对抗抗淀粉样β肽的抗体的抗独特型抗体

本申请是申请人于2009年12月18日提交的题为“对抗抗淀粉样β肽的抗体的抗独特型抗体”的中国专利申请200980151715.4的分案申请。

本发明涉及结合抗-Aβ抗体的抗独特型抗体和用于检测抗体结合抗-Aβ抗体上的相同或重叠表位的试验。

发明背景

大约所有痴呆病例中的70％是由于阿尔茨海默氏病引起的，该疾病与对于认知重要的大脑区域和神经回路的选择性损伤相关。阿尔茨海默氏病的特征在于神经纤维缠结(特别是在海马的椎体神经元中)和大量主要含有淀粉样沉积物的致密核心和淡染(defused)晕圈的淀粉样斑块。

胞外神经斑块含有大量称为“淀粉样β”、“A-β”、“Aβ4”、“β-A4”或“Aβ”的主要的纤维肽(参见，例如，Selkoe，D.J.，Ann.Rev.Cell Biol.10(1994)373-403；Koo，E.H.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(1999)9989-9990；US 4,666,829；或Glenner，G.G.，Biochem.Biophysic.Res.Commun.122(1984)1131-1135)。这种淀粉样β肽源自“阿尔茨海默前体蛋白/β-淀粉样前体蛋白”(APP)。APP是完整膜糖蛋白(参见，例如，Sisodia，S.S.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)6075-6079)，并且通过质膜蛋白酶，α-分泌酶在Aβ序列内通过内部蛋白质水解分裂(参见，例如，Sisodia(1992)，loc.cit.)。此外，更多的分泌酶活性，特别是β-分泌酶和γ-分泌酶活性，导致包含39个氨基酸(Aβ39)、40个氨基酸(Aβ40)、42个氨基酸(Aβ42)或43个氨基酸(Aβ43)的淀粉样-β(Aβ)的胞外释放(参见，例如，Sinha，S.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(1999)11049-11053；Price，D.L.，Science 282(1998)1079-1083；WO 00/72880；或Hardy，J.，Trends in Neuroscience(1997)154-159)。

值得注意的是Aβ具有几种天然产生的形式，由此将人的形式称为以上提及的Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42和Aβ43。最重要的形式Aβ42具有氨基酸序列(从N-端开始)：DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID NO:13)。在Aβ41、Aβ40、Aβ39中，各自缺失了C-端A、IA和VIA。在Aβ43-形式中，在上述序列的C-端包含另外的苏氨酸残基。

使用抗体的标准固相免疫试验涉及吸附/固定于固相上的抗体(捕获抗体)、抗原和用酶或检测标记偶联的抗原的另一个表位的抗体(示踪抗体)之间的复合物的形成。在该试验中，形成了多层结构：固相/捕获抗体/抗原/示踪抗体。在通过多层结构催化的反应中，其中抗体-偶联酶的活性与孵育培养基中的抗原浓度成比例。标准多层结构方法也称为双抗原桥接免疫试验，因为捕获抗体和示踪抗体结合相同抗原上的不同表位。Hoesel，W.等(J.Immunol.Methods 294(2004)101-110)报道了抗-EPO双抗原桥接试验，其中使用了与氨基和碳水化合物基团偶联的固定化rhEPO的混合物。如双抗原桥接ELISA这样的免疫试验是病人对药物抗体的致免疫答案研究的常用试验类型。Mire-Sluis，A.R.等(J.Immunol.Methods 289(2004)1-16)总结了使用对抗生物技术产物的宿主抗体的检测来设计和优化免疫试验的建议。例如，在WO2005/045058和WO90/006515中提及了抗药物抗体试验。例如，在US5,219,730；WO87/002778；EP0139389和EP0170302中提及了抗独特型抗体试验。Wadhwa，M.等(J.Immunol.Methods 278(2003)1-17)报道了用于检测、测量和表征由治疗性生物制品诱导的不需要的抗体的策略。在US2007/0093415中，报道了淀粉样特异性肽及其用途。在EP1917854中，报道了产生抗独特型抗体的方法。

发明概述

本发明的第一个方面是结合对抗淀粉样β肽的抗体的抗独特型抗体及其在根据本发明的试验中的用途。在一个实施方案中，所述抗体的特征在于结合与获自保藏的细胞系DSM ACC2939的抗体相同或重叠的表位。另一个实施方案是所述抗体是获自保藏的细胞系DSM ACC2939的抗体。

本发明的其他方面是使用免疫试验来免疫测定样品中对抗淀粉样β肽的抗体的方法和使用免疫试验来免疫测定样品中对抗抗淀粉样β肽的抗体的抗独特型抗体的方法。

在用于免疫测定样品中对抗淀粉样β肽的抗体的方法的实施方案中，免疫试验包括捕获抗体、示踪抗体和检测抗体，其中捕获抗体是通过链霉抗生物素与固相偶联的对抗抗淀粉样β肽的抗体的生物素化抗独特型抗体，示踪抗体是与作为检测标记的地高辛配基偶联的对抗抗淀粉样β肽的抗体的抗独特型抗体，而检测抗体是与辣根过氧化物酶偶联的对抗地高辛配基的抗体。

