一种多通路二维色谱仪及用于二维色谱分离的方法

技术领域

本申请涉及一种多通路二维色谱仪及用于二维色谱分离的方法，属于仪器设备制造技术领域，是一种高效色谱分离分析装置。

背景技术

色谱方法具有高效、快速、应用广泛的特点，目前己经发展成为解决有机物质研究中各种分离、分析难题的关键技术，在药学、生命科学、医学、食品科学、石油化工及环境保护等领域得到广泛的应用。通常的色谱仪由流动相储存器、流动相泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等组成，应用过程中多采用一根色谱柱进行分离，也就是一维色谱分离。对于复杂体系，例如天然产物、体液等，通常一个样品中包含了几十甚至几百种组分，而各组分之间结构相似，受一维色谱分辨率和峰容量等的限制，无法满足复杂分离的需要。

二维液相色谱是在一维色谱基础上发展起来的一项技术，它采用一个一维色谱柱和一个二维色谱柱，将一维色谱柱分离馏分引入第二色谱柱进行二维分离。与一维液相色谱系统相比，二维色谱的优势在于提供了更大的峰容量，从而能够更为有效地解决复杂体系样品的分析问题。

中国专利“一种天然产物的分离方法” （申请号 201210022094.3）采用一个一维色谱柱、一个二维色谱柱、一个富集柱和一个二位六通阀，借助高压泵的关停，利用富集柱富集、进样交替，实现了二维分离。中国专利“一种制备型多维液相色谱仪”（申请号201110256302.1），采用一个一维分离柱、一个二维分离柱、两个富集柱和一个二位十通阀，二维分离柱将两个富集柱连接到二位十通阀上，两个定量管交替富集、进样，实现了二维分离。中国专利“一种全二维毛细管液相色谱分离系统”（申请号 200410098443.5），采用一个一维分离柱、二个二维分离柱、一个富集柱、两个六通阀、一个二位十通阀，实现了二维分离。中国专利“全二维超高压高效液相色谱分离系统”（申请号 201010256470.6），采用一个常规高压液相色谱柱、一个超高压液相色谱柱、两个定量环、一个二位十通阀，常规高压液相色谱柱为一维分离柱，超高压液相色谱柱为二维分离柱，利用二位十通阀的旋转使两个定量环交替采样、进样，实现了二维分离。

目前的二维色谱模式多是通过以1-2个二位六通阀、八通阀、十通阀等接口模式，采用1个一维分离柱和1个二维分离柱，将一维色谱柱分离馏分引入第二色谱柱进行二维分离。在现有仪器中，受接口模式所限，要求一维的流速要非常小，二维分离柱的长度要非常短，难以应用常规的色谱柱作为二维色谱柱进行分离，这使得整个分离效果受到限制。对于大容量的制备性分离，现有技术也不能够满足需求，无法直接应用于成分的分离制备。此外，现有二维技术使用一个一维色谱柱、一个二维色谱柱进行分离，每次最多只能使用两种固定相色谱柱进行配合分离，难于满足复杂样品的分离需要。

发明内容

为解决现有技术所存在的缺陷，本发明提供了一种多通路二维高效液相色谱仪，通过多个二位六通阀串联与转换切换，使得一维分离流出液依次切换到多个二维色谱柱中进行二维分离，二维色谱分离组分由馏分收集器收集。

为了实现上述目的，本发明的具体采用的技术方案如下：

一种多通路二维色谱仪，包括一维色谱分离系统和多通路二维色谱分离系统，其中一维色谱分离系统由一维色谱流动相储液器M、一维色谱高压泵P、一维色谱进样阀V、一维色谱色谱柱C和一维色谱检测器D组成；多通路二维色谱分离系统由多个二维色谱流动相储液器M1至M8、多个二维色谱高压泵P1至P8、多个二维色谱色谱柱C1至C8、多个二维色谱检测器D1至D8和馏分收集器组成；一维色谱分离系统和多通路二维色谱分离系统通过多个二位六通阀V1至V8连接，每个二位六通阀上均安装有一个捕集柱，分别用F1至F8表示；

