一种抗草甘膦基因以及转基因抗草甘膦烟草的培育方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种抗草甘膦基因以及转基因抗草甘膦烟草的培育方法。

背景技术

烟草是中国重要的经济作物之一。杂草是影响烟草产量和品质的重要因素。化学除草是目前最经济有效的杂草管理方法，可以有效减少作物产量损失和大大减低劳动力成本(Akbar et al.,2011；Chauhan,2013；Parthipan and Ravi,2014；Chauhan et al.,2015；Antralian et al.,2015)。草甘膦是20世纪70年代由孟山都公司开发的除草剂，可以与莽草酸途径中的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase，EPSPS)结合，抑制芳香族氨基酸的合成(Steinrücken andAmrhein,1980)，从而可以达到高效广谱的除草目的。由于莽草酸途径只存在于植物、微生物、及低等动物Apicomplexan Parasites中，人和哺乳动物中尚未发现莽草酸途径的存在，所以草甘膦对人畜相对安全(Herrmann,1995)。同时草甘膦具有价格低廉、在环境中易降解等特点，因此成为目前使用最广泛的除草剂(Duke andPowles,2008)。由于草甘膦对烟草有毒性，草甘膦在烟草中的使用比较少，局限于苗前处理。

开发转基因抗草甘膦烟草，可以拓宽草甘膦使用的范围、降低烟草生产成本、促进新型生产技术的发展。目前用于商业化生产的转基因抗草甘膦作物主要通过转入对草甘膦不敏感的EPSPS编码基因培育。根据EPSPS保守序列及对草甘膦的敏感性，通常将自然界中的EPSPS分为Ⅰ型和Ⅱ型。天然的Ⅰ型EPSPS对草甘膦敏感，植物及许多革兰氏阴性细菌的EPSPS属于Ⅰ型EPSPS，部分Ⅰ型EPSPS发生突变后对草甘膦的耐受性提高，例如鼠伤寒杆菌Salmonella typhimurium EPSPS 101位脯氨酸突变为丝氨酸(Comai et al.,1983)；E.coli EPSPS 96位甘氨酸突变为丙氨酸(Eschenburg et al.,2002)；水稻EPSPS 106位脯氨酸突变为亮氨酸(Zhou et al.,2006)；E.coli EPSPS 96位甘氨酸突变为丙氨酸，183位丙氨酸突变为苏氨酸(Kahrizi et al.,2007)；玉米EPSPS 102位苏氨酸突变为异亮氨酸，106位脯氨酸突变为丝氨酸(T102I/P106S，TIPS)(Funke et al.,2009)等。Ⅱ型EPSPS对草甘膦不敏感，与Ⅰ型EPSPS氨基酸同源性低于30％，来源于Agrobacterium tumefacienssp.strain CP4，Achromobacter sp.strain LBAA，Pseudomonas sp.strainPG2982，Bacillus subtilis，Streptococcus pneumonia，Staphylococcus aureus，Halothermothrix orenii H168，Pesudomonas putida均属于Ⅱ型EPSPS(Fitzgibbon andBarymer,1990；Barry et al.,1997；Du et al.,2000；Priestman et al.,2005；Tian etal.,2012)。近年来又陆续发现有别于Ⅰ型和Ⅱ型的新型EPSPS，这类EPSPS的氨基酸序列更接近Ⅰ型EPSPS，但是天然状态对草甘膦不敏感，包括4G-1(Sun et al.,2005)、GRG23和GRG51(Peters et al.,2010)、AM79AroA(Cao et al.,2012)、Gr5_aroA(Wang>

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗草甘膦基因以及一种安全、高效的转基因抗草甘膦烟草的培育方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种抗草甘膦基因，具有如SeqID No.1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了所述的抗草甘膦基因在调控烟草对草甘膦抗性中的应用。

优选的，所述应用为培育转基因抗草甘膦烟草的方法。

本发明提供了一种转基因抗草甘膦烟草的培育方法，包括以下步骤：

1)设计合成包含抗草甘膦基因的载体pAroAI.va*；

2)酶切步骤1)中所述的载体pAroAI.va*获得AroAI.va*基因片段；

3)将所述步骤2)中获得的AroAI.va*基因片段连接到叶绿体特异转化载体pZF6上，获得叶绿体转化载体pLSZ1；

4)利用基因枪粒子轰击技术将所述步骤3)中得到的叶绿体转化载体pLSZ1轰击进入烟草幼嫩叶片获得携带AroAI.va*基因的叶片；

5)分化培养步骤4)中所述的携带AroAI.va*基因的叶片获得转基因抗草甘膦烟草植株。

优选的，步骤1)中所述的载体pAroAI.va*的序列是根据叶绿体的密码子偏爱性对抗草甘膦EPSPS基因aroAI.va进行优化，并将aroAI.va内部的酶切位点去除后获得的。

优选的，步骤2)中所述酶切为Nde I和XbaI双酶切。

优选的，步骤3)具体包括以下步骤：3.1)将所述aroAI.va*基因片段连接到中间载体pZF4上获得连接有roAI.va*基因片段的中间载体pZF4，3.2)用Sac I和Hind III双酶切所述连接有aroAI.va*基因片段的中间载体pZF4，获得含有烟草叶绿体特异强启动子Prrn和特异终止子TrbcL的aroAI.va*基因表达盒；3.3)将aroAI.va*基因表达盒连接到所述叶绿体特异转化载体pZF6上，获得叶绿体转化载体pLSZ1。

优选的，步骤4)中所述叶绿体转化载体pLSZ1在轰击前用金粉包埋，所述金粉的直径为0.55～0.65μm。

优选的，步骤4)中所述基因枪粒子轰击的条件包括：轰击距离8.8～9.2cm；氦气压1,000～1,200psi；真空度22～27inches Hg。

优选的，步骤5)中所述的分化培养包括第一分化培养和第二分化培养，所述第一分化培养的时间为4～6周，所述第一分化培养的培养基为含有450～550mg/L壮观霉素的RMOP培养基。