在用于免疫测定样品中对抗淀粉样β肽的抗体的方法的其他实施方案中，免疫试验包含与固相偶联的淀粉样β肽，与作为检测标记的地高辛配基偶联的对抗抗淀粉样β肽的抗体的抗独特型抗体和与辣根过氧化物酶偶联的对抗地高辛配基的检测抗体。

在一个实施方案中，对抗抗淀粉样β肽的抗体的抗独特型抗体结合与获自保藏的细胞系DSM ACC2939的抗体相同或重叠的表位。在另一个实施方案中，对抗抗淀粉样β肽的抗体的抗独特型抗体是获自保藏的细胞系DSM ACC2939的抗体。

在用于免疫测定样品中对抗抗淀粉样β肽的抗体的抗独特型抗体的方法的一个实施方案中，免疫试验包括捕获抗体和示踪抗体，其中捕获抗体是对抗与结合对的第一部分偶联的淀粉样β肽的抗体，而示踪抗体是对抗与检测标记偶联的淀粉样β肽的抗体。在一个实施方案中，免疫试验包括对抗与辣根过氧化物酶偶联的地高辛配基的检测抗体。

在用于免疫测定样品中对抗抗淀粉样β肽的抗体的抗独特型抗体的方法的其他实施方案中，免疫试验包括与固相偶联的淀粉样β肽，对抗与作为检测标记的地高辛配基偶联的淀粉样β肽的抗体和对抗与辣根过氧化物酶偶联的地高辛配基的检测抗体。

在根据本发明方法的一个实施方案中，免疫试验包括捕获抗体和示踪抗体，其中捕获抗体是包含至少两种抗体的混合物，所述抗体与固相偶联的抗体位点不同，而示踪抗体是包含至少两种抗体的混合物，所述抗体与检测标记偶联的抗体位点不同。

在一个实施方案中，通过经由N-端和/或ε-氨基(赖氨酸)，不同赖氨酸的ε-氨基，药物抗体的氨基酸主链的羧基-、巯基-、羟基-和/或酚官能团和/或药物抗体的碳水化合物结构的糖醇基团的化学结合来进行抗体与其偶联配偶体的偶联。在另一个实施方案中，捕获抗体混合物包含通过氨基和通过碳水化合物结构与其偶联配偶体偶联的抗体。

在一个实施方案中，对抗淀粉样β肽的抗体是WO03/070760中记载的抗体。在另一个实施方案中，对抗淀粉样β肽的抗体包括选自SEQ IDNO:1、2和3的重链CDR3和选自SEQ IDNO:4、5和6的轻链CDR3。在进一步的实施方案中，对抗淀粉样β肽的抗体包括选自SEQ IDNO:7、8和9的重链可变结构域和/或选自SEQ ID NO:10、11和12的轻链可变结构域。

在进一步的实施方案中，捕获抗体混合物和/或示踪抗体混合物包含通过至少两个不同氨基与其偶联配偶体偶联的抗体。这样的通过不同氨基的偶联可这样进行，在第一步中，可以通过用化学保护剂将ε-氨基的一部分酰化(例如，柠康酰化(citraconylation))。在第二步中，通过剩余的氨基进行偶联。随后除去柠康酰化，并通过剩余的游离氨基将抗体与偶联配偶体偶联，即，将所获得的抗体通过未受柠康酰化保护的氨基与偶联配偶体偶联。合适的化学保护剂在未受保护的侧链胺形成键，并且没有N端形成的那些键稳定，而且不同于N端形成的那些键。许多这样的化学保护剂是已知的(参见，例如EP0651761)。在一个实施方案中，化学保护剂包括环二羧酸酐类，如马来酸酐或柠康酸酐。

在一个实施方案中，捕获抗体通过被动吸附与固相偶联，并因此在至少两个不同的抗体位点与固相偶联。被动吸附，例如，描述于Butler，J.E.的“Solid Phases inImmunoassay”(免疫试验中的固相)，(1996)205-225和Diamandis，E.P.和Christopoulos，T.K.(编辑)的“Immunoassays”(免疫试验)(1996)Academic Press(San Diego)。

在一个实施方案中，示踪抗体混合物包含通过氨基和通过碳水化合物结构与其偶联配偶体偶联的抗体。

在另一个实施方案中，捕获抗体与示踪抗体的比例为1:10至50:1(比例表示抗体分子的摩尔比，与偶联物的分子量无关，所述偶联物可以是不同的)。在进一步的实施方案中，该混合物中的氨基偶联抗体(示踪抗体或捕获抗体)与碳水化合物偶联抗体(示踪抗体或捕获抗体)的比例为1:10至10:1(比例表示抗体分子的摩尔比，与偶联物的分子量无关，所述偶联物可以是不同的)。

在本发明的一个实施方案中，捕获抗体通过特定的结合对来偶联(固定化)。在一个实施方案中，这样的结合对(第一种成分/第二种成分)选自链霉抗生物素或抗生物素蛋白/生物素、抗体/抗原(参见，例如，Hermanson，G.T.等，Bioconjugate Techniques，Academic Press，1996)、凝集素/多糖、类固醇/类固醇结合蛋白、激素/激素受体、酶/底物、IgG/蛋白A和/或G等。在一个实施方案中，捕获抗体与生物素偶联，并且优选通过固定化的抗生物素蛋白或链霉抗生物素进行固定化。

