和覆土，并覆盖秸秆；其中，沟底垫10～15cm的积雪；

二、在播种前5d将种子取出，取种子用40～50℃浸泡1～2d，浸泡期间搅动5～6次；然后在23～26℃温度下自然晾晒2～3d，

三、将湿沙与种子按照重量比为3:1的比例混合，放置于背阴处，在温度为5～8℃下培养至出芽，在出芽当天，首先，喷洒300mg/L的乙烯利，喷洒后将温度升温至15℃后，立即降温至5～8℃，然后采用蓝光照射4h，继续在温度为5～8℃下培养1～2d，即完成所述的萌发。

提取黄酮类化合物：

一、将萌发后的幼苗移栽；

二、取步骤一移栽多年后风干的红皮云杉叶片粉碎，过筛，备用；

三、按物料比为1g:10mL的比例向过筛后的粉末中加入体积浓度为45～60％的乙醇，置于匀浆机中，在温度为60～70℃，匀浆2～6min，得匀浆液；将匀浆液中乙醇去除后，再按物料比为1g:20mL的比例加入体积浓度为50～70％的乙醇，浸泡0.5～1.5h，然后在微波功率为280W、温度为70℃的条件下，提取4～7min，得提取液；

四、按体积比为1:1的比例，向步骤二得到的提取液加入乙醚，振荡萃取30～35min，收集萃取相；对乙醚萃取余相进行重新按照上述体积比加入乙醚进行萃取；

五、重复步骤四操作2～3次，合并萃取相；

六、对步骤五的萃取相进行减压浓缩，将浓缩后的浓缩液过硅胶柱层析进行分离，收集洗脱液；减压浓缩，即完成所述的黄酮类化合物提取。

通过本实施例的方法黄酮类化合物提取率为6.504％，黄酮类化合物提取在红皮云杉中的含量增长了70％。