优选的，所述第二分化培养的培养基为含有450～550mg/L壮观霉素、450～550mg/L链霉素和45～55mg/L草甘膦的RMOP培养基。

本发明的有益效果：本发明提供的抗草甘膦基因，具有Seq ID No.1所示核苷酸序列，能够连接到叶绿体特异性转化载体上，通过基因枪轰击技术转入烟草嫩叶的叶绿体中获得转基因抗草甘膦烟草植株，一方面所述转基因抗草甘膦烟草植株在受到农业推荐使用剂量的草甘膦处理时，农艺性状不受到影响，可以利用价格低廉、对人畜相对安全的广谱性除草剂草甘膦对烟草地中的杂草进行控制；另一方面本发明所提供的转基因抗草甘膦烟草植株中的抗草甘膦基因不随花粉漂移，确保转基因抗草甘膦烟草植株的生物安全性。

附图说明

图1为实施例1中人工合成抗草甘膦基因的载体pAroAI.va*的结构示意图；

图2为实施例2中烟草叶绿体转化载体pLSZ1的结构示意图；

图3为实施例2中aroAI.va*基因整合进入叶绿体基因组的Southern分析结果；

图4为实施例3中转基因抗草甘膦烟草植株的发芽及同质化验证结果；

图5为实施例4中烟草转化苗的Northernblot杂交结果图；

图6为实施例5中转基因抗草甘膦烟草植株的Westernblotting检测结果；

图7为实施例6中转基因抗草甘膦烟草叶片对草甘膦的耐受度检测结果；

图8为实施例7不同浓度草甘膦处理种子发芽试验结果。

具体实施方式

本发明提供了一种抗草甘膦基因，所述基因的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

在本发明中设计所述的抗草甘膦基因所使用的目的基因为

I.variabilis-EPSPS基因，所述目的基因的原始序列由华中农业大学刘子铎教授课题组克隆并提供(具体序列见博士论文新型草甘膦耐受性5-烯醇式莽草酸-3-磷酸合酶基因的克隆，纯化与鉴定，易沭远博士论文华中农业大学，2014December)。在本发明中，根据叶绿体的密码子偏爱性对所述目的基因进行优化，并将目的基因内部常用的酶切位点去除后获得本发明所述的如Seq ID No.1所示的抗草甘膦基因。所述优化的具体方法参照刘庆坡，薛庆中《粳稻叶绿体基因组的密码子用法》作物学报，2014，30,1220-1224种所述方法，具体的为选用叶绿体使用频率最高的同义密码子替换目的基因中相应的密码子。所述酶切位点包括amHI，BglI，BglII，ClaI，DraI，EcoICRI，EcoNI，EcoRV，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NheI，NotI，PacI，PstI，PvuII，SacI，SalI，SmaI，SpeI，XhoI，XmaI，NdeI和XbaI；所述常用酶切位点的去除方法为选用密码子使用频率相对较低的密码子替换目的基因中上述常用酶切位点的密码子。

本发明提供了所述的抗草甘膦基因在调控烟草对草甘膦抗性中的应用。具体的通过将所述的抗草甘膦基因转入到烟草植株中，增强烟草植株对草甘膦的抗性，使除草剂草甘膦可以应用于烟草杂草的去除。

本发明还提供了所述的抗草甘膦基因在培育转基因抗草甘膦烟草中的应用。

本发明提供了一种转基因抗草甘膦烟草的培育方法，包括以下步骤：

1)设计合成包含上述抗草甘膦基因的载体pAroAI.va*；

2)酶切步骤1)中所述的载体pAroAI.va*获得AroAI.va*基因片段；

3)将所述步骤2)中获得的AroAI.va*基因片段连接到叶绿体特异转化载体pZF6上，获得叶绿体转化载体pLSZ1；

4)利用基因枪粒子轰击技术将所述叶绿体转化载体pLSZ1轰击进入烟草幼嫩叶片获得携带AroAI.va*基因的叶片；

5)分化培养步骤4)中所述携带AroAI.va*基因的叶片获得转基因抗草甘膦烟草植株。

在本发明中，步骤1)中所述的载体pAroAI.va*的序列是根据叶绿体的密码子偏爱性对抗草甘膦EPSPS基因aroAI.va进行优化，并将aroAI.va内部的酶切位点去除后获得的；在本发明中，所述酶切位点包括amHI，BglI，BglII，ClaI，DraI，EcoICRI，EcoNI，EcoRV，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NheI，NotI，PacI，PstI，PvuII，SacI，SalI，SmaI，SpeI，XhoI，XmaI，NdeI和XbaI。在本发明中，优选的在所述aroAI.va基因序列的5’末端加入CAT，配合起始密码子ATG，形成NdeI内切酶识别位点序列，并且在3’末端加入A，形成XbaI内切酶识别位点序列，获得如Seq ID No.2所示的修饰后的aroAI.va基因序列，所修饰后的aroAI.va基因序列编码的氨基酸序列如Seq ID No.3所示。

本发明在获得载体pAroAI.va*后，对所述载体pAroAI.va*进行酶切获得AroAI.va*基因片段，所述酶切优选的为双酶切，所述双酶切用酶优选的为NdeI内切酶和XbaI内切酶，所述双酶切的温度和时间均采用本领域常规的酶切温度和时间，无其他特殊要求，能够实现酶切即可，具体的可为37℃，0.6～5h。

本发明将上述获得的AroAI.va*基因片段连接到叶绿体特异转化载体pZF6上，获得叶绿体转化载体pLSZ1。在本发明中，优选的先将所述AroAI.va*基因片段连接至中间载体pZF4上，获得连接有roAI.va*基因片段的中间载体pZF4；双酶切连接有aroAI.va*基因片段的中间载体pZF4，获得含有烟草叶绿体特异强启动子Prrn和特异终止子TrbcL的aroAI.va*基因表达盒；将aroAI.va*基因表达盒连接到叶绿体特异转化载体pZF6上，获得叶绿体转化载体pLSZ1。