在另一个实施方案中，示踪抗体与检测标记偶联。在一个实施方案中，示踪抗体通过地高辛配基和对抗地高辛配基的抗体与检测标记偶联。或者，示踪抗体与电化学发光标记(如二吡啶基钌(ruthenium bispyridyl)复合物)偶联。

发明详述

根据本发明的术语“对抗淀粉样β肽的抗体”表示可以施用于个体的抗体，使得施用后推测所述个体的样品包含所述抗体。在根据本发明的一个试验内，捕获抗体和示踪抗体包含“相同的”抗体分子，例如，用相同的表达载体重组产生的，并包含相同的氨基酸序列。对抗淀粉样β肽的抗体描述于，例如，US 7,256,273、US 7,189,819，US 7,179,892，US7,195,761，US 2008/0281082，US 2008/0221306，US 2008/0131422，US 2008/0050367，US2007/0238154，US 2007/0154480，US 2007/0110750，US 2006/0280743，US 2006/0292152，US 2006/0165682，US 2006/0057701，US 2006/0057702，US 2006/0039906，US 2005/0249725，US 2005/0169925，US 2005/0118651，US 2005/0009150，US 2004/0171816，US2004/0171815和US 2004/0192898。

“抗独特型抗体”是针对治疗性抗体的抗原结合位点(即，可变区，如互补决定区)的抗体。这样的抗独特型抗体可以在抗体治疗过程中作为病人的免疫反应而产生(参见，例如，Pan，Y.等，FASEB J.9(1995)43-49)。在一个实施方案中，所述对抗抗淀粉样β肽的抗体的抗独特型抗体结合对抗淀粉样β肽的抗体的一个或多个CDR。

本发明的第一个方面是结合对抗淀粉样β肽的抗体的抗独特型抗体。本发明该方面的示例性抗体是获自保藏的细胞系DSM ACC2939的抗体。该抗体及其在根据本发明的试验中的用途也是本发明的方面。在一个实施方案中，所述抗独特型抗体的特征在于结合与获自保藏的细胞系DSM ACC2939的抗体相同或重叠的表位。如果使用固定化抗体和可溶性抗原或反之，通过表面等离振子共振(SPR)试验检测信号降低50％或更多(在一个实施方案中，75％或更多)，则两个表位重叠，该试验采用的所讨论表位的浓度为20-50nM，而且待检测表拉重叠的抗体的浓度为100nM。或者，可以使用其中借助竞争性测试系统测定结合相同抗原的两个抗体的表位重叠的方法。为此，例如，借助基于细胞的酶免疫试验(ELISA)，使用表达重组抗原表位的细胞，测试待检测的表位重叠的抗体是否与结合固定化抗原的其他抗体竞争。为此，用标记形式的抗体，以及过量的待测定表位重叠的抗体孵育固定化抗原。通过结合标记的检测，可以容易地确定表位重叠。如果在相同的浓度下，信号降低超过70％(在一个实施方案中超过80％)，或在较高浓度下，超过80％的置换(在一个实施方案中超过90％)，在一种情况中，相当于测定的已知抗体，待测定的表位重叠的抗体10⁵倍过量，则存在表位相等或重叠，并且两个抗体结合相同抗原上的相同或重叠的表位。根据本发明的抗独特型抗体抗特异性结合淀粉样β肽的氨基酸序列的抗体，例如，在一个实施方案中，结合SEQ>

例如，Hage，D.S.(Anal.Chem.71(1999)294R-304R)描述了不同免疫试验的原理。Lu，B.等(Analyst 121(1996)29R-32R)报道了抗体的定向固定，以用于免疫试验中。例如，Wilchek，M.和Bayer，E.A.，见Methods Enzymol.184(1990)467-469报道了抗生物素蛋白-生物素介导的免疫试验。

单克隆抗体及其恒定结构域含有一些和蛋白质一样的用于偶联结合配偶体的反应性侧链，如表面、蛋白质、聚合物(例如，PEG、纤维素或聚苯乙烯)、酶或结合对的成员。抗体的化学反应基是例如氨基(赖氨酸、α-氨基)、硫醇基(胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸)、羧酸基团(天冬氨酸、谷氨酸)和糖醇基团。例如，Aslam M.和Dent，A.描述了这样的方法，见“Bioconjugation”(生物偶联)，MacMillan Ref.Ltd.1999，第50-100页。

蛋白质的最常见反应基之一是氨基酸赖氨酸的脂肪族ε-胺。通常，几乎所有的抗体含有大量的赖氨酸。赖氨酸胺在高于pH8.0是相当好的亲核试剂(pKa＝9.18)，并且因此容易且完全地与多种试剂反应，以形成稳定的键。胺-反应试剂主要与蛋白质的赖氨酸和α-氨基反应。反应性酯，特别是N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)酯，是最常用的用于氨基修饰的试剂。用于在含水环境中反应的最佳pH是pH8.0至9.0。异硫氰酸酯是胺修饰剂，并与蛋白质形成硫脲键。它们在水溶液中与蛋白质胺反应(最优在pH9.0至9.5)。酐在温和的含水条件下与脂肪族和芳香族胺、胼和酰肼反应，以形成亚胺中间产物(席夫碱)。可以用温和或强还原剂(如硼氢化钠或氰基硼氢化钠)选择性地还原席夫碱，以产生稳定的烷基胺键。已经用于修饰胺的其他试剂是酸酐。例如，二乙烯三胺五醋酐(DTPA)是含有两个胺反应性酐基团的双功能螯合剂。其可以与蛋白质的N-端和ε-胺基反应形成酰胺键。打开酐环形成的多价金属螯合臂能够紧密地结合配位复合物中的金属。

