一种能高效生物转化污染土壤中镉形态的微生物菌剂的应用

技术领域

本发明属于微生物治理重金属污染技术领域，具体涉及一种能高效生物转化污染土壤中镉形态的微生物菌剂的应用。

背景技术

随着矿产资源的开发利用，工业生产的迅猛发展和各种化学产品、农药及化肥的广泛使用，含重金属的污染物通过各种途径进入环境，造成土壤污染日益严重。目前我国受Cd、Hg、As、Cr、Pb污染的耕地面积约2000×10⁴hm²，每年因重金属污染而损失的粮食约1000×10⁴t，受污染粮食多达1200×10⁴t，经济损失至少达200×10⁸元。

重金属污染物不能被化学或生物降解，易通过食物链途径在植物、动物和人体内积累，毒性大，对生态环境、食品安全和人体健康构成严重威胁。因此，农田土壤重金属污染己成为当前日益严重的环境问题，其污染来源和修复技术也一直是国内外研究的热点和难点。由于传统的物理化学方法的局限性，土壤重金属修复越来越偏向于生物修复，其中植物修复比较普遍，但高富集植物的驯化培养以及生长周期长等因素限制了植物修复的发展，微生物转化技术以其经济高效的优势突显出来。例如，李洁等人通过将1％的黑曲霉菌接种在1.5％的土浆浓度中进行生物浸出，在11天时达到最大浸出率67.4％。再如，张静霞等人利用自养菌和异养菌混合浸出湘江底泥时，以10％的菌种接种到5％的土浆浓度中，在48天时达到浸出率84.4％。与本发明的微生物菌剂相比，他们面临浸出率低，以及时间周期长等关键问题。

矿山废水微生物早已广泛应用于冶金工业中，而很少将其独特的功能在治理土壤中的重金属元素中展现出来，主要是由于土壤体系十分复杂，有机物含量丰富，浸矿微生物难以存活。同时，由于浸矿微生物生长周期较长，生长条件较为苛刻，复配出一种可以快速生长，条件简单易控且能高效转化土壤中镉形态的微生物菌剂十分必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种微生物复合功能菌剂的应用，该复合功能菌剂能将污染土壤中难利用镉高效转化成可溶态，实现快速，有效治理镉污染的目的。

一种能高效生物转化土壤中镉形态的微生物菌剂：该微生物菌剂主要包括以下菌种：产朊假丝酵母(Candida utilis)、申克孢子丝菌(Sporothrix sp.)、氧化亚铁嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、嗜酸硫杆菌(Sulfobacillus acidophilus)、异化铁还原菌(Shewanella oneidensis)；这些菌混合前分别在含镉的培养基中进行了驯化。

进一步的优选，该微生物菌剂主要包括以下数量比例的菌混合而成：25～35％产朊假丝酵母菌(Candida utilis)、15～20％申克孢子丝菌(Sporothrix sp.)、15～20％氧化亚铁嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、15～20％嗜酸硫杆菌(Sulfobacillus acidophilus)、5～15％异化铁还原菌(Shewanella oneidensis)；这些菌混合前分别在含镉的培养基中进行了驯化。

所述的能高效生物转化土壤中镉形态的微生物菌剂的菌种的驯化过程如下：设置镉的浓度梯度为1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L；培养基其它成分为：9K培养基+0.01～0.5％酵母膏(m/v)+0.01％～0.5％葡萄糖(m/v)+0.01～0.5％％硫粉(m/v)；培养条件为:温度20～30℃，转速150～200r/min，产朊假丝酵母菌和申克孢子丝菌的初始pH为4.0，氧化亚铁嗜酸硫杆菌、嗜酸硫杆菌和异化铁还原菌的初始pH为2.0。首先分别将活化的5种菌浓达到5.0x10⁷个/mL以上的菌液以8-12％(v/v)的接种量接种到100mL含1mg/LCdSO₄的培养基中，驯化培养2-10天后再以8-12％体积的接种量接种到下一个镉的浓度梯度培养基中，直到最终镉浓度达到25mg/L。