所述的中间载体pZF4优选的含有烟草Prrn启动子和噬菌体T7g10的先导序列Prrn-T7g10。

所述Prrn启动子和噬菌体T7g10的先导序列Prrn-T7g10的核苷酸序列如Seq IDNo.4所示；3’末端加入TGC序列后，所述特异终止子rbcL3’UTR片段序列如Seq ID No.5所示；所述双酶切所用内切酶优选的为用Sac I和Hind III。在本发明上述的酶切和连接的温度和时间，根据所用酶的种类采用本领域常规酶切的温度和时间，无其他特殊要求，能够实现酶切和连接即可。

所述叶绿体转化载体pLSZ1的全长核苷酸序列如Seq ID No.6所示。本发明中，AroAI.va*基因片段插入位点相邻的5’基因组侧翼核苷酸序列如Seq ID No.7所示；3’基因组侧翼序列如SeqID No.9所示；插入基因核苷酸序列如Seq ID No.8所示。

本发明在获得了叶绿体转化载体pLSZ1后，利用基因枪粒子轰击技术将叶绿体转化载体pLSZ1轰击进入烟草幼嫩叶片获得携带AroAI.va*基因的叶片。

在本发明中，所述受体烟草品种优选的为Nicotiana Tabacum cv.Petit Havana，由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室提供。所述的烟草幼嫩叶片是由烟草种子培养发芽后获得的，所述烟草种子优选为灭菌的烟草种子，培养所述烟草种子的培养基优选的为含RM培养基。在本发明的实施例中，培养所述烟草种子时，实验室采用的培养器具优选的为平皿，所述烟草种子优选的被平铺在培养基上，培养发芽生成幼苗后转移至方盒中培养。在本发明中，所述培养至发芽的时间优选的为10～20d，更优选的为15d。本发明中幼苗转移至方盒后继续培养获得用于基因枪粒子轰击转化的幼嫩叶片，所述幼苗继续培养的时间优选的为20-25d，更优选的为22～24d。本发明中所述药草种子和幼苗的培养条件优选的为：光照16h黑暗8h；温度28℃/25℃；湿度50％。

本发明在进行基因枪粒子轰击之前优选的选取的幼嫩叶片，并将其平铺到无抗的RMOP培养基上；本发明所述的基因枪粒子轰击优选的在无菌条件下进行。

在本发明中，所述叶绿体转化载体pLSZ1在轰击之前优选的采用金粉包埋，所述金粉的直径优选的为0.55～0.65μm，更优选的为0.6μm；所述金粉用量优选的为2.8～3.0mg。在本发明中所述金粉优选的为金粉溶液，所述金粉溶液通过将金粉与EtOH振荡混合离心后，加水重悬获得金粉包埋的叶绿体转化载体pLSZ1。所述EtOH的体积优选的为500～700μL，更优选的为600μL；所述离心的转速优选的为4500～5500rpm，更优选的为5000rpm；所述重悬的次数优选的为1～3次，更优选的为2次。

在本发明中金粉包埋叶绿体转化载体的方法优选的为：将叶绿体转化载体与金粉溶液混合得到混合溶液，然后依次向混合溶液中加入CaCl₂和Spermindine振荡离心后，加入EtOH重悬。在本发明中，优选的在加入CaCl₂和Spermindine后均进行振荡；所述振荡在振荡器上进行，所述振荡的时间优选的为10～30s。在本发明中所述加入EtOH重悬的次数优选的为2～4次，更优选的为3次。

在本发明中，所述基因枪粒子轰击的轰击距离优选的为8.8～9.2cm，更优选的为9.0cm；所述基因枪粒子轰击的氦气压优选的为1,000～1,200psi，更优选的为1,100psi；所述基因枪粒子轰击的真空度优选的为22～27inches Hg，更优选的为25inches Hg。

本发明在完成基因枪粒子轰击后，优选的将轰击后的叶片置于暗条件下恢复培养，得到携带AroAI.va*基因的叶片。在本发明中，所述恢复培养的时间优选的为2～4h，更优选的为3h；所述恢复培养的温度优选为24～26℃，更优选的为25℃；所述湿度优选为45～55％，更优选为50％。

本发明在完成基因枪粒子轰击后分化培养携带AroAI.va*基因的叶片，获得转基因抗草甘膦烟草植株。具体的，本发明将轰击后的叶片切块平铺到培养基上进行第一分化培养和第二分化培养。在本发明中，所述叶片切块的大小优选的为5mm×5mm；所述第一分化培养用培养基优选为含450～550mg/L壮观霉素的RMOP培养基，更优选为含500mg/L壮观霉素的RMOP培养基；所述第一分化培养的时间优选的为4～6周，更优选的为5周。

本发明在所述第一分化培养结束后将得到的烟草幼苗进行第二分化培养，得到转基因抗草甘膦烟草植株。所述第二分化培养的培养基优选为含有壮观霉素、链霉素和草甘膦的RMOP培养基；其中所述壮观霉素的含量优选的为450～550mg/L，更优选的为500mg/L；所述链霉素的含量优选的为450～550mg/L，更优选的为500mg/L；所述草甘膦的含量优选的为45～55mg/L，更优选的为50mg/L。所述第二分化培养的时间优选的为4～6周，更优选的为5周。

本发明在分化培养后优选的对分化得到的幼苗进行生根培养，获得转基因抗草甘膦烟草植株。本发明所述生根培养采用本领域常规的生根培养条件即可，无其他特殊要求。

下面结合实施例对本发明提供的抗草甘膦基因以及转基因抗草甘膦烟草的培育方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

