一种共表达热激蛋白提高外源蛋白表达量的方法

技术领域

本发明涉及一种共表达热激蛋白提高外源蛋白表达量的方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

毕赤酵母(Komagataella phaffii，K.phaffii，原命名为Pichia pastoris)是重要的蛋白表达平台微生物，能以甲醇或者甘油作为单一的碳源和能源，其中甲醇可作为诱导剂，诱导醇氧化酶(AOX1)启动子。毕赤酵母表达系统和其它蛋白表达系统相比较，具备如下优势：具有强诱导性和强启动性启动子，利于外源基因高效表达；蛋白质加工折叠和翻译后修饰的作用，使外源蛋白的结构与天然蛋白相似，从而表现出一定的生物活性；上清液中内源蛋白分泌量非常少，有利于表达产物的分离纯化；外源基因与毕赤酵母染色体通过基因重组的方式整合，避免了外源基因的丢失，为外源蛋白插入酵母并稳定传代提供了可能。

提高毕赤酵母外源蛋白的表达量是当前微生物研究的重要课题之一，在工业中毕赤酵母中高效表达外源蛋白具有相当高的应用价值。毕赤酵母基因组序列的解读，有利于根据高产蛋白的特定属性来改良菌株品系。目前已有多种外源蛋白在毕赤酵母中取得较好的表达效果。

迄今大多数研究都集中在优化发酵条件，建立发酵条件与外源蛋白产量之间关系。但是这种简单的对应关系，未能明确发酵菌株与蛋白产量之间联系的依据。

此外，利用毕赤酵母生产具有较高酶活性的蛋白还面临一些难题，比如，虽高蛋白表达量，酶活性较低。有研究报道利用伴侣蛋白来促进外源蛋白的折叠，从而提高蛋白的表达水平，以及比活力。如Smit等通过共表达KAR2的方式提高了酿酒酵母中葡萄糖苷酶的表达量；卢鑫等在毕赤酵母中共表达伴侣蛋白(PDI和ERO1)提高了米根霉脂肪酶的产量；沙冲等进一步研究发现同时共表达伴侣蛋白PDI和ERO1，多种伴侣蛋白通过协同作用，可较大程度提高外源蛋白的活力。另有研究报道，共表达伴侣蛋白并不能提高外源蛋白的表达水平，在有些情况下反而使得外源蛋白的表达水平降低，如当在酿酒酵母中共表达Scj1时，外源蛋白人白蛋白的表达水平降低了60％(ANTIOXIDANTS&REDOX SIGNALING,2014,21:414-437)。

目前仅仅局限在利用少数几种伴侣蛋白进行共表达来提高外源蛋白的表达量，急需在研究毕赤酵母高效表达机制的基础上开发其他新型的能够促进外源蛋白表达的因子。

发明内容

本发明提供了一种提高毕赤酵母中外源蛋白表达量的方法，所述方法是在表达外源目的蛋白的同时过表达热激蛋白STI1、FES1、CPR6中的任意一种或者多种。

在一种实施方式中，所述热激蛋白STI1、FES1、CPR6是来源于毕赤酵母的热激蛋白。

在一种实施方式中，所述热激蛋白STI1、FES1、CPR6的氨基酸序列分别如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示。

在一种实施方式中，所述外源目的蛋白可以是磷脂酶、脯氨酰内肽酶、脂肪酶、蛋白酶、糖化酶等。

在一种实施方式中，所述方法是在同一宿主中表达外源蛋白和所述热激蛋白。

在一种实施方式中，所述宿主为毕赤酵母。

本发明的第二个目的是提供一种外源蛋白表达量提高的毕赤酵母重组菌，所述毕赤酵母重组菌在表达外源目的蛋白的基础上，还同时过表达了热激蛋白STI1、FES1、CPR6中的任意一种或者多种。

在一种实施方式中，所述表达热激蛋白STI1、FES1、CPR6的氨基酸序列分别如SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示。

