一种人体细胞瓦博格效应简易检测试剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种人体细胞瓦博格效应简易检测试剂及其制备方法和应用，属于医学检验领域。

背景技术

随着人们生活质量的提高，癌症的发病率逐年增加。近几年来，全球新增的恶性肿瘤病例逐年上升，每年全球因恶性肿瘤死亡的人数将近千万人。结直肠癌、体表恶性肿瘤及口腔癌是近年危害较大、发病率比较高且治愈较为困难的几种癌症。

全球每年新发结直肠癌病人高达93万，在我国每年新发病例高达13-16万人，在消化道肿瘤中结直肠癌的发病率仅次于胃癌；在我国目前结直肠癌患病率已经高达46.8/10万；已经成为中国三大癌症之一。但是大部分患者发现时已是晚期，失去了最佳的治疗时机，导致结直肠癌患者确诊后5年生存率很低；在我国每5分钟就有1人死于结直肠癌。以往结直肠癌的筛查方法主要有肛门指捡和大便隐血试验。此方法简便易行，但前者阳性征象出现较晚，后者缺乏特异性。血清癌胚抗原（CEA）检查亦不具有特异性的诊断价值，不适合作为普查或早期诊断。内镜检查、直肠内超声显象、双重对比造影、CT和磁共振检查都不能作为早期诊断的方法。

体表恶性肿瘤泛指位居身体表面的恶性肿瘤，含皮肤恶性肿瘤、会阴癌等。皮肤恶性肿瘤，根据肿瘤细胞的来源不同而有不同的命名，包括表皮、皮肤附属器、皮肤软组织、周围神经、黑素细胞、皮肤淋巴网状组织和造血组织等。外阴部恶性肿瘤女性以外阴癌和阴道癌为多；男性主要是阴茎癌。体表恶性肿瘤的诊断主要应用细胞学检查。目前临床尚无便捷、快速、无创、经济、准确的简易诊断方法。

相比其他部位的癌症，口腔癌更易转移、治疗花费大、预后差，目前只有60%的口腔癌患者能活到5年以上（5年生存率在60%左右），严重威胁着人们的健康，甚至生命。因此，口腔癌的预防就显得十分重要，从早期发现入手，口腔癌是可以预防的。既往口腔癌的筛查方法主要依赖肿瘤标志物癌胚抗原（CEA）检查，但特异性很差。CT检查和细胞学检查不适于筛查或早期诊断。

研究发现，人体细胞在癌变早期会出现糖代谢异常，癌细胞的耗糖量是正常细胞的十倍，但是其产生的能量只是正常细胞的十分之一，而且磷酸戊糖途径代谢模式活跃，这种异常称为瓦博格效应。目前，癌症细胞的瓦博格效应可由PET-CT（正电子发射计算机断层显像）检测获得。但是，PET-CT运营成本相当高，全身检查一次，辐射量相当于一个正常人30年的辐射在一小时内接受。因此，开发新的能够简便准确检测早期癌变细胞的试剂具有重要现实意义。

发明内容

为解决PET-CT运营成本高、对人体有较重的辐射危害及无简便筛查检测早期癌变细胞试剂的问题，本发明提供了一种可快速准确对人体细胞瓦博格效应进行简易检测的试剂。

本发明的另一目的是提供一种人体细胞瓦博格效应简易检测试剂的制备方法。

本发明的再一目的是提供一种体细胞瓦博格效应简易检测试剂在检测体细胞瓦博格效应的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种人体细胞瓦博格效应的简易检测试剂，由试剂A、试剂B、试剂C和试剂D组成；

其中，

试剂A为4-6 %w.t的枯草杆菌蛋白酶等渗溶液；

试剂B为pH 3.6-6.0的醋酸盐缓冲液；

试剂C由0.1 g/L-0.25 g/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液、1.0 mL/L-2.5 mL/L的6-甲氧基喹啉溶液和2-5mL/L的过氧化羟基异丙苯溶液组成

试剂D由0.03-0.07 %w.t甲苯胺蓝O溶液、2.5-7.5 mL/L的曲拉通X-100溶液组成。

所述试剂A、试剂B、试剂C和试剂D的体积比为2:1:1:1。

所述人体细胞采集部位包括结肠粘膜、皮肤、外阴、口腔粘膜。

作为优选，

所述试剂A枯草杆菌蛋白酶的浓度为5 %w.t；

所述试剂B醋酸盐缓冲液的浓度为2 mol/L，pH为5.0；

所述试剂C的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺浓度为0.15 g/L，6-甲氧基喹啉浓度为1.25mL/L，过氧化羟基异丙苯浓度为2.5 mL/L；