本发明所用目的基因I.variabilis-EPSPS是华中农业大学刘子铎教授课题组从细菌Isoptericola variabilis中克隆获得。用Nde I和Xba I双酶切含有叶绿体密码子优化过的aroAI.va*基因的载体pAroAI.va*，所述载体pAroAI.va*的结构示意图见图1，基础载体pUC57的序列长为2710bp，包括LacZ启动子，氨苄抗性位点，复制子rep(pMB1)，并在多克隆位点MCS插入序列长度为1384的目的基因aroAI.va*。酶切载体pAroAI.va*后，分离获得aroAI.va*基因片段并连接到中间载体pZF4上，然后用Sac I和Hind III双酶切含有烟草叶绿体特异强启动子Prrn和特异终止子TrbcL的aroAI.va*基因表达盒，最后连接到叶绿体特异转化载体pZF6上，获得叶绿体转化载体pLSZ1。

基因枪转化

幼嫩叶片获得：

材料准备，种子灭菌，6％的次氯酸钠暗下4℃保存；培养皿或培养盒；无菌水；1mL枪头和加样枪。

步骤

将种子放入2mL的离心管中(种子数量不超过0.5mL标记，50-100粒种子)加入600μL无水酒精和一滴Tween20，一分钟混合振荡后加入600μL6％次氯酸钠溶液混合3min。

以下步骤需在超净工作台里操作:

用1mL取样枪，去溶液，加入1mL无菌水，上下混合后吸取水溶液，漂洗6次，将漂洗好种子放置到RM培育基上，用封口膜包裹后，在4℃放置过夜，第二天放入光培室培养两个星期，当种子发芽后，转入组培的方盒中培养获得幼嫩叶片。

金粉溶液的制备：

称2.8mg金粉，加入600μLEtOH，在振荡器上最大频率振荡1min，离心至5000r/min(使用EppendorfMiniSpin)，用200μL枪头吸取溶液，再加入600μLH₂O，用200μL或1mL枪头吹打重悬金粉(注意不要用手紧紧握住整个离心管，而是应该仅用两个手指拿住，避免温度过高)，离心至5000r/min，用200μL枪头吸取溶液(此时金粉应附在管壁的一侧)加入350μLH2O，用200μL枪头吹打重悬。

金粉溶液包裹载体

1、向两个4℃冰浴的离心管中分别加入172μL金粉溶液，

2、再每管分别依次加入20μg DNA(10μL)，震荡；

3、加入175μL CaCl₂(-20℃保存)；震荡；

4、然后加入35μL Spermindine，震荡；

5、在冰上放置10min，每分钟在振荡器上振荡10s；

6、冰上放置后，离心至3500r/min，

7、用200μL枪头完全吸取溶液，

8、加入600μL EtOH，200μL枪头重悬；

9、离心至5000r/min，吸取上清

10、加入600μL EtOH，200μL枪头重悬

11、离心至5000r/min，去上清

12、加入50μL EtOH重悬

13、取6.5μL放在载片上的中间，酒精挥发，金粉包裹的载体就留在载片上。

将灭菌的烟草种子均匀平铺在含RM培养基(Zhou et al 2008)的平皿上发芽15d后，将幼苗转移至小方盒中继续培养20-25d，用于基因枪转化。培养条件：光照16h黑暗8h；温度28℃/25℃；湿度50％(Zhou et al 2008)。

选取长势良好的幼嫩叶片，平铺到无抗的RMOP培养基上；在无菌条件下通过基因枪粒子轰击技术将金粉包埋好的转化载体轰击进入烟草幼嫩叶片中，轰击参数为：金粉直径0.6μm；轰击距离9cm；氦气压1,100psi；真空度25inches Hg。将转化的烟草幼嫩叶片置于暗下恢复培养3h。

在无菌条件下将烟草叶子切成5mm×5mm大小，均匀平铺到含有500mg/L壮观霉素的RMOP培养基上培养5周，培养条件同上。待长出抗性幼苗后，再转至含有500mg/L壮观霉素和500mg/L链霉素的RMOP培养基及50mg/L草甘膦上进行二次分化再生。经连续两轮分化再生后，将再生烟草幼苗转移至RM培养基的小方盒中，进行生根，并移栽至温室，继续培养获得转基因抗草甘膦烟草植株pLSZ1#1、pLSZ1#2和pLSZ3#2。

实施例2

实施例1中获得的转基因抗草甘膦烟草植株I.variabilis-EPSPS*定点整合以及同质化检测

利用Southern杂交对I.variabilis-EPSPS*家系进行I.variabilis-EPSPS*分析。植物叶片总DNA的抽提及Southern杂交的分析方法参照实验室的操作手册。用Bgl II酶切10μg烟草基因组DNA，以经地高辛标记的PCR合成的psaB为探针，进行Southernblotting检测；所述psaB探针的上游引物psaB-F序列如Seq ID No.10所示；所述psaB探针的下游引物psaB-R序列如Seq ID No.11所示。预期野生型的烟草的杂交条带大小约3.5kb，外源基因整合成功的pLSZ1载体的叶绿体转化株的杂交带大小约6.8kb，且达到同质化的转基因植株中不会出现与野生型一样大小的杂交带(见图2)。经检测发现pLSZ1#1达到了同质化(见图3)。

实施例3：实施例1中转基因抗草甘膦烟草植株的发芽及同质化验证

为了进一步验证转化植株是否达到了同质化，取转化植株的种子进行发芽测试，理论上同质化的转化植株在抗生素培养基上均能发芽且不会发生性状分离。发芽结果显示：对照野生型，转aroA_I.va*叶绿体转化植株烟草pLSZ1#2的T1代种子在不含抗性的培养基上萌发正常，但在含壮观霉素的培养基上萌发的出现部分白化苗，表明pLSZ1#2为异质化植株。转aroA_I.va*叶绿体转化植株烟草pLSZ1#1的T1代种子在含500mg/L的壮观霉素，以及不含抗性的培养基上均能正常萌发成绿色幼苗，且没有性状分离(如图4所示)。该结果进一步证实了转化植株pLSZ1#1达到了同质化，且获得的性状能够稳定的遗传。

实施例4：实施例1中转基因抗草甘膦烟草植株的Northernblotting检测为了检测不同启动子驱动下，目的基因aroA_I.va*的表达情况，进行Northern>I.va*为探针进行杂交。所述Northern>I.va*烟草在靠近1.38kb的RNAMarker附近有杂交条带，与预期的1.4kb的转录本大小接近(见图5)，其余两条更大的条带是由于通读所产生的。