所述的能高效生物转化土壤中镉形态的微生物菌剂的配方来源以下过程：

通过将长期受到高浓度镉污染的农田土壤和富含镉的铅锌矿坑废水富集物接种到富集培养基中，振荡培养后，将培养物转接到新鲜的富集培养基中，继续振荡培养，经过5～10次转接培养后获得高效生物转化土壤中镉形态的微生物菌剂。

所述的长期受到高浓度镉污染的农田土壤来自于湖南省衡阳大浦镇矿区污染农田土壤，污染年限长达40年，镉含量高达100ppm；矿坑废水来自于湖南省郴州市柿竹园铅锌矿区，镉含量高达20ppm。

采集长期受到高浓度镉污染的土壤样品，以2～10％(v/v)的比例接种到富集培养基中。

采集富含镉的铅锌矿坑废水，以5～20％的(v/v)比例接种于9K培养基中，在初始pH1.8～2.5，温度20～30℃，转速150～200r/min条件下培养2～10天，直到菌浓达到4x10⁸个/mL以上，然后以5～20％(v/v)的比例转接到新鲜的9K培养基中，继续培养，经过5～10次转接培养后获得富含镉的铅锌矿坑废水富集物，然后以2～10％(v/v)接种到富集培养基中。

富集培养基组成如下：9K培养基+0.01～0.5％酵母膏(m/v)+0.01％～0.5％葡萄糖(m/v)+0.01～0.5％％硫粉(m/v)。所述的9K培养基成分如下：蒸馏水1000mL，3g/L的(NH₄)₂SO₄，0.5g/L的K₂HPO₄，0.1g/L的KCl，0.01g/L的Ca(NO₃)₂，0.5g/L的MgSO₄·7H₂O。配制时，首先在9K培养基中加入0.01～0.5％酵母膏，同时配入0.01％～0.5％的葡萄糖溶液，在115～121℃高压灭菌15～30分钟，然后称取0.01～0.5％硫粉进行紫外灭菌15-30min后加入。

所述微生物菌剂的富集培养条件为：初始pH4.0～6.0，温度20～35℃，转速150～200r/min条件下富集培养2～10天，传代培养8次以上，每次以8-12％(v/v)接种浓度接种于新鲜的富集培养基中进行培养。

最终得到的微生物菌剂pH为1.0～1.7，菌浓为1.0x10⁹～4.0x10⁹个/mL。

采用上述方法得到的微生物菌剂进行Miseq测序，能够得到主要的微生物种类和相对丰度，然后根据测定结果进行本发明菌群的复配，得到功能统一的微生物菌剂。

本发明菌剂使用时，将其稀释至浓度为4.0x10⁷～8.0x10⁷个/mL，将稀释后的菌剂加入到镉污染土壤中，控制土壤质量:稀释菌剂体积＝(0.05～1.0)kg:1L，搅拌处理2～96h。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明通过将镉污染土壤中具有镉转化功能的微生物和铅锌矿坑废水中的浸矿微生物富集物结合起来生成微生物菌剂，然后通过Miseq测序得到主要的微生物种类和数量，然后复配得到功能统一的微生物菌剂；不仅突破了传统物理和化学方法面临的处理周期长，成本高，不能从根本上减少土壤中镉含量等缺点，也打破了植物和动物富集法所面临的生长周期长，不易存活等限制因素，本发明所述的微生物菌剂具有培养周期短，成本低，操作简单易控，能有效将难利用镉转化成可溶态，加速镉溶出到溶液中来等优势，在土壤重金属镉修复方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是实施例1得到的微生物菌剂的生长曲线；

图2是实施例1得到的微生物菌剂的pH值变化曲线。

具体实施方式

实施例1：微生物菌剂的采集、培养和驯化

培养基配制：9K培养基+0.1％酵母膏+0.1％葡萄糖+0.1％硫粉。9K培养基成分如下：蒸馏水1000mL，(NH₄)₂SO₄3g/L，K₂HPO₄0.5g/L，KCl0.1g/L，Ca(NO₃)₂0.01g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L。首先在9K培养基中加上0.1％酵母膏，调节pH4.0，同时配制5％的葡萄糖溶液，在121℃高压灭菌20分钟，然后称取0.1％硫粉进行紫外灭菌20min后加入。