所述试剂D的甲苯胺蓝O浓度为0.05 %w.t，曲拉通X-100浓度为 5 mL/L。

一种上述简易检测试剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）试剂A的制作：

将枯草杆菌蛋白酶加入等渗溶液中溶解即得试剂A；

（2）试剂B的制作：

a）将醋酸钠与冰醋酸分别溶解于纯净水中；

b）将两种溶液混匀即试剂B；

（3）试剂C的制作：

a）将3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶于少量无水乙醇中；

b）将过氧化羟基异丙苯和6-甲氧基喹啉依次加入上述a）溶液中溶解；

c）纯净水定容，即得试剂C；

（4）试剂D的制作：

a）甲苯胺蓝O溶于纯净水；

b）曲拉通X-100加入上述a）溶液中溶解，即得试剂D。

所述无水乙醇与试剂C的体积百分比为30%。

一种上述简易检测试剂在检测人体细胞瓦博格效应的应用，包括以下步骤：

（1）将人体细胞置于试剂A中制成样本液；

（2）将上述样本液离心；

（3）取步骤（2）的上清液，先加入试剂B混匀，再加入试剂C以比色法测定细胞游离原血红素含量：若不变色为阴性，浅蓝色为弱阳性，蓝色为阳性，深蓝色为强阳性；

（4）取步骤（2）的沉淀物，加入试剂D以比色法测定体脱落细胞的活性氧含量：若不变色（蓝色）为阴性，蓝色变为浅蓝色为阳性，变为无色为强阳性。

本发明简易检测试剂的工作原理如下：

1. 人体细胞的溶解：体细胞悬浮于预处理液（试剂A）中成为细胞悬液，细胞膜部分成分被枯草杆菌蛋白酶分解，细胞膜解离，含有细胞游离原血红素的细胞内物质溶解于预处理液中，而产生细胞内活性氧的细胞器悬浮于预处理液中，通过离心将细胞器及其他细胞残渣沉淀。

2. 细胞游离原血红素的测试原理：细胞游离原血红素具有类似过氧化物酶的作用，具备水解过氧化物（如过氧化羟基异丙苯）的能力。细胞游离原血红素与过氧化物反应，夺取过氧化物的氧原子，并与氧原子结合；但是与氧原子结合的细胞游离原血红素极不稳定，迅即又脱掉氧原子传递给供氢体四甲基联苯胺，使原本不含发色集团的供氢体3,3’,5,5’-四甲基联苯胺脱氢，生成含发色集团醌基的蓝色物质联苯胺蓝。样本内若不含有细胞游离原血红素，则无联苯胺蓝生成，因之不显色；样本内若含有细胞游离原血红素，则有联苯胺蓝生成，反应液逐渐呈现蓝色。显色的深浅与样本内含有的细胞游离原血红素成正比。如此，观察反应液的颜色即可测及样本内细胞游离原血红素的含量。

3. 活性氧测定原理：细胞Fenton反应是线粒体内的过氧化氢与二价铁离子反应产生三价铁离子、羟基和羟自由基的反应。羟自由基是一种氧化能力很强的自由基，它很容易氧化各种有机物和无机物，氧化效率高，反应速率快。羟自由基与甲苯胺蓝O发生氧化反应，使甲苯胺蓝O的颜色发生变化，从而间接地测知羟自由基的含量。样本内若含有细胞羟自由基，则甲苯胺蓝O被氧化，反应液的颜色变淡，颜色的深浅与样本内含有的细胞羟自由基成正比。如此，观察反应液的颜色即可测及样本内细胞羟自由基的含量。

本发明具有以下优点：

本发明的体细胞瓦博格效应的简易检测试剂可准确、方便、快速地检测细胞游离原血红素含量和细胞的活性氧含量，以定性方法检测体细胞糖代谢的瓦博格效应。本发明试剂稳定性好，在常温干燥环境下可以稳定保存两年以上。本体细胞瓦博格效应简易检测试剂敏感度高，特异性好，符合筛查试剂的要求，适合于做大数据人群的体癌筛查。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1试剂制备