实施例5：实施例1中转基因抗草甘膦烟草植株的蛋白表达

分别取野生型、pLSZ1#1的植物蛋白5μg跑SDS-PAGE胶(图6)，利用I.variabilis-EPSPS多克隆抗体，通过Western blotting对aroA_I.va*基因在pLSZ1#1中的翻译进行检测，结果显示确认aroA_I.va*基因在pLSZ1#1和pLSZ3#2中均可翻译成蛋白(见图6)，野生型中无该特异蛋白的表达。

实施例6：实施例1中转基因抗草甘膦烟草植株的草甘膦耐受度试验

为了检测新型耐草甘膦基因aroA_I.va*转基因烟草对草甘膦的抗性如何，对转基因烟草进行了草甘膦抗性试验。将野生型烟草和转基因烟草的种子消毒后分别接种到100μmol/L，300μmol/L，600μmol/L，3mmol/L，6mmol/L草甘膦的RM发芽培养基上培养10d后，观察种子的萌发状况。如图7所示结果：在含有100μmol/L的草甘膦的RM培养基上，pLSZ1#1转化系正常发芽，而野生型烟草的T1代种子的子叶发育明显减缓，生长缓慢；当将草甘膦的浓度升至300μmol/L、600μmol/L、3mmol/L、6mmol/L时，pLSZ1#1仍具有强的抗性。

将草甘膦浓度提升到10、11、12、30mmol/L，对pLSZ1#1进一步进行测试，结果如图8显示在12mmol/L时，pLSZ1#1出现了部分白化，在30mmol/L时，pLSZ1#1、pLSZ3#2基本完全白化。

结果表明密码子优化的新型耐草甘膦基因aroA_I.va*，相比实验室前期培育的aroA_J.limo叶绿体转化植株，pLSZ1#1抗性显著提高40倍以上，均可以耐受11mmol/L草甘膦。

本发明提供的抗草甘膦基因能够连接到叶绿体特异性转化载体上，通过基因枪轰击技术转入烟草嫩叶的叶绿体中获得转基因抗草甘膦烟草植株，本发明所提供的转基因抗草甘膦烟草植株中的抗草甘膦基因不随花粉漂移，确保转基因抗草甘膦烟草植株的生物安全性，根据实施例记载，转基因抗草甘膦烟草pLSZ1#1植株达到了同质化，且获得的性状能够稳定的遗传，转基因抗草甘膦烟草pLSZ1#1抗性显著提高40倍以上，可以耐受11mmol/L草甘膦。

实施例7

本发明所用目的基因I.variabilis-EPSPS是华中农业大学刘子铎教授课题组从细菌Isoptericola variabilis中克隆获得。用Nde I和Xba I双酶切含有叶绿体密码子优化过的aroAI.va*基因的载体pAroAI.va*，所述载体pAroAI.va*的结构示意图见图1，基础载体pUC57的序列长为2710bp，包括LacZ启动子，氨苄抗性位点，复制子rep(pMB1)，并在多克隆位点MCS插入序列长度为1384的目的基因aroAI.va*。酶切载体pAroAI.va*后，分离获得aroAI.va*基因片段并连接到中间载体pZF4上，然后用Sac I和Hind III双酶切含有烟草叶绿体特异强启动子Prrn和特异终止子TrbcL的aroAI.va*基因表达盒，最后连接到叶绿体特异转化载体pZF6上，获得叶绿体转化载体pLSZ1。

基因枪转化

幼嫩叶片获得：

材料准备，种子灭菌，6％的次氯酸钠暗下4℃保存；培养皿或培养盒；无菌水；1mL枪头和加样枪。

步骤

将种子放入2mL的离心管中(种子数量不超过0.5mL标记，80粒种子)加入600μL无水酒精和一滴Tween20，一分钟混合振荡后加入600μL 6％次氯酸钠溶液混合3min。

以下步骤需在超净工作台里操作

用1mL取样枪，去溶液，加入1mL无菌水，上下混合后吸取水溶液，漂洗6次，将漂洗好种子放置到RM培育基上，用封口膜包裹后，在4℃放置过夜，第二天放入光培室培养两个星期，当种子发芽后，转入组培的方盒中培养获得幼嫩叶片。

金粉溶液的制备：

称3mg金粉，加入600μL EtOH，在振荡器上最大频率振荡1min，离心至5000r/min(使用EppendorfMiniSpin)，用200μL枪头吸取溶液，再加入600μL H₂O，用1mL枪头吹打重悬金粉(注意不要用手紧紧握住整个离心管，而是应该仅用两个手指拿住，避免温度过高)，离心至5000r/min，用200μL枪头吸取溶液(此时金粉应附在管壁的一侧)加入350μL>

金粉溶液包裹载体

10、向两个4℃冰浴的离心管中分别加入172μL金粉溶液，

11、再每管分别依次加入20μg DNA(10μL)，震荡；

12、加入175μLCaCl₂(-20℃保存)；震荡；

13、然后加入35μL Spermindine，震荡；

14、在冰上放置10min，每分钟在振荡器上振荡10s；

15、冰上放置后，离心至3500r/min，

16、用200μL枪头完全吸取溶液，

17、加入600μL EtOH，200μL枪头重悬；

18、离心至5000r/min，吸取上清

10、加入600μL EtOH，200μL枪头重悬

11、离心至5000r/min，去上清

12、加入50μL EtOH重悬

13、取6.5μL放在载片上的中间，酒精挥发，金粉包裹的载体就留在载片上。

将灭菌的烟草种子均匀平铺在含RM培养基(Zhou et al 2008)的平皿上发芽15d后，将幼苗转移至小方盒中继续培养24d，用于基因枪转化。培养条件：光照16h黑暗8h；温度28℃/25℃；湿度50％(Zhou et al 2008)。