底泥采集于湖南省衡阳大浦镇矿区污染农田土壤，污染年限长达40年，镉含量高达100ppm。利用五点采样法采集5～10cm深的长期受到高浓度镉污染的土壤样品，混匀后作为制备微生物菌剂的底泥，以5％的比例接种到富集培养基中。

铅锌矿坑废水富集物的制备包括如下步骤：采集富含镉的铅锌矿坑废水，以15％的比例接种于9K培养基中，在初始pH2.0，温度30℃，转速180r/min条件下富集培养5～7天，直到菌浓达到4x10⁸个/mL以上，然后以10％的比例转接到新鲜的9K培养基中，继续培养，经过6次富集培养后获得铅锌矿坑废水富集物，然后以5％的比例接种到富集培养基中。

将富集培养基高温灭菌后，加入5％的底泥和5％的矿坑废水富集物，在30℃，转速180r/min条件下富集培养7～10天。当菌浓达到4.0x10⁸个/mL以上后，以10％的接种浓度接种于新鲜的富集培养基中进行培养5～10天，经过8次传代培养后，获得生长周期基本稳定在72h左右，pH>9～4.0x10⁹个/mL的微生物菌剂。选取第1代、第6代、第8代富集物进行Miseq测序，结果表明：第1代富集物主要由：42％产朊假丝酵母(Candidautilis)、15％单胞瓶霉属真菌(Phialemonium>

实施例2：本发明微生物菌剂的复配

根据实施例1测序的结果，按照以下数量比例的菌混合而成：25～35％产朊假丝酵母菌(Candida utilis)、15～20％申克孢子丝菌(Sporothrix sp.)、15～20％氧化亚铁嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、15～20％嗜酸硫杆菌(Sulfobacillusacidophilus)、5～15％异化铁还原菌(Shewanella oneidensis)；这些菌混合前分别在含镉的培养基中进行了驯化。

菌种的驯化过程如下：设置镉的浓度梯度为1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L；培养基成分为：9K培养基+0.01～0.5％酵母膏(m/v)+0.01％～0.5％葡萄糖(m/v)+0.01～0.5％％硫粉(m/v)；培养条件为:温度20～30℃，转速150～200r/min，产朊假丝酵母菌和申克孢子丝菌的初始pH为4.0，氧化亚铁嗜酸硫杆菌、嗜酸硫杆菌和异化铁还原菌的初始pH为2.0。首先分别将活化的5种菌浓达到5.0x10⁷个/mL以上的菌液以8-12％(v/v)的接种量接种到100mL含1mg/L>4的培养基中，驯化培养2-10天后再以8-12％体积的接种量接种到下一个镉的浓度梯度培养基中，直到最终镉浓度达到25mg/L。

表1三个组合的菌剂配方

实施例3：微生物菌剂生物去除污染土壤中的镉

镉污染土壤采自于湖南省衡阳大浦镇矿区污染农田土壤，编号A、B、C。将土壤风干后磨碎过100目筛，然后分别称取20g样品到干净小三角瓶中，封装灭菌。实验所用菌剂包括：实施例2所得微生物菌剂a、实施例1的矿山废水富集物b、直接由镉污染土壤通过实施例1得到矿山废水富集物相同方法富集得到的土壤富集物c、实施例1中将5％矿山废水富集物和5％的底泥混合培养后的第1代富集物d。

实验设计：反应体系为200mL富集培养基，初始pH4.0。每个样品设置7个实验组，每个实验组都加入10％的污染土壤样品，其中三个平行实验组接种10％的a(Exp.)，一个接种10％的b(KK)，一个接种10％的c(SK)，一个接种10％的d(DK),一个不加菌(CK)，在30℃，180r/min条件下振荡5天。每天测定pH，5天后离心收渣，将残渣风干过100目筛，测定土壤中镉含量，结果如表2所示。

结果表明：实施例2制备的微生物菌剂的镉去除率显著优于其他各组的效果。

表2实施例3中镉的去除率