（1）试剂A的制作：

将5.00 g枯草杆菌蛋白酶加入至100mL 0.9 % NaCl等渗溶液中溶解，得试剂A；

（2）试剂B的制作：

a）将82g醋酸钠溶于1000mL水中，得2 mol/L醋酸钠溶液；将15g冰醋酸溶于200mL水中，得2 mol/L醋酸溶液；

b）将上述溶液按5:1比例混匀，即得试剂B。

（3）试剂C的制作：

a）将0.15 g 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶于30 mL无水乙醇中；

b）将0.25 mL过氧化羟基异丙苯和0.125 mL 6-甲氧基喹啉依次加入上述a）溶液中溶解；

c）纯净水定容至100mL，即得试剂C；

（4）试剂D的制作：

a）将0.05 g甲苯胺蓝O溶于100 mL纯净水；

b）将0.5 mL曲拉通X-100加入上述a）溶液中溶解，即得试剂D。

实施例2试剂的使用方法

（1）用细胞刷轻轻刷取体上皮脱落细胞，然后将细胞刷置于2mL试剂A中轻轻搅动，制成样本液；

（2）将上述样本液3000转/分钟高速离心3min；

（3）取步骤（2）的上清液，先加入1mL试剂B混匀，再加入1mL试剂C，在3分钟时观察反应液的颜色，由此显示测定细胞游离原血红素含量：若不变色为阴性，浅蓝色为弱阳性，蓝色为阳性，深蓝色为强阳性；

（4）取1mL试剂D加入步骤（2）的沉淀物，在3分钟时观察反应液的颜色，由此显示测定细胞活性氧的含量：若不变色（蓝色）为阴性，蓝色变为浅蓝色为阳性，变为无色为强阳性；

结果判定：上述两种检测中均为阳性则该样本细胞瓦博格效应阳性，显示存在癌症的可能性；其一为阳性则该样本细胞瓦博格效应可疑阳性，显示存在癌症的风险；均为阴性则该样本细胞瓦博格效应阴性，显示尚无体癌的风险。

实施例3临床验证

从人体不同部位采集细胞样本，按实施例2操作进行并判断结果。对试剂敏感度与特异度及约登指数进行计算，通过下式计算约登指数：

3.1标本来源

结肠粘膜细胞：某医疗单位肛肠科收纳的结直肠癌病人结肠粘膜上皮脱落细胞样本118份。结直肠癌均经病理学检查确诊。同一医疗单位普通外科收纳的非结直肠癌病人结肠粘膜上皮脱落细胞样本100份。非结直肠癌均经细胞学检查排除结直肠癌。

体表细胞：某医疗单位皮肤科、妇瘤科、泌尿外科收纳的体表恶性肿瘤病人体表脱落细胞样本117份。其中，阴茎癌22份、阴道癌17份、外阴癌14份、基底细胞癌14份、鳞状细胞癌21份、湿疹样癌6份、恶性黑色素瘤5份、其它体表恶性肿瘤18份。以上体表恶性肿瘤均均经病理学检查确诊。同一医疗单位皮肤科、妇瘤科、泌尿外科收纳的体表非癌病人体表脱落细胞样本100份。非体表癌均经细胞学检查排除体表恶性肿瘤。

口腔粘膜细胞：某医疗单位口腔科收纳的口腔癌病人口腔粘膜脱落细胞样本82份，其中口底癌34份、唇癌22份、牙龈癌17份、舌癌5份、其它癌种4份。口腔癌均经病理学检查确诊。同一医疗单位口腔科门诊非口腔癌病人口腔粘膜脱落细胞样本100份。非口腔癌均经细胞学检查排除口腔癌。

表1试剂对结肠粘膜细胞的敏感度

表2试剂对结肠粘膜细胞的特异度

表3试剂对体表细胞的敏感度

表4试剂对体表细胞的特异度

表5试剂对口腔粘膜细胞的敏感度

表6试剂对口腔粘膜细胞的特异度

表7试剂对三种细胞的约登指数

由上述数据可知，本人体细胞瓦博格效应简易检测试剂对结肠粘膜细胞、体表细胞、口腔粘膜细胞的细胞游离原血红素检测敏感度高，细胞活性氧检测特异度高，二者联合 检测能够相互印证，具有良好的诊断符合率。本结直肠细胞瓦博格效应简易检测试剂符合筛查试剂的要求，适合于做大数据人群的结直肠癌筛查。