抗体中另一个常见反应基是来自含硫氨基酸胱氨酸及其还原产物半胱氨酸(或半胱氨酸)的硫醇残基。半胱氨酸含有游离的硫醇基，其比胺更亲核并且通常是蛋白质中反应性最高的官能团。硫醇通常在中性pH下反应，并且因此可以在胺的存在下与其他分子选择性地偶联。由于游离硫氢基是相对反应性的，因此具有这些基团的蛋白质通常以其氧化形式作为二硫基或二硫键存在。在这些蛋白质中，需要用试剂(如二硫苏糖醇(DTT))还原二硫键来产生反应性游离硫醇。硫醇反应性试剂是将与蛋白质上的硫醇基偶联的那些，形成硫酯偶联的产物。这些试剂在略酸性至中性pH下快速反应，并因此可以在胺基的存在下选择性地反应。文献报道了使用几种巯化交联剂，如，Traut’s试剂(2-亚氨基四氢噻吩)、琥珀酰亚胺(乙酰硫代)醋酸酯(SATA)和磺基琥珀酰亚胺6-[3-(2-吡啶二硫代)丙酰胺基]己酸酯(磺基-LC-SPDP)，以提供通过反应性氨基引入多个硫氢基的有效方式。卤代乙酰衍生物(例如，碘乙酰胺)形成硫酯键，并且也是用于硫醇修饰的试剂。更多有用的试剂是马来酰亚胺。马来酰亚胺与硫醇反应剂的反应基本上与碘乙酰胺的相同。马来酰胺在略酸性至中性pH下快速反应。

抗体中的另一类常见反应基是羧酸。蛋白质在C-端位置和侧链内的天冬氨酸和谷氨酸含有羧酸基团。羧酸在水中相对低的反应性通常使得难以使用这些基团来选择性地修饰蛋白质和其他生物分子。进行这时，通常通过使用水溶性碳二亚胺将羧酸基团转化成反应性酯，并与亲核试剂(如胺、酰肼或胼)反应。含胺试剂应当是弱碱性的，使得在更碱性的赖氨酸的ε-胺存在下与激活的羧酸选择性地反应，形成稳定的酰胺键。将pH升高超过8.0时，将产生蛋白质交联。

高碘酸钠可以用于将连接抗体的碳水化合物部分内的糖的醇部分氧化成醛。与对于羧酸所述的一样，每个醛基团可以与胺、酰肼或胼反应。由于主要在抗体的可结晶片段(Fc)区域发现碳水化合物部分，因此可以通过远离抗原结合位点的碳水化合物的定点修饰来实现偶联。形成席夫碱中间产物，其可以通过用氰基硼氢化钠(温和和选择性的)或硼氢化钠(强)水溶性还原剂还原中间产物而还原成烷基胺。

术语“样品”包括，但不限于，任何量的来自生物或之前是生物的物质。这样的生物包括，但不限于，人、小鼠、猴、大鼠、兔子和其他动物。这样的物质包括，但不限于，来自个体的全血、血清或血浆，这是临床程序中最广泛使用的样品来源。

术语“固相”意思是非流体的物质，并且包括从诸如聚合物、金属(顺磁、铁磁颗粒)、玻璃和陶瓷这样的材料制得的颗粒(包括微粒和珠子)；凝胶物质，如二氧化硅、矾土(alumina)和聚合物凝胶；毛细管，其可以由聚合物、金属、玻璃和/或陶瓷制得；沸石和其他多孔物质；电极；微量滴定平板；固体条；和比色皿、试管或其他分光计样品容器。试验的固相成分不同于试验可以接触的惰性固体表面，因为“固相”在其表面含有至少一个部分，打算将其与捕获药物抗体相互作用。固相可以是固定的成分，如试管、条、比色皿或微量滴定平板，或可以是非固定的成分，如珠子和微粒。可以使用允许蛋白质和其他物质非共价或共价连接的各种微粒。这样的颗粒包括聚合物颗粒，如聚苯乙烯和聚(甲基丙烯酸甲酯)；金颗粒，如金纳米颗粒和胶体金；和陶瓷颗粒，如二氧化硅、玻璃和金属氧化物颗粒。参见，例如，Martin，C.R.等，AnalyticalChemistry-News&Features，70(1998)322A-327A，或Butler，J.E.，Methods 22(2000)4-23。

在一个实施方案中，从发色团(荧光或发光基团和染料)、酶、NMR-活性基团、金属颗粒或半抗原(如，地高辛配基)中选择检测标记。检测标记还可以是光可激活的交联基团，例如，叠氮或azirine基团。在一个实施方案中，可以通过电化学发光检测的金属螯合物也是信号发射基团，特别优选钌螯合物，例如，钌(二吡啶基)₃^2-螯合物。例如，EP0580979、WO90/05301、WO>