各部件间的连接关系是：每个二位六通阀的①号口与二维色谱泵的出口相连，②号口与二维色谱柱的进口相连，二维色谱柱的出口与二维检测器的进口相连，二维检测器的出口与分步收集器相连，对于一个8通路的二维分离系统，形成M1→P1→V1① V1②→C1→D1→收集器1，M2→P2→V2① V2②→C2→D2→收集器2，M3→P3→V3① V3②→C3→D3→收集器3，M4→P4→V4① V4②→C4→D4→收集器4，M5→P5→V5① V5②→C5→D5→收集器5，M6→P6→V6① V6②→C6→D6→收集器6，M7→P7→V7① V7②→C7→D7→收集器7，M8→P8→V8① V8②→C8→D8→收集器8的二维分离连接方式；每个二位六通阀（V1-V8）的③口和⑥号口之间相连1个捕集柱（F1-F8）；一维分离系统由Ｍ→Ｐ→V→C→D→相连顺序相连，其出口与改进剂混合后连接到二位六通阀V1的④号口，V1的⑤号口连V2的④号口，V2的⑤号口连V3的④号口，V3的⑤号口连V4的④号口，V4的⑤号口连V5的④号口，V5的⑤号口连V6的④号口，V6的⑤号口连V7的④号口，V7的⑤号口连V8的④号口，V8的⑤号口连流动相回收器W，形成Ｍ→Ｐ→V→C→D→V1④ V1⑤→ V2④ V2⑤→V3④ V3⑤→V4④ V4⑤→V5④ V5⑤→V6④ V6⑤→V7④ V7⑤→V8④ V8⑤→W的连接方式。

所述的一种多通路二维色谱仪，所述的二位六通阀的个数不限于8个（优选为4-16），通道数和通道号不仅限于上述固定的通道号数。

所述的一种多通路二维色谱仪，所述储液器M、M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8可以是耐有机溶剂耐腐蚀的玻璃容器或有机材料容器或不锈钢容器。

所述的一种多通路二维色谱仪，所述高压泵P、P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8可以是能提供稳定压力与流速的恒流泵或恒压泵。

所述的一种多通路二维色谱仪，所述进样阀V可以是固定容积的进样阀或进样泵。

所述的一种多通路二维色谱仪，所述色谱柱C和C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8可以是玻璃、不锈钢、PEEK；填装的填料可以为离子交换材料、正相色谱填料、反相色谱填料、凝胶填料，填料的量可以是分析型、半制备型、制备型。

所述的一种多通路二维色谱仪，所述检测器D、D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8可以是紫外检测器、荧光检测器、示差折光检测器；检测器D的检测池为耐高压检测池。

所述的一种多通路二维色谱仪的色谱分离方法，储液器M中的洗脱液经高压泵P输送经过进样阀V，载带进样阀V中的样品进入色谱柱C进行一维分离，色谱柱C的流出液与改进剂混合后进入V1的④号通孔，通过V的内通孔从V1的③口流出并进入捕集柱F1，一维分离组分被F1捕集，流出液体进入V1的⑥号口，经过V1内通孔从V1⑤口流出，一维色谱分离液体流动顺序为：Ｍ→Ｐ→V→C→D→V1④→V1③→F1→V1⑥→V1⑤→ V2④→V2⑤→V3④→V3⑤→V4④→V4⑤→V5④→V5⑤→V6④→V6⑤→V7④→V7⑤→V8④→V8⑤→W，此时V1所连二维色谱系统处于捕集状态，其他均处于分离状态，8通路的二维分离系统为：M1→P1→V1①→V1②→C1→D1→收集器1，M2→P2→V2①→V2⑥→F2→V2③→V2②→C2→D2→收集器2，M3→P3→V3①→V3⑥→F3→V3③→V3②→C3→D3→收集器3，M4→P4→V4①→V4⑥→F4→V4③→V4②→C4→D4→收集器4，M5→P5→V5①→V5⑥→F5→V5③→V5②→C5→D5→收集器5，M6→P6→V6①→V6⑥→F6→V6③→V6②→C6→D6→收集器6，M7→P7→V7①→V7⑥→F7→V7③→V7②→C7→D7→收集器7，M8→P8→V8①→V8⑥→F8→V8③→V8②→C8→D8→收集器8；