选取长势良好的幼嫩叶片，平铺到无抗的RMOP培养基上；在无菌条件下通过基因枪粒子轰击技术将金粉包埋好的转化载体轰击进入烟草幼嫩叶片中，轰击参数为：金粉直径0.6μm；轰击距离9cm；氦气压1,100psi；真空度25inches Hg。将转化的烟草幼嫩叶片置于暗下恢复培养3h。

在无菌条件下将烟草叶子切成5mm×5mm大小，均匀平铺到含有500mg/L壮观霉素的RMOP培养基上培养5周，培养条件同上。待长出抗性幼苗后，再转至含有500mg/L壮观霉素和500mg/L链霉素的RMOP培养基及50mg/L草甘膦上进行二次分化再生。经连续两轮分化再生后，将再生烟草幼苗转移至RM培养基的小方盒中，进行生根，并移栽至温室，继续培养获得转基因抗草甘膦烟草植株。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种抗草甘膦基因以及转基因抗草甘膦烟草的培育方法

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1380

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgactcctg ctcctgcttc tcctgatgct acttctccag ctcctgcatc tgaagctcct 60

tgggaagctc ctgttgctcc tggagaatta gatgctactg ttgaaattcc tggatctaaa 120

tctttaacta atagattact tgtattagca gctttagctg atggacctgg agttcttaga 180

ggagctttac gtagtagaga tgctgattta atgattgctg cattaagagc tttaggagct 240

gagattactg aaggaactga accttctact ttacatgtta ctcctggacc tgttcgtgga 300

gatgttgatg tatttactgg attagctgga actgttatga gatttcttcc accagttgct 360

gctttagctg atggacctgt tagatttgat ggagatcctg aagctagagt tagacctatg 420

ttacctgttt tagctgcatt acgtgcttta ggagttaaag ttactggaga tggacctgac 480

tttccttctc atcttccatt cactgttcat ggtaaaggat ctttaagagg aggtgctgtt 540

gatgttgatg cttctgcttc tagtcaattc gtatctggat tacttttagc tgcacctcgt 600

tttgacgatg gattagcttt aagacatatt ggagctactt taccttctct tcctcatatt 660

gaaatgactg tagctacttt aagagaagtt ggagttgctg tagacgatag tagagatgga 720

atatggcatg tttctcctgg agctatttct gctagagatg taagagttga acctgattta 780

tctaatgctg ctccatttct tgcagctgca ttagcagctg gtggaactgt tagagttcct 840

ggatggcctg cttctacaac tcaacctgga gctatggttc ctgaattact tgaacgtatg 900

ggtggaagag ttactgtaga acatactgct gacgatggaa cttctgtttt agctgttact 960

ggaactggag aaattcatgg aattgatgta gatttacatg cagctggaga attagctcct 1020

acttttgctg cacttgctgc attagctgat tctcctagta gattaagagg aattgctcat 1080

cttagaggac atgaaactga tagattagct gcattagcta ctgaaattac tagacttgga 1140

ggtagatgtg aagagactag agatggatta gttattactc caagacctct tcatggagct 1200

acatttagaa cttatgctga tcatagaatg gcaacttctg ctgctgtatt aggattaaga 1260

gttcctggag ttcaagttga gaatgttgga acaactgcta aaactttacc tggatttgat 1320

agaatgtggg aaagaatgtt agctgctgga agaactgttg gagctggagc ttaagtctag 1380

<210> 2

<211> 1384

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catatgactc ctgctcctgc ttctcctgat gctacttctc cagctcctgc atctgaagct 60

ccttgggaag ctcctgttgc tcctggagaa ttagatgcta ctgttgaaat tcctggatct 120

aaatctttaa ctaatagatt acttgtatta gcagctttag ctgatggacc tggagttctt 180

agaggagctt tacgtagtag agatgctgat ttaatgattg ctgcattaag agctttagga 240

gctgagatta ctgaaggaac tgaaccttct actttacatg ttactcctgg acctgttcgt 300

ggagatgttg atgtatttac tggattagct ggaactgtta tgagatttct tccaccagtt 360

gctgctttag ctgatggacc tgttagattt gatggagatc ctgaagctag agttagacct 420

atgttacctg ttttagctgc attacgtgct ttaggagtta aagttactgg agatggacct 480

gactttcctt ctcatcttcc attcactgtt catggtaaag gatctttaag aggaggtgct 540

gttgatgttg atgcttctgc ttctagtcaa ttcgtatctg gattactttt agctgcacct 600

cgttttgacg atggattagc tttaagacat attggagcta ctttaccttc tcttcctcat 660

attgaaatga ctgtagctac tttaagagaa gttggagttg ctgtagacga tagtagagat 720

ggaatatggc atgtttctcc tggagctatt tctgctagag atgtaagagt tgaacctgat 780

ttatctaatg ctgctccatt tcttgcagct gcattagcag ctggtggaac tgttagagtt 840

cctggatggc ctgcttctac aactcaacct ggagctatgg ttcctgaatt acttgaacgt 900

atgggtggaa gagttactgt agaacatact gctgacgatg gaacttctgt tttagctgtt 960

actggaactg gagaaattca tggaattgat gtagatttac atgcagctgg agaattagct 1020

cctacttttg ctgcacttgc tgcattagct gattctccta gtagattaag aggaattgct 1080

catcttagag gacatgaaac tgatagatta gctgcattag ctactgaaat tactagactt 1140

ggaggtagat gtgaagagac tagagatgga ttagttatta ctccaagacc tcttcatgga 1200

gctacattta gaacttatgc tgatcataga atggcaactt ctgctgctgt attaggatta 1260

agagttcctg gagttcaagt tgagaatgtt ggaacaactg ctaaaacttt acctggattt 1320

gatagaatgt gggaaagaat gttagctgct ggaagaactg ttggagctgg agcttaagtc 1380

taga 1384

<210> 3

<211> 457

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Pro Asp Ala Thr Ser Pro Ala Pro Ala