本发明提供了使用包含捕获抗体和示踪抗体的免疫试验来免疫测定样品中对抗抗淀粉样β肽的抗体的抗独特型抗体的方法。在一个实施方案中，免疫试验是抗原桥接免疫试验。在另一个实施方案中，免疫试验包含捕获抗体和示踪抗体，其中捕获抗体是对抗淀粉样β肽的抗体的混合物，包含至少两种在与固相偶联的抗体位点方面不同的抗体，而示踪抗体是对抗淀粉样β肽的抗体的混合物，包含至少两种在与检测标记偶联的抗体位点方面不同的抗体。

对于样品中对抗淀粉样β肽的抗体的定量和/或测定，通常/一般所用的试验具有局限性，例如，其由对抗淀粉样β肽的抗体结合淀粉样β肽的变化引起。已经发现了通过在免疫试验中使用根据本发明的对抗抗淀粉样β肽的抗体的抗体(抗-抗-Aβ抗体抗体)，可以克服这些局限性。

将根据本发明方法中有用的捕获抗体与固相偶联。在一个实施方案中，通过经由抗体氨基酸主链的N-端和/或ε-氨基(赖氨酸)、不同赖氨酸的ε-氨基、羧基-、硫氢基-、羟基-和/或酚官能团和/或抗体的碳水化合物结构的糖醇基团的化学结合来进行偶联。在一个实施方案中，在根据本发明的方法中有用的捕获抗体是与固相偶联的至少两种抗体的混合物，其中与固相偶联的至少两种抗体在与固相偶联的位点方面不同。例如，与固相偶联的至少两种抗体的混合物可以包含通过抗体氨基酸主链的氨基酸与固相偶联的对抗淀粉样β肽的抗体和通过抗体的碳水化合物结构的糖醇基团与固相偶联的对抗淀粉样β肽的抗体。此外，例如，与固相偶联的至少两种抗体的混合物可以包含通过它们的氨基酸主链的不同氨基酸残基与固相偶联的抗体。表述“不同的氨基酸残基”表示两种不同类型的氨基酸(如，赖氨酸和天冬氨酸，或酪氨酸和谷氨酸)，或在抗体的氨基酸序列中位置不同的氨基酸主链的两个氨基酸残基。在后一种情况中，氨基酸可以是相同类型或不同类型的。表述“抗体位点不同”和“位点”表示位点类型的不同(例如，氨基酸或糖醇基团)，或表示氨基酸主链的氨基酸数量的不同，例如，在其上抗体与固相偶联。反之同样适用于根据本发明的方法中有用的示踪抗体。

在本发明的一个实施方案中，对抗淀粉样β肽的抗体的重链可变结构域包含具有选自SEQ ID NO:1、2或3的氨基酸序列的CDR3。在进一步的实施方案中，所述对抗淀粉样β肽的抗体的轻链可变结构域包含具有选自SEQ ID NO:4、5或6的氨基酸序列的CDR3。在进一步的实施方案中，对抗淀粉样β肽的抗体包含重链可变结构域，其具有选自SEQID NO:7、8或9的氨基酸序列。再进一步的实施方案中，所述对抗淀粉样β肽的抗体包含轻链可变结构域，其具有选自SEQ ID NO:10、11或12的氨基酸序列。

在根据本发明方法的一个实施方案中，免疫试验包括对抗淀粉样β肽的单克隆抗体的F(ab’)₂片段作为捕获抗体，其是生物素化的并通过链霉抗生物素与固相偶联，以及与辣根过氧化物酶偶联的对抗人免疫球蛋白G的多克隆抗体作为示踪抗体。

在根据本发明方法的另一个实施方案中，免疫试验是双抗原桥接免疫试验。

在根据本发明方法的其他实施方案中，免疫试验包括捕获抗体、示踪抗体和检测抗体，其中捕获抗体是通过链霉抗生物素与固相偶联的生物素化的对抗淀粉样β肽的抗体，示踪抗体是与地高辛配基偶联的对抗淀粉样β肽的抗体，而检测抗体是与辣根过氧化物酶偶联的对抗地高辛配基的抗体。

在根据本发明方法的另一个实施方案中，免疫试验包括捕获抗体、示踪抗体和检测抗体，其中捕获抗体是通过链霉抗生物素与固相偶联的生物素化的对抗抗淀粉样β肽抗体的抗独特型抗体，示踪抗体是与作为检测标记的地高辛配基偶联的对抗抗淀粉样β肽抗体的抗独特型抗体，而检测标记是与辣根过氧化物酶偶联的对抗地高辛配基的抗体。

在根据本发明方法的另一个实施方案中，免疫试验包括与固相偶联的淀粉样β肽，与作为检测标记的地高辛配基偶联的对抗抗淀粉样β肽抗体的抗独特型抗体以及与辣根过氧化物酶偶联的抗地高辛配基的检测抗体。