在一种实施方式中，所述外源目的蛋白可以是磷脂酶、脯氨酰内肽酶、脂肪酶、蛋白酶、糖化酶等。

在一种实施方式中，所述外源目的蛋白为紫红链霉菌磷脂酶A₂。

在一种实施方式中，所述毕赤酵母重组菌是以毕赤酵母GS115、X33、KM71、KM71H、SMD1168、SMD1163等中的任意一种为宿主菌构建得到的。

在一种实施方式中，所述毕赤酵母重组菌是以pPIC9K、pPICZA/B/C、pPIC9K-His、pPIC3.5K、pPICZalphaA/B/C、pGAPZalpha、pAO815、pHIL-S1、pPink hc等中的任意一种为质粒载体构建得到的。

本发明的第三个目的是提供所述毕赤酵母重组菌的应用。

在一种实施方式中，所述应用是应用于食品、酿造、造纸、制革、制糖、化工等领域，更具体地，是应用于食品与酿造领域。

本发明的优点和效果：

本发明通过在表达外源目的蛋白的同时过表达热激蛋白STI1、FES1、CPR6，显著提高了外源目的蛋白的表达量。

附图说明

图1为共表达热激蛋白和磷脂酶的重组菌株的摇瓶发酵菌体浓度生长曲线；

图2为共表达热激蛋白和磷脂酶的重组菌株的摇瓶发酵菌体浓度生长曲线；

图3为共表达热激蛋白相关基因菌株的摇瓶发酵蛋白浓度曲线；

图4为共表达热激蛋白相关基因菌株的摇瓶发酵蛋白浓度曲线；

图5为共表达热激蛋白相关基因菌株的摇瓶发酵上清液酶活曲线；

图6为共表达热激蛋白相关基因菌株的摇瓶发酵上清液酶活曲线；

图7为共表达热激蛋白产脯氨酰内肽酶的重组菌菌体生长曲线；

图8为共表达热激蛋白产脯氨酰内肽酶的重组菌产蛋白浓度曲线；

图9为共表达热激蛋白产脯氨酰内肽酶的重组菌的脯氨酰内肽酶酶活曲线。

具体实施方案

(1)生物量测定

采用细胞干重(DCW)表示。取样后置于离心机中离心(12000r·min^-1，6min)，将菌体保留，加生理盐水悬浮菌体，重复离心去上清，然后放置在90℃烘箱中烘干得细胞干重。

(2)蛋白含量测定

利用考马斯亮蓝法测定发酵液上清中总蛋白浓度。取上述发酵上清液，测定595nm波长下测吸光度，每组设置三个平行，计算上清液中总蛋白浓度。

(3)磷脂酶活力测定

使用sPLA2 Assay Kit测定磷脂酶A₂酶活力，方法步骤见说明书。

(4)脯氨酰内肽酶酶活力测定方法

具体操作步骤见文献(Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2016,125:81-87)。酶活计算公式为：

其中，U·mL^-1：酶活力单位；ΔA：反应体系吸光度变化；V：总反应体系(mL)；v：发酵液体积(mL)；γ：摩尔消光系数(cm²·mol^-1)；β：比色杯光程(cm)。

下面是对本发明进行具体描述。

实施例1：共表达热激蛋白相关基因菌株的构建

以小分子量蛋白磷脂酶(21KD)以及大分子量蛋白脯氨酰内肽酶(66KD)两种蛋白作为外源目的蛋白表达对象，构建共表达热激蛋白相关基因的重组菌株。

具体是：

(1)利用PCR方法获取毕赤酵母中热激蛋白(STI1，FES1，CPR6和SSA1)的基因序列(核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示)，并在序列两端添加酶切位点。以pPICZA为载体，使用限制性内切酶酶AsuII和NotI，酶切上述基因和载体。利用T4 DNA连接酶链接目的基因和载体，转化至DH5α感受态细胞，筛选验证获得重组质粒。

(2)将上述构建的重组质粒用限制性内切酶Sac I或Pme I酶切线性化，胶回收目的片段，分别电转感受态细胞(毕赤酵母K.phaffii GS115/pPIC9K-MLMH、GS115/pPIC9K-PLA2-1和GS115/pPIC9K-PLA2-12感受态细胞)，培养并验证阳性菌株，得到了如表1所示的毕赤酵母重组菌。