1 5 1015

Ser Glu Ala Pro Trp Glu Ala Pro Val Ala Pro Gly Glu Leu Asp Ala

202530

Thr Val Glu Ile Pro Gly Ser Lys Ser Leu Thr Asn Arg Leu Leu Val

354045

Leu Ala Ala Leu Ala Asp Gly Pro Gly Val Leu Arg Gly Ala Leu Arg

505560

Ser Arg Asp Ala Asp Leu Met Ile Ala Ala Leu Arg Ala Leu Gly Ala

65707580

Glu Ile Thr Glu Gly Thr Glu Pro Ser Thr Leu His Val Thr Pro Gly

859095

Pro Val Arg Gly Asp Val Asp Val Phe Thr Gly Leu Ala Gly Thr Val

100 105 110

Met Arg Phe Leu Pro Pro Val Ala Ala Leu Ala Asp Gly Pro Val Arg

115 120 125

Phe Asp Gly Asp Pro Glu Ala Arg Val Arg Pro Met Leu Pro Val Leu

130 135 140

Ala Ala Leu Arg Ala Leu Gly Val Lys Val Thr Gly Asp Gly Pro Asp

145 150 155 160

Phe Pro Ser His Leu Pro Phe Thr Val His Gly Lys Gly Ser Leu Arg

165 170 175

Gly Gly Ala Val Asp Val Asp Ala Ser Ala Ser Ser Gln Phe Val Ser

180 185 190

Gly Leu Leu Leu Ala Ala Pro Arg Phe Asp Asp Gly Leu Ala Leu Arg

195 200 205

His Ile Gly Ala Thr Leu Pro Ser Leu Pro His Ile Glu Met Thr Val

210 215 220

Ala Thr Leu Arg Glu Val Gly Val Ala Val Asp Asp Ser Arg Asp Gly

225 230 235 240

Ile Trp His Val Ser Pro Gly Ala Ile Ser Ala Arg Asp Val Arg Val

245 250 255

Glu Pro Asp Leu Ser Asn Ala Ala Pro Phe Leu Ala Ala Ala Leu Ala

260 265 270

Ala Gly Gly Thr Val Arg Val Pro Gly Trp Pro Ala Ser Thr Thr Gln

275 280 285

Pro Gly Ala Met Val Pro Glu Leu Leu Glu Arg Met Gly Gly Arg Val

290 295 300

Thr Val Glu His Thr Ala Asp Asp Gly Thr Ser Val Leu Ala Val Thr

305 310 315 320

Gly Thr Gly Glu Ile His Gly Ile Asp Val Asp Leu His Ala Ala Gly

325 330 335

Glu Leu Ala Pro Thr Phe Ala Ala Leu Ala Ala Leu Ala Asp Ser Pro

340 345 350

Ser Arg Leu Arg Gly Ile Ala His Leu Arg Gly His Glu Thr Asp Arg

355 360 365

Leu Ala Ala Leu Ala Thr Glu Ile Thr Arg Leu Gly Gly Arg Cys Glu

370 375 380

Glu Thr Arg Asp Gly Leu Val Ile Thr Pro Arg Pro Leu His Gly Ala

385 390 395 400

Thr Phe Arg Thr Tyr Ala Asp His Arg Met Ala Thr Ser Ala Ala Val

405 410 415

Leu Gly Leu Arg Val Pro Gly Val Gln Val Glu Asn Val Gly Thr Thr

420 425 430

Ala Lys Thr Leu Pro Gly Phe Asp Arg Met Trp Glu Arg Met Leu Ala

435 440 445

Ala Gly Arg Thr Val Gly Ala Gly Ala

450 455

<210> 4

<211> 143

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctcccccgc cgtcgttcaa tgagaatgga taagaggctc gtgggattga cgtgaggggg 60

cagggatggc tatatttctg ggagggagac cacaacggtt tcccactaga aataattttg 120

tttaacttta agaaggagat ata 143

<210> 5

<211> 214

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtagacatta gcagataaat tagcaggaaa taaagaagga taaggagaaa gaactcaagt 60

aattatcctt cgttctctta attgaattgc aattaaactc ggcccaatct tttactaaaa 120

ggattgagcc gaatacaaca aagattctat tgcatatatt ttgactaagt atatacttac 180

ctagatatac aagatttgaa atacaaaatc tagc 214

<210> 6

<211> 8451

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaccctaaaa tagtttggca aaacaagatg ttgcggagac aggatttgaa cccgtgacct 60