根据本发明的鼠-鼠杂交瘤细胞系，杂交瘤细胞系MAK<Mab31>M-1.5.74，依据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约，于2008年7月29日以保藏号No.DSMACC2939保藏于德国的德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMilkroorganismenund Zellkulturen GmbH,DSMZ)。

提供以下实施例、序列表和附图来帮助理解本发明，其真实的范围列于所附的权利要求中。将理解可以在所列的程序中进行改变，而没有脱离本发明的精神。

附图描述

图1抗独特型抗人Aβ抗体抗体的选择。

图2评价交叉反应性的试验。

图3抗人Aβ抗体的定量。

图4用于定量抗人Aβ抗体的替换试验。

图5抗-抗-人Aβ抗体抗体(ADA)的检测。

图6中和抗-抗-人Aβ抗体抗体的检测。

实施例

实施例1

对抗淀粉样β肽的抗体的F(ab’)₂片段的制备

例如，WO2003/0707760或US2005/0169925中或SEQ ID NO:1至12中记载了示例性对抗淀粉样β肽的抗体(抗-Aβ抗体)及其相应的核酸序列。

用胃蛋白酶(5μg胃蛋白酶/mg抗体)孵育100mM柠檬酸钠缓冲液(pH3.6)中的抗-Aβ抗体。通过分析凝胶过滤来分析片段分段，并在50分钟后通过使用磷酸钾将pH调节至7.0来停止。在相对含有pH7.5的300mM柠檬酸钠的50mM磷酸钾缓冲液对混合物进行透析后，将制备物浓缩至约20mg/ml并施加于凝胶过滤柱上(Superdex 200)。通过分析凝胶过滤分析了收集的级分并将含有F(ab’)₂片段的级分施加于亲和性基质，该亲和性基质含有固定化的对抗人Fcγ的多克隆抗体，以消除痕量的含有Fcγ的片段。集合流过物并使最终浓缩至约20mg/ml。

实施例2

单克隆抗独特型抗体的产生

a)小鼠的免疫

首先用与CFA(完全Freund’s佐剂)混合的如实施例1中所示而获得的100μg单克隆抗-Aβ抗体的F(ab’)₂片段腹膜内首次免疫各自8-12周龄的雌性Balb/c或NMRI小鼠，该单克隆抗-Aβ抗体包含选自SEQ>2片段。随后，在融合前三天，各自进行了静脉内或腹膜内加强免疫，各自使用PBS(磷酸盐缓冲盐水)中的25至100μg的F(ab’)₂片段。

b)融合和克隆

根据Galfré，G.和Milstein，C.(Galfré，G.和Milstein，C.，Methods Enzymol.73(1981)3-46)进行了源自根据a)免疫的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞的融合。将大约1×10⁸个脾细胞与2×10⁷个骨髓瘤细胞(P3×63-Ag8.653，ATCC>

表1：产生抗独特型单克隆抗体的克隆

c)从细胞培养物上清液生产免疫球蛋白

以1.0×10⁵个细胞/ml的初始细胞密度接种所产生的杂交瘤细胞在补充了10％FCS的RPMI>6个细胞/ml的初始细胞密度(活细胞)的细胞接种Miniperm装置，并扩大。在收集的培养物上清液中，获得了1.2mg单克隆抗体/ml的浓度。根据标准蛋白质化学方法，例如，根据Bruck，C.等，Methods>

实施例3

用于检测抗独特型抗体的筛选试验

a)对于结合药物抗体的抗体的初级筛选

为了测定杂交瘤细胞的培养物上清液中的抗体的特异性，用补充了1.0％(w/v)BSA级分II的PBS中的生物素化的单克隆抗-Aβ抗体(200ng/ml)或生物素化的人IgG2(2μg/ml)分别包被预先用重组链霉抗生物素(MicroCoat，Bernried，德国)包被的MTP(微量滴定平板)(100μl/孔，室温下振荡孵育60min)。随后，用含有0.05％(w/v)20的0.9％(w/v)氯化钠溶液将孔洗涤三次。在接下来的步骤中，每孔加入100μl待测定的抗体溶液(培养物上清液)，并在室温下振荡孵育60min。每孔用0.9％(w/v)NaCl/0.05％20洗涤三次步骤后，加入100μl辣根过氧化物酶标记的多克隆绵羊抗-鼠Fcγ抗体的F(ab’)₂片段，并在室温下振荡孵育60min。随后，如上进行了洗涤。最后，每孔加入100μl(RocheDiagnostics GmbH，德国，目录号1684302)。在室温下孵育30min后，在商业微量滴定平板ELISA阅读器中的405和492nm[405/492]测量了消光(光密度OD)。这种筛选导致选择了与单克隆抗-Aβ抗体IgG充分结合以及只呈现出与人IgG低的乃至没有交叉反应性的抗体。将这种选择的抗体进一步接受试验b)。

