公开/公告号CN108823144A
专利类型发明专利
公开/公告日2018-11-16
原文格式PDF
申请/专利权人 中国医学科学院微循环研究所;
申请/专利号CN201810413851.7
申请日2018-05-03
分类号
代理机构北京轻创知识产权代理有限公司;
代理人杨立
地址 100005 北京市东城区东单三条5号微循环所
入库时间 2023-06-19 07:15:35
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2019-08-02
授权
授权
2018-12-11
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N5/071 申请日:20180503
实质审查的生效
2018-11-16
公开
公开
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及抑制内皮细胞迁移的外泌体活性制剂及其制备方法和应用。
背景技术
细胞迁移在人体正常生理活动和疾病发生中普遍存在，如胚胎发生、损伤修复、免疫应答、癌症转移等过程中均涉及到细胞迁移。血管生成在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用，血管内皮细胞的迁移是血管生成的关键步骤之一。肿瘤的发生伴随着血管的生成为其提供营养物质，研究血管内皮细胞迁移的抑制对于肿瘤治疗也有重要的意义，目前，靶向血管内皮生成因子的抗肿瘤血管生成疗法引起了多种形式的不良反应和抗性，科学家们正在为其寻找新的替代途径。
随着细胞外泌体的研究日益深入，外泌体药物制剂越来越成为疾病治疗研究的热点，外泌体是一种由活细胞分泌并释放到胞外环境中、大小在60-100nm的运输膜泡，外泌体以其天然的物质转运特性、相对较小的分子结构和优良的生物相容性，可递送化学药物、蛋白质及肽配基和基因药物等多种药物，在药物载体的领域具有巨大的潜力。对于药物载体的选择,有两个基本原则:保护内含的药物在体内环境中仍保持活性；在不引发机体对药物载体产生免疫反应的情况下释放内含物。较之现有的药物载体(如人工制造的脂质体),外泌体有其显著的优越性。首先,外泌体有自身天然的内含物,可以转移至受体细胞并功能性改变受体细胞,且不同来源的外泌体表面分子不一样,对受体细胞有一定选择性,在治疗上更有利。其次,相对于脂质体对亲水性物质较低的包装效率,其在递送核酸方面受到限制,而外泌体可以更好地亲和核酸分子,显著提高包装效率。再则,较之人工制造的药物载体,特殊细胞[比如未成熟的DC细胞或者是充间质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)]来源的外泌体,由于它们特殊的表面分子能够避免与调理素蛋白、抗体、凝血因子等产生相互作用,从而避免了体内产生免疫反应。
鉴于外泌体药物的优点，抑制内皮细胞迁移的外泌体活性制剂有望为肿瘤治疗开拓新的思路。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供抑制内皮细胞迁移的外泌体活性制剂及其制备方法和应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：抑制内皮细胞迁移的外泌体活性制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)分离原代脐带静脉内皮细胞并进行细胞培养及传代；
(2)向传代培养的内皮细胞培养液中加入山莨菪碱对内皮细胞进行预处理，然后更换新的内皮细胞培养液并加入TNF-α继续培养内皮细胞；
(3)自内皮细胞培养后得到的含TNF-α的内皮细胞培养液中提取外泌体；
(4)外泌体鉴定。
进一步，所述传代培养的内皮细胞为3-5代内皮细胞。
进一步，所述内皮细胞培养液为基础培养基中添加无外泌体胎牛血清、青霉素、链霉素和内皮生长因子至终浓度分别为0.05mg/mL、0.01mg/mL、0.01mg/mL和0.01mg/mL。
进一步，步骤(2)中加入山莨菪碱后的内皮细胞培养液中，所述山莨菪碱的浓度为1.5×10-2―1.5×10-3ng/mL，加入山莨菪碱后，预处理的时间为3-5小时。
进一步，步骤(2)中加入TNF-α后的内皮细胞培养液中，所述TNF-α的浓度为5-15ng/mL，加入TNF-α后内皮细胞培养的时间为18-30小时。
进一步，所述所述步骤(3)中提取外泌体的具体步骤为：收集步骤(2)中内皮细胞培养后得到的含有TNF-α的内皮细胞培养液上清，300g、4℃、离心10分钟，取上清液，16500g、4℃、离心20分钟，取上清液经0.2μm孔径滤膜过滤，取滤液经120000g、4℃、离心2小时，去上清，将沉淀溶于0.01M的PBS缓冲液。
进一步，所述步骤(4)中外泌体的鉴定包括观察外泌体透射电镜形态，分析外泌体粒径及外泌体蛋白定量。
进一步，本发明提供了用以上制备方法制得的抑制内皮细胞迁移的外泌体活性制剂。
本发明的有益效果是：经本发明制备方法制得的外泌体能够抑制内皮细胞的迁移，且制备方法简单。
进一步，本发明提供了抑制内皮细胞迁移的外泌体活性制剂在制备抑制肿瘤血管生成的抗肿瘤药物中的应用。
采用上述进一步方案的有益效果是抑制血管内皮细胞迁移对肿瘤的治疗起到重要作用，外泌体药物相比普通药物对受体细胞有一定的选择性且递送效率更高。
附图说明
图1A和图1B为本发明实验组NT10外泌体的透射电镜图，其中图1A中的标尺为200nm，图1B中的标尺为100nm；