其中，表达紫红链霉菌磷脂酶A₂的毕赤酵母菌株K.phaffii>

表1共表达热激蛋白和外源目的蛋白的毕赤酵母重组菌列表

实施例2：

以小分子量蛋白磷脂酶(21KD)以及大分子量蛋白脯氨酰内肽酶(66KD)两种蛋白作为外源目的蛋白表达对象，分析含有热激蛋白相关基因的重组菌株对外源目的蛋白表达的影响。

其中毕赤酵母摇瓶发酵方法如下：

将甘油管保藏菌株用平板划线法培养，30℃培养3–5d。挑取单克隆至BMGY培养基中，在30℃200r·min^-1条件下培养16h–18h至OD₆₀₀达到2–6。将菌液在无菌条件下转移至无菌的离心管中，在6000r·min^-1条件下离心10min，弃掉上清收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体，28℃250r·min^-1条件下培养，每24h添加1％的甲醇诱导表达，定时取样测定发酵液的菌体浓度和发酵上清液的蛋白浓度。

(1)产磷脂酶重组菌株共表达热激蛋白相关基因的摇瓶发酵结果

将构建的共表达热激蛋白菌株(表1)与出发菌株(GS115/pPIC9K-PLA-1和GS115/pPIC9K-PLA-12)进行摇瓶发酵。结果显示，在96h发酵周期内，菌株的菌体浓度(OD₆₀₀)几乎完全一致，各菌株的生长趋势基本一致，不同共表达菌株间没有明显差异，OD600都在72h达到最大值，然后开始下降。由此可见，共表达蛋白对菌株生长没有明显影响(图1～图2)。

摇瓶发酵结果表明，在84h时共表达热激蛋白菌株的胞外总蛋白浓度都达到最大值。共表达同一热激蛋白相关基因，含有高拷贝磷脂酶基因的菌株发酵胞外总蛋白浓度及胞外磷脂酶活力高于低拷贝菌株(图3～图6)。共表达热激蛋白对含有不同拷贝数磷脂酶基因菌株的影响趋势一致，其中提高胞外磷脂酶活力倍数最大的是STI1，达到1.51倍，然后依次是FES1，SSA1和CPR6。

从图5中可以看出，共表达STI1、FES1、SSA1、CPR6和1拷贝磷脂酶基因的重组菌在发酵84h下达到的酶活分别为0.63U·L^-1、0.58U·L^-1、0.52U·L^-1、0.45U·L^-1，相比对照菌株GS115/pPIC9K-PLA-1，分别提高了1.51倍、1.39倍、1.24倍、1.08倍。

从图6中可以看出，共表达STI1、FES1、SSA1、CPR6和12拷贝磷脂酶基因的重组菌在发酵84h下达到的酶活分别为0.67U·L^-1、0.64U·L^-1、0.57U·L^-1、0.56U·L^-1，相比对照菌株GS115/pPIC9K-PLA-12，分别提高了1.24倍、1.19倍、1.05倍、1.04倍。

(2)产脯氨酰内肽酶重组菌株共表达热激蛋白相关基因摇瓶发酵

以表达脯氨酰内肽酶基因的毕赤酵母作为对照菌株，分析共表达热激蛋白对其的影响，结果如图7、图8、图9所示。

如图7、图8所示，共表达菌株与对照菌株(K.phaffii GS115/pPIC9K-MLMH)菌体浓度(OD₆₀₀)生长趋势相似。当发酵96h时，共表达FES1使得胞外总蛋白浓度由0.20g·L^-1提升至0.26g·L^-1，而SSA1、CPR6、STI1菌株，胞外总蛋白浓度依次是0.25g·L^-1、0.24g·L^-1、0.23g·L^-1。上述共表达基因FES1、SSA1、CPR6、TI1的重组菌，与对照相比，胞外总蛋白浓度分别提高了1.30倍、1.25倍、1.20倍、1.15倍。

如图9所示，共表达热激蛋白也同样能够提高脯氨酰内肽酶的表达水平，提高程度依次是FES1，SSA1，CPR6和STI1。当发酵96h时，共表达菌株的酶活达到了最高。共表达菌株FES1、CPR6、SSA1、STI1的酶活分别为210U·L^-1、195U·L^-1、190U·L^-1、185U·L^-1，与对照菌GS115/pPIC9K-MLMH的酶175U·L^-1相比，分别提高了1.20倍、1.11倍、1.09倍、1.06倍。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种共表达热激蛋白提高外源蛋白表达量的方法