F1捕集柱接近捕集完成时，先旋转V2，使V2的①②内部连通，④③内部连通，⑥⑤内部连通，使F2处于捕集状态，然后旋转V1使V1①⑥连通，⑤④连通，③②连通，V1所连二维系统处于分离状态，此时一维色谱流体流动顺序为：Ｍ→Ｐ→V→C→D→V1④→V1⑤→ V2④→V2③→F2→V2⑥→V2⑤→V3④→V3⑤→V4④→V4⑤→V5④→V5⑤→V6④→V6⑤→V7④→V7⑤→V8④→V8⑤→W，二维系统流体流动顺序为：M1→P1→V1①→V1⑥→F1→V1③→V1②→C1→D1→收集器1，M2→P2→V2①→V2②→C2→D2→收集器2，M3→P3→V3①→V3⑥→F3→V3③→V3②→C3→D3→收集器3，M4→P4→V4①→V4⑥→F4→V4③→V4②→C4→D4→收集器4，M5→P5→V5①→V5⑥→F5→V5③→V5②→C5→D5→收集器5，M6→P6→V6①→V6⑥→F6→V6③→V6②→C6→D6→收集器6，M7→P7→V7①→V7⑥→F7→V7③→V7②→C7→D7→收集器7，M8→P8→V8①→V8⑥→F8→V8③→V8②→C8→D8→收集器8。此时V2所连F2处于捕集状态，V1所连二维色谱系统处于分离状态，检测器D1的流出液进入馏分收集器F1进行收集；

待F2捕集完成时，再旋转V3和V2，使F3处于捕集状态，V2所连二维色谱系统处于分离状态，依次操作至V8。如果此时一维分离还未完成，可从V1开始进行下一循环，直到一维色谱分离完成。

本发明一种多通路二维色谱仪，具有超强的分离能力；除此之外，本发明的突出效果是：

1. 采用多通路二维分离系统，固定相可选择种类多，分离效率高，分离效果好，可实现复杂样品的全组分分离与分析；

2. 采用多通路二维分离系统，各通道流动相组成独立控制，可以保证分离过程精确控制，改善分离效果；

3. 采用捕集柱捕集一维分离组分，有效抑制了二维色谱分离的峰展宽，分离效果更好；

4. 采用捕集柱捕集与多个二维色谱柱相结合进行二维分离，允许一维色谱柱以更高的流动相流速进行分离，可用于大样品量的制备性分离；

5. 采用捕集柱捕集与多个二维色谱柱相结合进行二维分离，有充足的时间进行二维分离，允许使用更长的二维色谱柱进行二维分离，分离效果更好，适用于各类复杂混合物的分离纯化；

6. 可以采用更多数量的捕集柱捕集与二维色谱柱相结合进行特别复杂的样品的分离，这是目前其他仪器所不具备的；

7. 本发明适用性广，适用于正相色谱、反相色谱、离子色谱、凝胶色谱、超临界色谱等多种色谱方法。

附图说明

图1是实施例多通路二维色谱仪的结构示意图；

图2是实施例一维检测器D输出信号示意图；

图3是实施例二维检测器输出信号示意图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图详细说明本发明的技术方案，但保护范围不限于此。

实施例1如图1所示，一种多通路二维色谱仪及用于二维色谱分离的方法，多通路二维色谱仪由一维色谱分离系统和多通路二维色谱分离系统组成，一维色谱分离系统由一维色谱流动相储液器M、一维色谱高压泵P、一维色谱进样阀V、一维色谱色谱柱C和一维色谱检测器D组成，二维色谱分离系统由多个二维色谱流动相储液器M1至M8、多个二维色谱高压泵P1至P8、多个二维色谱色谱柱C1至C8、多个二维色谱检测器D1至D8和馏分收集器组成；一维色谱分离系统和二维色谱分离系统通过多个二位六通阀V1至V8连接，每个二位六通阀上均安装有一个捕集柱（F1至F8）。

各部件间的连接关系是：每个二位六通阀的①号口与二维色谱泵的出口相连，②号口与二维色谱柱的进口相连，二维色谱柱的出口与二维检测器的进口相连，二维检测器的出口与分步收集器相连，对于一个8通路的二维分离系统，形成M1→P1→V1① V1②→C1→D1→收集器1，M2→P2→V2① V2②→C2→D2→收集器2，M3→P3→V3① V3②→C3→D3→收集器3，M4→P4→V4① V4②→C4→D4→收集器4，M5→P5→V5① V5②→C5→D5→收集器5，M6→P6→V6① V6②→C6→D6→收集器6，M7→P7→V7① V7②→C7→D7→收集器7，M8→P8→V8① V8②→C8→D8→收集器8的二维分离连接方式；每个二位六通阀（V1-V8）的③口和⑥号口之间相连1个捕集柱（F1-F8）；一维分离系统由Ｍ→Ｐ→V→C→D→相连顺序相连，其出口与改进剂混合后连接到二位六通阀V1的④号口，V1的⑤号口连V2的④号口，V2的⑤号口连V3的④号口，V3的⑤号口连V4的④号口，V4的⑤号口连V5的④号口，V5的⑤号口连V6的④号口，V6的⑤号口连V7的④号口，V7的⑤号口连V8的④号口，V8的⑤号口连流动相回收器W，形成Ｍ→Ｐ→V→C→D→V1④ V1⑤→ V2④ V2⑤→V3④ V3⑤→V4④ V4⑤→V5④ V5⑤→V6④ V6⑤→V7④ V7⑤→V8④ V8⑤→W的连接方式。

