法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2022-05-06
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12Q 1/682 专利号:ZL2016103375446 申请日:20160521 授权公告日:20190709
专利权的终止
2019-07-09
授权
授权
2017-12-22
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N27/48 申请日:20160521
实质审查的生效
2017-11-28
公开
公开
技术领域
本发明属于分析化学或环境监测技术领域,具体涉及一种基于磁性纳米粒子和杂交链式反应信号放大技术检测重金属银离子的电化学方法。
背景技术
银作为一种贵金属有着极好的光学、电学和杀菌特性,因而广泛地应用于能源、摄像、医药等各个行业。因此,必然会有一些含银的残留物被排放到水体环境中,对水生生物和人类健康产生潜在的威胁。银离子(Ag+)能通过食物链或者饮用水进入人体,导致机体内的含硫酶失活,还可以与胺、咪唑等各种代谢产物结合而导致各种疾病,如肠胃炎、神经紊乱、精神疲劳、风湿、软骨打结、成纤维细胞等对人体健康造成危害。因此,发展快速测定微量Ag+的方法十分重要。研究表明,金属离子能选择性的结合到天然或人工合成的DNA碱基上,形成以金属介导的碱基对,通过寡核苷酸结构的变化来检测金属离子。类似地,Ag+能特异性识别胞嘧啶(C)-胞嘧啶(C)错配,形成稳定的C-Ag+-C>+传感检测方法的快速发展。
磁性纳米粒子是近年来发展起来的一种新型纳米材料,由于磁性纳米粒子具有特殊的磁导向性、超顺磁性、易清洗、易分离,以及表面可连接生化活性功能基团等特性,使其在核酸分析、临床诊断、靶向药物、细胞分离和酶固定化等领域的应用得到了广泛的发展。磁性纳米粒子的这些特性可以显著地提高生物传感器检测的灵敏度,缩短生化反应时间,提高检测通量,为生物传感器领域的应用开辟了广阔的前景。杂交链式反应(hybridization chain reaction)是一种仅依靠一对交叉互补的寡核苷酸发夹探针便可对目标核酸进行放大检测的方法,且不依赖蛋白酶。
本发明利用磁性纳米粒子和杂交链式反应作为信号放大技术,基于Ag+能特异性识别胞嘧啶(C)-胞嘧啶(C)错配并形成稳定的C-Ag+-C>+高灵敏度、高选择性的检测。为了增加分析速率和稳定性,磁纳米粒子表面发生杂交链式反应形成的长链DNA复合物采用磁性金电极吸附固定,该方法具有简单、快速、灵敏度高等优点。
发明内容
本发明的目的之一是设计不同序列的DNA,构建一种快速、灵敏的电化学传感器。
本发明的目的之二是提供一种基于磁性纳米粒子和杂交链式反应放大技术联用构建电化学传感器的制备方法。
本发明的目的之三是将构建的电化学传感器用于重金属离子的高灵敏、快速检测。
本发明的技术方案如下:
1. 一种基于磁性纳米粒子和杂交链式反应放大技术联用构建重金属离子电化学传感器
首先制备Fe3O4@Au核-壳磁性纳米粒子,将富含C碱基的核酸链S1通过Au-S键固定到磁性纳米粒子表面,在目标物银离子Ag+存在下,二茂铁标记的另一条富含C碱基的核酸链S2通过C-Ag+-C结构在磁性粒子表面与S1形成双链DNA。当加入二茂铁标记的发夹结构DNA>+浓度的定量测定。
2. 一种基于磁性纳米粒子和杂交链式反应放大技术联用构建重金属离子电化学传感器的制备方法
(1)Fe3O4@Au核-壳磁性纳米粒子的制备
首先采用共沉淀法制备Fe3O4,将FeCl2、FeCl3和浓HCl溶于水中,超声脱氧。将上述溶液滴加到NaOH溶液中,80℃搅拌下通N2气保护,得到Fe3O4磁性纳米粒子。在Fe3O4/乙醇溶液中加入3-氨丙基三乙氧基硅烷,对Fe3O4粒子表面进行氨基化。在上述溶液中加入HAuCl4水溶液,以柠檬酸钠为还原剂,得到Fe3O4@Au核-壳磁性纳米粒子。