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 572

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Ser Glu Glu Phe Lys Ala Gln Gly Asn Gln Ala Phe Gln Ala

1 5 1015

Lys Asp Tyr Glu Lys Ala Val Ser Phe Phe Thr Gln Ala Ile Glu Ala

202530

Ser Pro Thr Pro Asn His Ile Leu Phe Ser Asn Arg Ser Ala Ala Tyr

354045

Ala Ser Leu Gly Gln Tyr Gln Asp Ala Leu Asp Asp Ala Asn Lys Cys

505560

Val Glu Ile Asn Gly Ser Trp Ala Lys Gly Tyr Asn Arg Val Gly Ala

65707580

Ala His Tyr Gly Arg Gly Glu Trp Asp Glu Ala His Lys Ala Tyr Ser

859095

Lys Ala Leu Glu Leu Asp Pro Ala Asn Lys Met Ala Lys Glu Gly Leu

100 105 110

Asn Glu Thr Glu Ile Ala Arg Asp Ala Gly Asn Asp Val Lys Asn Ile

115 120 125

Phe Ser Asp Ala Gly Met Val Glu Lys Leu Lys Lys Asn Pro Lys Thr

130 135 140

Ala Glu Leu Met Lys Asp Pro Glu Leu Val Ala Lys Val Gln Lys Leu

145 150 155 160

Gln Thr Asp Pro Lys Ser Met Ser Gln Glu Leu Phe Ser Asp Pro Arg

165 170 175

Leu Met Thr Val Met Gly Ala Met Leu Gly Val Asp Leu Gly Val Gln

180 185 190

Pro Ser Gln Gln Ser Ala Pro Gln Glu Asp Thr Pro Val Pro Asp Ala

195 200 205

Tyr Pro Glu Pro Ser Ser Lys Pro Glu Thr Asn Thr Thr Ser Ala Lys

210 215 220

Asn Ala Ala Ala Pro Glu Pro Glu Lys Glu Ala Thr Pro Glu Pro Val

225 230 235 240

Asp Asn Ser Lys Glu Glu Ala Asp Asn Leu Lys Gln Gln Ala Asn Gln

245 250 255

Leu Tyr Lys Lys Arg Gln Phe Asp Glu Ala Ile Glu Leu Tyr Asn Lys

260 265 270

Ala Trp Glu Thr Phe Gln Asp Ile Thr Tyr Leu Asn Asn Arg Ala Ala

275 280 285

Ala Glu Phe Glu Lys Gly Asp Tyr Asp Ala Thr Ile Glu Thr Cys Glu

290 295 300

Asn Ala Val Glu Lys Gly Arg Glu Leu Arg Ala Asp Tyr Lys Leu Val

305 310 315 320

Ala Lys Ser Phe Ala Arg Leu Gly Ser Ala Tyr Leu Lys Lys Asp Asp

325 330 335

Leu Pro Asn Ala Ile Lys Phe Phe Glu Lys Ser Leu Thr Glu His Arg

340 345 350

Ser Pro Asp Val Leu Ser Lys Leu Arg Ala Ala Glu Ala Asp Leu Lys

355 360 365

Lys Lys Glu Ala Glu Glu Tyr Ile Asp Pro Glu Lys Ala Glu Glu Ala

370 375 380

Arg Leu Gln Gly Lys Asp Phe Phe Thr Lys Gly Asp Trp Pro Ala Ala

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Val Lys Ala Tyr Thr Glu Met Ile Asn Arg Ala Pro Lys Asp Ala Arg

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Gly Tyr Ser Asn Arg Ala Ala Ala Leu Ala Lys Leu Met Ser Phe Pro

420 425 430

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Asp Thr Asn Glu Gly Lys Ala Ala Asn Glu Ile Asn Gly Leu Tyr Tyr

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Ala Ala Leu Gln Glu His Met Lys Asn Pro Glu Val Ala Lys Lys Ile