F1捕集柱接近捕集完成时，先旋转V2，使V2的①②内部连通，④③内部连通，⑥⑤内部连通，使F2处于捕集状态，然后旋转V1使V1①⑥连通，⑤④连通，③②连通，V1所连二维系统处于分离状态，此时一维色谱流体流动顺序为：Ｍ→Ｐ→V→C→D→V1④→V1⑤→ V2④→V2③→F2→V2⑥→V2⑤→V3④→V3⑤→V4④→V4⑤→V5④→V5⑤→V6④→V6⑤→V7④→V7⑤→V8④→V8⑤→W，二维系统流体流动顺序为：M1→P1→V1①→V1⑥→F1→V1③→V1②→C1→D1→收集器1，M2→P2→V2①→V2②→C2→D2→收集器2，M3→P3→V3①→V3⑥→F3→V3③→V3②→C3→D3→收集器3，M4→P4→V4①→V4⑥→F4→V4③→V4②→C4→D4→收集器4，M5→P5→V5①→V5⑥→F5→V5③→V5②→C5→D5→收集器5，M6→P6→V6①→V6⑥→F6→V6③→V6②→C6→D6→收集器6，M7→P7→V7①→V7⑥→F7→V7③→V7②→C7→D7→收集器7，M8→P8→V8①→V8⑥→F8→V8③→V8②→C8→D8→收集器8。此时V2所连F2处于捕集状态，V1所连二维色谱系统处于分离状态，检测器D1的流出液进入馏分收集器F1进行收集。

待F2捕集完成时，再旋转V3和V2，使F3处于捕集状态，V2所连二维色谱系统处于分离状态，依次操作至V8。如果此时一维分离还未完成，可从V1开始进行下一循环，直到一维色谱分离完成。

按上述连接及操作方式，进行槐角提取物的二维色谱分离：

第一维色谱柱为ODS柱，长度为25 cm。一维流动相为甲醇-0.1%磷酸，梯度洗脱（甲醇在0-20min内由5%变为60%，体积比）,流速为1ml/min。第二维色谱柱均为ODS柱，长度为25 cm。二维流动相M1为甲醇-0.1%磷酸（0-20min 为10/90, 20min以后为70/30，体积比），M2为甲醇-0.1%磷酸（0-20min 为15/85, 20min以后为70/30，体积比），M3为甲醇-0.1%磷酸（0-20min 为25/75, 20min以后为70/30，体积比），M4为甲醇-0.1%磷酸（0-20min 为35/65,20min以后为75/25，体积比），M5为甲醇-0.1%磷酸（0-20min 为45/55, 20min以后为75/25，体积比），M6为甲醇-0.1%磷酸（0-20min 为55/45, 20min以后为75/25，体积比），M7为甲醇-0.1%磷酸（0-20min 为65/35, 20min以后为75/25，体积比），M8为甲醇-0.1%磷酸（0-20min为70/30, 20min以后为75/25，体积比）。二维流动相的流速为1.0ml/min。每个捕集柱捕集时间均为2min，各检测器均为紫外检测器，检测波长均为254nm。

本发明实施例进行分离时的一维检测器D输出信号示意图见附图2，二维检测器输出信号示意图见附图3，由图2和图3可以看出，一维色谱分离能使部分主要成分得到初步分离，但仍有一部分组分的色谱峰有重合，二维色谱能使捕集区域的各组分得到良好的分离。

由此说明本发明分离效率高，实用性强，尤其适用于中药、体液等复杂体系的全成分分离和结构相似化合物等难分离物质的分离。

本发明是在国家自然科学基金项目（21675071）的支持下完成的，特此致谢。