(2)双链DNA标记Fe3O4@Au粒子的制备
将步骤(1)得到的Fe3O4@Au磁性纳米粒子与活化的富含C碱基的核酸链S1在25℃下反应12>3O4@Au粒子。通过琥珀酰亚胺耦联(EDC-NHS)方法对富含C碱基的核酸链S2的NH2基端标记二茂铁。然后在Ag+存在下,加入核酸链S2,S2通过C-Ag+-C结构与Fe3O4@Au粒子表面的S1杂交形成双链DNA,得到双链DNA标记的Fe3O4@Au磁性纳米粒子。
(3)Fe3O4@Au偶联HCR反应
在步骤(2)得到的双链DNA标记的Fe3O4@Au>
(4)Ag+电化学传感器的制备
将工作电极磁性金电极在piranha溶液中浸泡1 h,超纯水清洗。然后分别用0.3um和0.05um的Al2O3抛光粉打磨,依次在超纯水、无水乙醇、超纯水中超声清洗。最后在0.5>2SO4溶液中,以50>2气吹干备用。步骤(3)得到的长链DNA复合物通过磁性富集作用修饰到活化的磁性金电极表面,构建重金属Ag+电化学传感器。
3. Ag+离子的检测方法
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为对电极,修饰的金磁电极为工作电极,在0.1 M pH 7.4的PBS缓冲溶液(包含0.2 M NaCl和0.1 M NaClO4)中进行测试;
(2)用微分脉冲伏安法(DPV)对重金属离子进行检测,设置扫描电位范围为-0.2~0.6 V,扫描速率为0.1 V/S,扫描完成后记录峰电流的大小,并保存数据;
(3)根据所得DPV峰电流的大小与Ag+离子浓度的关系,绘制工作曲线;
(4)采用标准加入法,在水样溶液中加入不同浓度的Ag+离子标准溶液,按照工作曲线的绘制方法对不同浓度的Ag+离子进行检测。
与现有技术相比,本发明具有以下有益成果
(1)本发明利用磁性纳米粒子和杂交链式反应双重信号放大技术联用构建重金属离子电化学传感器。
(2)本发明将Fe3O4@Au核-壳磁性纳米粒子引入到电化学传感器的构建中,利用磁性金电极,从而增加了修饰电极的稳定性。
(3)本发明利用C-Ag+-C结构,设计特定序列的DNA,从而增强了电极对重金属离子的选择性,增加了传感器的特异性。
(4)本发明制备的电化学传感器用于重金属Ag+离子的检测,具有较高的选择性和抗干扰能力,线性范围宽,检测限低,可用于实际水样中超痕量Ag+离子的测定。
附图说明
图1是基于磁性纳米粒子和杂交链式反应放大技术联用检测重金属Ag+离子的原理示意图。
图2是Ag+的标准曲线,横坐标是Ag+的浓度,单位是pM或M,纵坐标是DPV峰电流,单位是uA。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明,但不构成对发明的进一步限制。
实施例1 一种基于磁性纳米粒子和杂交链式反应放大技术联用检测重金属Ag+离子的方法
本发明基于磁性纳米粒子和杂交链式反应放大技术联用检测重金属Ag+离子的方法原理如图1所示。富含C碱基的核酸链S1通过Au-S键固定到Fe3O4@Au核-壳磁性纳米粒子表面,在目标物银离子Ag+存在下,二茂铁标记的另一条富含C碱基的核酸链S2通过C-Ag+-C结构与磁性粒子表面的S1形成双链DNA。当加入二茂铁标记的发夹结构DNA>+浓度的定量测定。
实施例2 寡核苷酸序列设计
本发明所设计的寡核苷酸序列由中国上海Sangon生物工程有限公司合成,并通过 HPLC纯化检验,冻干。本发明设计的寡核苷酸序列如下:
S1:5’-SH-CAC TTC TCT CTT CTC TTC CCT CTC-3’;
S2:5’-AGG AGT AGA CTA GAT CGG ACA CAC ACC CAA CAC AAC ACA CAA CTC-NH2-3’;