545 550 555 560

Asn Ile Leu Ile Ala Ala Gly Val Ile Arg Thr Arg

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<210> 2

<211> 287

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

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1 5 1015

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202530

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Val Ile Asn Asn Pro Glu Thr Asp Leu Glu Asn Lys Glu Val Ala Phe

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859095

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100 105 110

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Val Lys Leu Lys Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Asn Val Leu Arg His Asn

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165 170 175

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Asp Ser Leu Asn Asn Asp Asp Leu Asn Thr Ile Lys Gln Val Leu

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<210> 3

<211> 361

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Thr Pro Arg Ser His Ile Phe Phe Asp Ile Ser Ile Asn Asn Gln

1 5 1015

Pro Ala Gly Arg Ile Ile Phe Glu Leu Phe Asn Asp Ile Val Pro Lys

202530

Thr Ala Glu Asn Phe Arg Ala Leu Ser Thr Gly Glu Lys Gly Ile Gly

354045

Lys Ser Gly Lys Pro Leu His Tyr Lys Gly Ser Thr Phe His Arg Ile

505560

Ile Lys Asp Phe Met Val Gln Gly Gly Asp Phe Thr Asn Gly Asn Gly

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Gln Leu Thr His Asp Lys Pro Phe Leu Leu Ser Met Ala Asn Ala Gly

100 105 110

Pro Gly Thr Asn Gly Ser Gln Phe Phe Ile Thr Thr Val Pro Thr Pro

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His Leu Asp Asn Lys His Val Val Phe Gly Lys Val Ile Ala Gly Lys

130 135 140

Ala Thr Val Arg Lys Ile Glu Arg Asn Ser Glu Gly Glu Ala Pro Ile

145 150 155 160

Glu Pro Val Val Ile Glu Asp Cys Gly Glu Leu Pro Glu Asp Ala Asp

165 170 175

Leu Thr Ile Ser Asp Glu Thr Gly Asp Lys Tyr Glu Glu Val Leu Lys

180 185 190

Asp Asn Glu Asn Ile Asp Ile Asp Asp Phe Glu Gln Val Tyr Gln Ala

195 200 205

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245 250 255

Leu Leu Lys Thr Ser Val Phe Ser Asn Val Ala Leu Ala Gly Leu Lys

260 265 270

Val Ser Lys Phe Lys Asp Thr Ile Lys Tyr Ala Thr Leu Val Ile Glu

275 280 285

Asp Glu Ser Ala Asp Ala Lys Ala Lys Ser Lys Gly Tyr Tyr Arg Arg

290 295 300

Gly Ser Ala Tyr Ser Ser Leu Lys Asp Glu Asp Ser Ala Ile Ser Asp

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325 330 335

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340 345 350

Lys Ala Ala Leu Ser Lys Phe Phe Glu

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<210> 4

<211> 1719

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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aaggcggtgt catttttcac ccaggcaatt gaggcctctc ccacccctaa tcacatttta 120

ttctcaaatc gttcagccgc ctacgcttcc ttaggacagt accaagatgc attggatgac 180

gcaaataagt gtgttgaaat caatggttct tgggccaaag gttacaacag agtcggtgct 240

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ttagaccctg ctaacaagat ggccaaggag ggactcaatg agacagagat tgcaagagat 360

gctggtaatg atgtgaagaa catcttttcc gatgccggca tggtggaaaa attgaaaaag 420

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atgggtgcca tgcttggtgt tgatttgggt gtccagccat ctcaacagtc tgccccacaa 600

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<210> 5

<211> 864

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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acattgatga acgaatccat gaaggtgatt aacaaccccg aaacagattt agaaaacaaa 180

gaggttgcct ttgacaattt tgaaatgctc attgaaaata tggacaatgc taataacatt 240

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cattttctga agcactctga tggtataaag aagttgattg caatctcttc taattcggag 420