b)抗独特型抗体的选择

为了从初级筛选a)的抗体的选择中鉴定是抗独特型的那些，进行了以下所述的试验。用含有0.5％BSA级分II的PBS中的生物素化的Aβ肽(250ng/ml)包被预先用重组链霉抗生物素包被的MTP(MicroCoat，Bernried，德国)(100μl/孔，室温下振荡孵育60min)，随后用0.9％(w/v)NaCl/0.05％20洗涤三次。在接下来的步骤中，每孔分别加入50μl地高辛配基标记的单克隆抗-Aβ抗体的Fab片段(2.5-15ng/ml)，50μl PBS(参照信号)，或50μl候选抗体(培养物上清液；试验信号)，并在室温下振荡孵育60min。每孔用0.9％(w/v)NaCl/0.05％20洗涤三次步骤后，加入100μl辣根过氧化物酶标记的多克隆绵羊抗地高辛配基抗体的Fab片段，用于检测结合的人单克隆抗-Aβ抗体-地高辛配基偶联物，并在室温下振荡孵育60min。随后，如上进行了洗涤。最后，每孔加入100μl(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，德国，目录号1684302)。在室温下孵育30min后，在商业微量滴定平板ELISA阅读器中的[405/492]nm测量了消光。选择了与相关参照信号相比呈现出强烈降低的试验信号的抗体作为候选物，用于进一步的使用。

c)具有与人IgG最低交叉反应性的抗体的选择

为了从筛选b)的候选物中鉴定出呈现与人IgG最低交叉反应性的那些，进行了以下所述的试验。用缓冲液中的生物素化的单克隆抗-Aβ抗体IgG(50ng/ml)包被预先用重组链霉抗生物素包被的MTP(MicroCoat，Bernried，德国)(125μl/孔，室温下振荡孵育30min)，随后用0.9％(w/v)NaCl/0.05％20洗涤三次。在接下来的步骤中，每孔加入100μl混合物，该混合物为100μl各自的候选抗体(培养物上清液)，100μl人IgG(浓度高达73mg/ml)和200μl地高辛配基标记的单克隆抗-Aβ抗体-Fab片段，并在室温下振荡孵育60min。每孔用0.9％(w/v)NaCl/0.05％20洗涤三次步骤后，加入100μl辣根过氧化物酶标记的多克隆绵羊抗地高辛配基抗体的Fab片段，并在室温下振荡孵育60min，用于检测结合的单克隆抗-Aβ抗体-Fab-地高辛配基偶联物。随后，如上进行了洗涤。最后，每孔加入100μl(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国，目录号1684302)。在室温下孵育30min后，在商业微量滴定平板ELISA阅读器中的[405/492]nm处测量了消光。选择了与没有加入人IgG相比通过加入人IgG而呈现出最少试验信号损失的抗体用于进一步的使用。

实施例4

针对单克隆抗-Aβ抗体的鼠单克隆抗独特型抗体的纯化

将对抗单克隆抗-Aβ抗体IgG的抗体的发酵上清液浓缩约十倍，并转移至含有20mMTris，1M硫酸铵，pH9.0的缓冲液中，并施加于蛋白A-琼脂糖。将用pH5.5的0.2M柠檬酸钠和0.2M硫酸铵洗脱的洗脱液相对pH7.5的磷酸盐缓冲液进行了透析。通过使用抗牛IgG的固定化抗体的免疫吸附来分离牛IgG(来自发酵液的FCS)的污染物。

实施例5

对抗单克隆抗-Aβ抗体的生物素化抗体的制备

将pH8.5的磷酸盐缓冲液中的对抗单克隆抗-Aβ抗体-IgG的抗体调节至约15mg/ml的蛋白质浓度。将D-生物素-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺溶解于DMSO中，并以1:5的摩尔比加入溶液中。60分钟后，通过加入L-赖氨酸停止了反应，并通过相对pH7.5的含有150mM氯化钠的25mM磷酸钾缓冲液的透析并通过凝胶过滤，除去了剩余的标记试剂。

实施例6

对抗单克隆抗-Aβ抗体的地高辛配基化抗体的制备

将pH8.5的磷酸盐缓冲液中的对抗单克隆抗-Aβ抗体-IgG的抗体调节至约15mg/ml的蛋白质浓度。将地高辛配基3-O-甲羰基-ε-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺溶解于DMSO中，并以1:5的摩尔比加入抗体溶液中。60分钟后，通过加入L-赖氨酸停止了反应，并通过相对pH7.5的含有150mM氯化钠的25mM磷酸钾缓冲液的透析并通过凝胶过滤，除去了剩余的标记试剂。

实施例7

定量单克隆抗-Aβ抗体的试验

ELISA是使用链霉抗生物素微量滴定平板(MTP)来定量测定人血浆中单克隆抗-Aβ抗体的试验。用生物素化和地高辛配基化的对抗单克隆抗-Aβ抗体的独特型的抗独特型抗体(-IgG-Bi和-IgG-Dig)预孵育校准标准品和样品。30min预孵育后，将混合物转移至微量滴定平板。使用与过氧化物酶偶联的绵羊抗-地高辛配基抗体来检测多层结构-ELISA，过氧化物酶催化底物的颜色反应。通过ELISA阅读器来检测信号。在用抗DIG pAb-Fab-POD(pAb＝多克隆抗体)孵育之前和之后，进行了洗涤步骤。所有校准标准品和样品包括10％的人血浆。