H1:5’-TGT CCG ATC TAG TCT ACT CCT ACT GTG AGG AGT AGA CAT GAT-NH2-3’;
H2:5’-AGG AGT AGA CTA GAT CGG ACA ATC TAG TCT ACT CCT CAC AGT-NH2-3’;
将寡核苷酸溶解在超纯灭菌水中,-18℃保存备用。
实施例3 Fe3O4@Au核-壳磁性纳米粒子的制备
取1>2>2O、2.6>36H2O和0.425>2保护下80℃搅拌,得到Fe3O4磁性纳米粒子。配制5>3O4乙醇溶液25>43H2O和0.3>3O4@Au核-壳磁性纳米粒子,磁分离并清洗,干燥保存。
实施例4 寡核苷酸S1和 S2杂交双链标记Fe3O4@Au核-壳磁性纳米粒子
取1 mL 0.2 uM的S1与1 mg Fe3O4@Au粒子在>3O4@Au粒子。取100>3O4@Au、100>+在37℃恒温水浴中混合4>3O4@Au核-壳磁性纳米粒子。
实施例5 Fe3O4@Au偶联HCR反应
取100uL实施例4制得的双链DNA标记Fe3O4@Au核-壳磁性纳米粒子,加入100>3O4@Au粒子表面发生杂交链式反应,缓冲液清洗,制得长链DNA复合物修饰的Fe3O4@Au粒子。
实施例6 电化学传感器制备
将磁性金电极在piranha溶液中浸泡1 h,超纯水清洗。然后分别用0.3um和0.05 um的Al2O3抛光粉打磨,依次在超纯水、无水乙醇中超声清洗。在0.5>2SO4溶液中,以50>2气吹干备用。将处理后的磁性金电极浸入实施例5制得的长链DNA复合物修饰Fe3O4@Au粒子溶液中,利用磁性富集作用将其固定在金磁电极表面,制得Ag+电化学传感器。
实施例7 重金属离子的检测
使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为对电极,金磁电极为工作电极。采用微分脉冲伏安法测定重金属Ag+离子,以0.1>4)>+浓度的标准曲线如图2所示,峰电流与Ag+浓度在1>R为0.9970,线性方程为ipc>c>+的超痕量检测。
实施例8 样品测定
将待测样品溶液代替Ag+离子标准溶液,采用标准加入法,按照标准曲线方法对样品溶液中的Ag+进行测定。测定结果表明,检测结果与加入的Ag+标准溶液浓度一致,具有满意的回收率和相对标准偏差,本发明制备的电化学传感器能用于实际样品中Ag+的测定。
上面结合附图对本发明实施例进行了说明,但本发明不限于上述实施例,还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化,凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,只要符合本发明的发明目的,只要不背离本发明基于磁性纳米粒子和杂交链式反应放大技术联用构建重金属离子电化学传感器的制备方法,超痕量重金属离子电化学测定方法及应用的技术原理和发明构思,都属于本发明的保护范围。
机译: 通过使用多聚酶链式反应进行重组并结合酶促聚合反应的方法,能够同时检测两种转基因,即5-烯丙基丙酮酸叔丁酯-3-磷酸合酶(EPSPS或CP4EPSPS)基因和花椰菜病毒(CAMV)35s启动子杂交玉米计划
机译: 一种用于检测至少一个引起压力波非随机持续变化的物体的方法。一种计算机分析方法,用于分析检测到的地震或声波信号,以便检测至少一个在频带F中引起信号非随机持续变化的物体。检测至少一个引起感兴趣的地震或声音信号的物体。一种计算机系统,分析检测到的信号,以便检测至少一个引起感兴趣的信号的物体。计算机模块,分析检测到的信号,以便检测至少一个物体引起感兴趣的信号,该设备程序可以被机器读取。检测至少一个物体引起感兴趣的地震或声音的方法是一种有序的方法和计算机程序
机译: 一种利用信号放大技术检测微生物的装置