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<211> 1086

<212> DNA

<213> 人工序列

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gaacccgttg tcattgagga ctgtggtgaa cttccagaag acgcagattt gaccatctcc 540

gacgagactg gagacaagta tgaggaagtt ctgaaagata atgagaacat agacatcgat 600

gactttgaac aggtctacca ggccatcact gaaatcaaag aattgggtac aaagtatttc 660

aaaaatggtg acaccaaaat cgccttcgaa aagtatcaaa aggctgctaa ttatttgctg 720

gaatacatac catcagattt atcagaggaa cagagctcta agttggagct gctaaaaaca 780

tctgtcttct ccaacgtggc attggctgga ctgaaagttt ccaagttcaa agacacgatt 840

aagtatgcca cattggtcat tgaggatgaa tctgcggatg caaaggccaa gtccaaaggc 900

tactaccgta gaggaagtgc ttacagctca ctgaaagacg aagattcagc catctcagat 960

ttccagaaag cacttgaatt atccccaggt gatcctgcaa ttagccaatc tctacaaaga 1020

accacgaagg ccagaaaaga ccgtcttgcc aaagagaaag ctgctttgtc taagttcttt 1080

gagtag 1086

<210> 7

<211> 1740

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgccagctg tcggtattga tttaggaact acatactcat gtgtggcaca tttcgccaat 60

gatcgtgttg agatcattgc aaatgaccag ggtaacagaa ctaccccatc attcgtcgct 120

ttcactgaca ccgagagact gattggtgac gctgctaaga accaagctgc tatgaaccca 180

gccaacaccg ttttcgacgc caagcgtttg atcggtagaa agttctcaga tgctgagacc 240

caagctgata tcaagcactt cccattcaag gtcgttgaca agggtggaaa gccaaacatt 300

caagttgaat tcaaaggtga gactaaggtc ttcactccag aagagatctc ttccatggtt 360

ttgaccaaga tgaaggacac tgctgagcaa ttccttggtg acaaggttaa cgatgccgtt 420

gtcactgtcc cagcttactt caacgactct cagagacagg ccactaagga tgctggtctc 480

attgccggtt tgaacgttat gagaatcatc aacgagccaa ccgctgctgc cattgcctac 540

ggtttggaca aaaaagctga gggtgagaag aacgttctga tcttcgactt gggtggagga 600

actttcgatg tttctttgct gtccattgaa gacggtattt tcgaggtcaa ggctactgct 660

ggtgacactc acttaggtgg tgaggacttt gacaacagat tggtcaacca cttcatcgct 720

gaattcaaga gaaagaacaa gaaggacttg tcttcaaacc aaagagcttt gagaagattg 780

agaaccgcct gtgagcgtgc taagagaact ttgtcttctt ctgctcaaac ttccatcgag 840

atcgactctt tgtttgaagg tgttgacttt tacacttctt tgaccagagc cagattcgag 900

gaactgtgtg gtgatctatt cagatctacc attgagcctg tggagaaggt tttgaaggac 960

gctaagttgg acaagtccca agtcaacgag attgtcttgg ttggtggttc caccagaatt 1020

ccaaaggtcc aaaagttggt gtctgacttc ttcaacggta aggaaccaaa cagatctatc 1080

aacccagatg aggctgttgc ctacggtgcc gctgtgcaag ctgctattct ttccggtgac 1140

acttcctcca agacccaaga tttgttgctg ttggacgttg ctcctctgtc cctgggtatt 1200

gagactgctg gtggtatcat gaccaagctg atcccaagaa actctaccat cccaaccaag 1260

aagtccgaga ctttctccac ttacgctgac aaccaaccag gtgtgttgat tcaggtatac 1320

gagggtgaga gagccaagac tgccgacaac aacttattgg gtaagttcga gctgtctggt 1380

attcctccag ctccaagagg tgttcctcag atcgaggtca ctttcgacat ggatgccaat 1440

ggtatcttga acgtctctgc cgttgagaag ggtaccggta aggctcaaca gatcactatc 1500

accaacgaca agggtagatt gtccaaggaa gacattgagg ccatgatctc tgaggctgag 1560

aagtacaagg atgaagatga gaaggaggct gccagaatcc aagctagaaa cgctctggag 1620

tcttactcat tctctctgaa gaacaccttg aacgagaagg aagtcggtga gaaattggat 1680

gctgccgaca aggagtcttt gaccaaggct attgacgaga ctacctcatg gatcgacgag 1740