实施例8

检测针对单克隆抗-Aβ抗体的抗药物抗体的试验

在第一步中，将生物素化单克隆抗-Aβ抗体与链霉抗生物素包被的微量滴定平板(SA-MTP)的孔偶联(结合)。通过用通用缓冲液洗涤除去了未偶联(未结合)的抗体。此后，孵育孔中的样品和参照标准品(掺入(spiked)5％人血清中的单克隆抗独特型抗-Aβ抗体抗体)。抗抗-Aβ抗体抗体结合到固定的单克隆抗Aβ抗体上。洗掉未结合底物后，用地高辛配基化的单克隆抗-Aβ抗体检测结合的抗抗-Aβ抗体抗体，接着用辣根过氧化物酶标记的抗地高辛配基抗体孵育(参见图1)。抗体-酶偶联物催化了底物的颜色反应。通过ELISA阅读器在405nm处(参照波长：490nm)测量了信号。测定了每个血清样品的吸收值，重复三次。

实施例9

用于定量单克隆抗-Aβ抗体的替换试验

ELISA是使用用包含氨基酸1-40(Aβ(1-40))的淀粉样β蛋白包被的微量滴定平板(MTP)来定量测定人血浆中单克隆抗-Aβ抗体的试验。在包被Aβ(1-40)的微量滴定平板的孔中孵育校准标准品和样品，并使用地高辛配基化的对抗单克隆抗-Aβ抗体的独特型的抗独特型抗体(-IgG-Dig)以及与过氧化物酶偶联的抗-地高辛配基抗体来检测结合Aβ(1-40)包被表面的单克隆抗-Aβ抗体的量，过氧化物酶催化底物的颜色反应。通过ELISA阅读器测量信号。

在所有孵育循环之间进行洗涤步骤。用Aβ(1-40)包被微量滴定平板(MTP)后，需要另外的阻断步骤(使用孵育缓冲液)。所有校准标准品和样品包括10％人血浆。所有孵育步骤在室温下进行。

实施例10

检测中和性针对单克隆抗-Aβ抗体的抗药物抗体的试验

为了分析中和性针对单克隆治疗性抗-Aβ抗体的补体决定区的抗药物抗体，研发了竞争ELISA。用单克隆抗-Aβ抗体-DIG偶联物预先孵育血浆样品或作为标准品的对抗单克隆抗-Aβ抗体的抗独特型抗体。在Aβ-包被的微量滴定平板上捕获剩余的游离单克隆抗-Aβ抗体-DIG偶联物，并用过氧化物酶标记的抗-地高辛配基抗体和随后使用ABTS的颜色反应来检测。

序 列 表

<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司

<120>对抗抗淀粉样β肽的抗体的抗独特型抗体

<130>25344 WO

<150>EP08022235.9

<151>2008-12-22

<160>13

<170>PatentIn版本3.5

<210>1

<211>13

<212>PRT

<213>人造序列

<220>

<223>VH-CDR3

<400>1

Leu Thr His Tyr Ala Arg Tyr Tyr Arg Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210>2

<211>17

<212>PRT

<213>人造序列

<220>

<223>VH-CDR3

<400>2

Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp

1 5 1015

Val

<210>3

<211>15

<212>PRT

<213>人造序列

<220>

<223>VH-CDR3

<400>3

Leu Leu Ser Arg Gly Tyr Asn Gly Tyr Tyr His Lys Phe Asp Val

1 5 1015

<210>4

<211>8

<212>PRT

<213>人造序列

<220>

<223>VL-CDR3

<400>4

Gln Gln Val Tyr Asn Pro Pro Val

1 5

<210>5

<211>8

<212>PRT

<213>人造序列

<220>

<223>VL-CDR3

<400>5

Phe Gln Leu Tyr Ser Asp Pro Phe

1 5

<210>6

<211>8

<212>PRT

<213>人造序列

<220>

<223>VL-CDR3

<400>6

Gln Gln Leu Ser Ser Phe Pro Pro

1 5

<210>7

<211>122

<212>PRT

<213>人造序列

<220>

<223>VH

<400>7

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

202530

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

354045

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

505560

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65707580

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Ala Arg Leu Thr His Tyr Ala Arg Tyr Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>8

<211>126

<212>PRT

<213>人造序列

<220>

<223>VH

<400>8

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

202530

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

354045

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

505560

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65707580

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr

100 105 110

Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210>9

<211>124

<212>PRT

<213>人造序列

<220>

<223>VH

<400>9

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

202530

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

354045

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

505560

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65707580

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Ala Arg Leu Leu Ser Arg Gly Tyr Asn Gly Tyr Tyr His Lys Phe Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>10

<211>110

<212>PRT

<213>人造序列

<220>

<223>VL

<400>10

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 1015

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

202530

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

354045

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

505560

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu

65707580

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Asn Pro Pro

859095

Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110

<210>11

<211>110

<212>PRT

<213>人造序列

<220>

<223>VL

<400>11

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 1015

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

202530

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

354045

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

505560

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu

65707580

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Leu Tyr Ser Asp Pro

859095

Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110

<210>12

<211>110

<212>PRT

<213>人造序列

<220>

<223>VL

<400>12

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 1015

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

202530

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

354045

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

505560

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu

65707580

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Ser Ser Phe Pro

859095

Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110

<210>13

<211>42

<212>PRT

<213>智人（Homo sapiens）

<400>13

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1 5 1015

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

202530

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala

3540