图2A和图2B为本发明用Apogee纳米流式细胞仪检测散射光通道检测外泌体的粒径结果，检测时的设门范围为50～110nm,其中图2A为180nm、240nm、300nm、590nm、880nm和1300nm标准微球混合物的检测结果直方图，图2B为本发明实验组NT10外泌体检测结果直方图；
图3A、图3B、图3C、图3D、图3E、图3F为本发明划痕实验显微镜下内皮细胞迁移图，其中图3A、3B、3C分别为0小时时空白对照组B、阴性对照组C和实验组NT10的内皮细胞，图3D、3E、3F分别为13.5小时时空白对照组B、阴性对照组C和实验组NT10的内皮细胞。
图4为本发明划痕实验使用Image-Pro Plus 6.0软件测定单个视野划痕内的细胞平均迁移距离图。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1原代内皮细胞培养及传代培养
采集健康产妇脐带，以胶原酶消化方法分离得到原代脐带静脉内皮细胞，进行原代细胞培养。内皮细胞培养液配制方法：内皮细胞基础培养液中加入无外泌体胎牛血清、内皮细胞生长因子、青霉素和链霉素，其中胎牛血清、内皮生长因子、青霉素和链霉素的终浓度分别为0.05mg/mL、0.01mg/mL、0.01mg/mL和0.01mg/mL；细胞培养器材：培养瓶、培养皿和培养板；细胞培养条件：无菌、37℃、5％CO2、饱和湿度，隔天换液。
将原代内皮细胞培养2～3天进行传代，细胞传代消化液包括0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA。取出细胞培养瓶，拧紧瓶盖，倒置显微镜下观察细胞状态和汇合度，在超净工作台中进行接下来操作，吸弃旧培养基，加入少许PBS润洗两遍，以去掉残留培养基中的血清，吸弃PBS，再加入适量消化液，以覆盖细胞单层为宜，倒置显微镜下观察消化进度，待细胞回缩变圆，呈球状后即吸弃消化液；加入适量完全培养基以中和残留消化液，吸管吹打均匀，倒置显微镜下观察消化后情况；按1:2～1:3比例分瓶传代，并分别补足完全培养基的量，然后拧紧培养瓶盖，将细胞铺散均匀，然后拧松培养瓶半圈，置于CO2培养箱中正常培养。
实施例2外泌体制备
实验分为两组，分别为实验组NT10和对照组C。取3～5代的内皮细胞至10cm培养皿生长至汇合，其中实验组NT10内皮细胞培养液中加入终浓度为1.5×10-2―1.5×10-3ng/mL的山莨菪碱预处理4小时，吸弃上清以去除山莨菪碱，更换新的配皮细胞培养液，加入终浓度为5-15ng/mL的TNF-α继续培养内皮细胞18-30小时。对照组C内皮细胞不进行山莨菪碱预处理以及TNF-α处理。
本实施例中山莨菪碱为购自杭州民生药业有限公司的消旋山莨菪碱片。
实施例3外泌体提取纯化
收集内皮细胞培养后得到的含有TNF-α的内皮细胞培养液上清，300g、4℃、离心10分钟，取上清液，16500g、4℃、离心20分钟，取上清液经0.2μm孔径滤膜过滤，取滤液经120000g、4℃、离心2小时，去上清，将沉淀溶于100μL 0.01M的PBS缓冲液，得到抑制内皮细胞迁移的外泌体活性制剂。
实施例4外泌体鉴定
采用透射电镜观察外泌体形态，结果如图1A和1B所示，实验组得到的外泌体为形态均一的直径略小于100nm且具有清晰膜的茶杯托样结构的小体，为典型外泌体透射电镜形态。
采用Apogee纳米流式细胞仪散射光通道检测外泌体粒径，结果如图2A和2B所示，图2B显示得到的外泌体在50-110nm设门范围内只有一个峰，表明得到的外泌体纯度较高，没有杂质。
采用BCA方法进行外泌体蛋白定量，结果如表1所示，实验组产生的外泌体浓度略低于对照组外泌体的浓度。
表1
实施例6不同来源外泌体对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)迁移的影响
使用“划痕法”检测HUVECs的迁移，12孔板培养HUVECs至汇合，以200μL移液枪头垂直于细胞培养面稍用力划出直线，PBS洗涤2次，显微镜下以连续视野记录划痕全长。将培养基中PBS的含量调整为0.5％，实验分3组，分别为空白对照组B、阴性对照组C、实验组NT10，其中实验组NT10和阴性对照组C分别以实施例5中NT10组和C组得到的外泌体干预内皮细胞，空白对照组不进行干涉，外泌体的浓度调整为5μg/mL，干预培养13.5小时后观察内皮细胞的迁移情况。显微镜下空白对照组、阴性对照组和实验组内皮细胞如图3A、3B、3C、3D、3E、3F所示，使用Image-Pro Plus 6.0软件测定单个视野划痕内的细胞平均迁移距离，结果如图4所示，与未加入外泌体的空白对照组B相比，用来源于实施例5中NT10组的外泌体干预内皮细胞，可显著抑制内皮细胞迁移能力(P＝0.023)，而使用来源于实施例5中C组来源的外泌体干预内皮细胞与未加入外泌体的空白对照组相比内皮细胞的迁移能力无统计学差异(P＝0.883)。与来源于实施例5中C组的外泌体相比，来源于实施例5的NT10组的外泌体可显著抑制内皮细胞的迁移(P＝0.006)。
根据实施例5以及实施例6的实验结果表明，用实施例1-实施例4制备的外泌体具有抑制内皮细胞迁移的作用，可以应用于抑制肿瘤血管生成的抗肿瘤药物中。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
机译： 外出的活性配方抑制内皮细胞迁移，以及制备方法和应用
机译： 环状AMP-磷酸二酯酶活性抑制剂，弹性蛋白酶活性抑制剂，基质金属蛋白酶-1（MMP-1）活性抑制剂，基质金属蛋白酶-14（MMP-14）活性抑制剂，表皮角质形成细胞生长促进剂，雌激素剂，内皮素-1mRNA增加表达抑制剂和SCFmRNA增加表达抑制剂
机译： 外来活性抑制内皮细胞迁移的制备方法及其用途