caaggttatg agccttgcga gctaccaaac tgctctaccc cgcgccgaag ataagaactg 120

aaaactaata gataaacaag gattaaatgc gcccctccac cctatctgta caaatagaat 180

agcccattta tacagaatgg taaaggggct tctatgatca tcgaccatag aaatagaaat 240

gaagcgttaa tccttaccaa cttgatcttg ttgctcctgg caacaaacat gcatgaacca 300

tttcacgaag tatgtgtccg gatagtccaa agtctcgata gttagctctc ggccttccgg 360

tcaaaaaaca acgtcgatga aggcgtgtag gtgcactatt ccgtggtggg gattgtaact 420

ttccataaat ttcccatttg tcactcaacg acggaacctt gcttatttct ttctttgagg 480

atcgacgaat cgaatgatat ttctgttcca atttttgcct cttcttctcc ctctgaatca 540

aacttttcct tgccataatg gttgaattcc tattagtatc catgatacaa gtcgaatcct 600

agatgtagaa atagaagaag gtggaccccc tctccgtcga aagaaatgag attatcgcag 660

atacacacat taaaaatatt aaccaaattt gcccgacgta gaggcaatca agaaagccgc 720

ataagtgaat atataaccta cagaaaagtg agctaatcca accaatcttg cttgtacaat 780

ggaaagggcc actggtttat ctctccagcg aatcaaattg gccaaaggtg tgcgttcatg 840

agcccatgct aaagtttcaa tcaattcctg ccaatatcca cgccaagaaa ttaagaacat 900

aaatccagta gcccaaacaa gatgtccaaa taagaacatc catgcccaaa ccgataaact 960

attcatacca aaaggattat atccgttgat aagttgtgaa gagtttaacc ataaataatc 1020

ccttaaccag cccatcaaat aagtggaaga ttcattaaac tgtgaaacgt taccctgcca 1080

taatgtgatg tgcttccaat gccaataaaa agtaacccat ccaatagtat ttaacatcca 1140

aaaaactgcc aaataaaacg cgtcccatgc cgaaatatca caagtaccgc ctcgtcctgg 1200

gccatcgcac ggaaaactat aaccgaaatc ctttttatct ggcattaact tggaaccacg 1260

tgcatctaaa gcacctttta ctaagatcaa tgtagttgta tgtaaaccaa gagcaatagc 1320

atgatgaacc aaaaagtctc caggacctat tgttaaaaat aatgaattac tattttcatt 1380

aacagcattt aaccaacccg gcaaccagat gcttcgaccc gcattgaatg ctggaccact 1440

cgttgaagat aaaagtacat cgaacccata tgaagtttta ccatgagcgg attgtatcca 1500

ttgagcaaat ataggttcaa tcaagatttg cttctccgga gtgccaaagg caagcatgac 1560

atcattatga acataaagtc ccagggtatg gaatcccaga aagaggctgg cccaacttaa 1620

atgagatatg atagcttctt tatgctctaa cattcttgcc aatacattat cttcattttg 1680

ctccggattg taatctctaa tgaaaaatat agctccatga gcaaaagctc ctgtcatgat 1740

gaatcctgcg atatattggt ggtgggtata taatgcagct tgagtagtaa agtcttgtgc 1800

tatgaatgca taagcaggta aagagtacat gtgttgagct accaaagaag taataacccc 1860

taaagaagct agagcaaggc tccaattcgc cctatagtga gtcgtattac gcgcgctcac 1920

tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc 1980

ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc 2040

cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatgggacgc gccctgtagc ggcgcattaa 2100

gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc 2160

ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag 2220

ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca 2280

aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc 2340

gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa 2400

cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct 2460

attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa 2520

cgcttacaat ttaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt 2580

tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca 2640

ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt 2700

ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga 2760

tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa 2820

gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct 2880

gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat 2940

acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga 3000

tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc 3060

caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat 3120

gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa 3180

cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac 3240

tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa 3300

agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc 3360

tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc 3420

ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag 3480

acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta 3540

ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa 3600

gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc 3660

gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat 3720

ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga 3780

gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt 3840

ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata 3900

cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac 3960

cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg 4020

ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg 4080

tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag 4140

cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct 4200

ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc 4260

aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt 4320

ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg 4380

tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga 4440

gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg 4500

gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg 4560

caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct 4620

tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta 4680

tgaccatgat tacgccaagc tcgaaattaa ccctcactaa agggaacaaa agctggtgat 4740

tagcgtaccc gttgtatttg cttctcctga tggctggtca agtaacaaaa atgttgtatt 4800

ttctggtaca tccttatgga ttggattagt ctttctggtg ggtatcctta attctctcat 4860

ctcttgaacc tattcgtcgc agacccaaaa ccaaaatgac ccccctaatt tttctcggtt 4920

gtgagacaca ttaaattgga atctaagtcc ccaaagaaaa cgcaaatcaa ataaagaaaa 4980

caaaaaaatt agaggggggt caaacttctt gaataaaaag aatacaatta aaaaaataat 5040

tggaatcgtt ccgaagagaa tatgtgtccc ggcactgcac aaaaaagatc cggttatata 5100

tcatatatgt gggtacatat tgtgtatcaa gaacaaaaaa atgcggatat ggtcgaatgg 5160

taaaatttct ctttgccaag gagaagatgc gggttcgatt cccgctatcc gcccaagatc 5220

caagataaag taattttatt actatttatt tattatttaa tttcataaat agcattaaat 5280

atatccttaa attaaggatt tggtatagtt ggccgtgata gtgtagtgat tctatccctc 5340

ccctacgttt tctttttcct tccaccccca aaaagcgaaa ggcgggaatt aattactaga 5400

aacaaataca aaatcaaaat agaatactca atcatgaata aatgcaagaa aataacctct 5460

ccttcttttt ctataatgta aacaaaaaag tctatgtaag taaaatacta gctagtaaat 5520

aaataaaaag aaaaaaagaa aggagcaata gcaccctctt gatagaacaa gaaaatgatt 5580

attgctcctt tcttttcaaa acctcctata gactaggcca ggatcgctct agctagacat 5640

tatttgccga ctaccttggt gatctcgcct ttcacgtagt ggacaaattc ttccaactga 5700

tctgcgcgcg aggccaagcg atcttcttct tgtccaagat aagcctgtct agcttcaagt 5760

atgacgggct gatactgggc cggcaggcgc tccattgccc agtcggcagc gacatccttc 5820

ggcgcgattt tgccggttac tgcgctgtac caaatgcggg acaacgtaag cactacattt 5880

cgctcatcgc cagcccagtc gggcggcgag ttccatagcg ttaaggtttc atttagcgcc 5940

tcaaatagat cctgttcaag aaccggatca aagagttcct ccgccgctgg acctaccaag 6000

gcaacgctat gttctcttgc ttttgtcagc aagatagcca gatcaatgtc gatcgtggct 6060

ggctcgaaga tacctgcaag aatgtcattg cgctgccatt ctccaaattg cagttcgcgc 6120

ttagctggat aacgccacgg aatgatgtcg tcgtgcacaa caatggtgac ttctacagcg 6180

cggagaatct cgctctctcc aggggaagcc gaagtttcca aaaggtcgtt gatcaaagct 6240

cgccgcgttg tttcatcaag ccttacggtc accgtaacca gcaaatcaat atcactgtgt 6300

ggcttcaggc cgccatccac tgcggagccg tacaaatgta cggccagcaa cgtcggttcg 6360

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tag 663

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