共同基团法结合UPLC-MSMS检测植物源农产品中咪鲜胺代谢物的分析方法

技术领域

本发明涉及一种共同基团检测方法，具体涉及一种共同基团法结合UPLC-MSMS检测植物源农产品中咪鲜胺代谢物的分析方法。

背景技术

咪鲜胺(Prochloraz)，化学名称为N-丙基-N-[2-(2,4,6-三氯苯氧基)乙基]-咪唑-1-甲酰胺，结构如图1所示。

咪鲜胺是一种广谱杀菌剂，能够通过干扰病菌体内麦角甾醇的合成，使得细胞膜功能受损，从而起到抑菌杀菌作用。咪鲜胺对多种作物由子囊菌和半知菌引起的病害具有明显的防效，也可以与大多数杀菌剂、杀虫剂、除草剂混用，均有较好的防治效果。对大田作物、水果蔬菜、草皮及观赏植物上的多种病害具有治疗和铲除作用。咪鲜胺自进入我国市场以来得到迅速推广，目前其单剂或复配制剂在我国的登记数量已达到二百余种，覆盖水稻、小麦、苹果、柑橘、黄瓜等多种农作物。

研究表明，咪鲜胺使用后会发生代谢降解，其代谢产物主要有三种，分别是N-丙基-N-[2-(2,4,6-三氯苯氧基)乙基]脲(BTS44595)、N-醛基-N-丙基-N-[2-(2,4,6-三氯苯氧基)乙基]脲(BTS44596)和2,4,6-三氯苯酚(BTS45186)，主要代谢途径如图2所示。由图2可见，咪鲜胺初级代谢产物主要有三种，即BTS44595、BTS44596和N-丙基-2-(2,4,6-三氯苯氧基)乙胺，而这三种初级代谢产物最终均代谢为BTS45186。

咪鲜胺残留分析技术是监测咪鲜胺残留风险的重要技术支撑，目前对咪鲜胺的残留分析主要采用液相色谱法、液相色谱串联质谱法和气相色谱法等，这些分析方法主要有两个不足之处：一是部分方法仅仅检测了咪鲜胺母体或代谢物BTS45186，未对其有毒理学意义的其它代谢物进行检测，而粮农组织和世界卫生组织农药残留联席会(JMPR)报告中规定了咪鲜胺的残留物定义为咪鲜胺及其含2,4,6-三氯苯酚部分的代谢产物之和，因此这些检测方法显然会低估咪鲜胺带来的残留风险；二是采用复杂且危险性高的检测分析方法，即目前较为通用的高温水解强酸净化方法。因此，需要发明一种简单、快速、安全、高效的咪鲜胺检测分析方法对其主要代谢物进行检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供一种共同基团法结合超高效液相色谱串联质谱仪(UPLC-MSMS)测定咪鲜胺其中一条代谢途径中的两种主要代谢产物BTS44596和BTS45186的分析方法，该方法可以通过检测二者的共同基团部分(即2,4,6-三氯苯氧基)分别对其进行定性定量分析，该方法具有快速、安全、高效、灵敏的特点。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种共同基团法结合UPLC-MSMS检测植物源农产品中咪鲜胺代谢物的分析方法，其特征在于包含以下步骤：

a、取均质后的植物源农产品样品，加入提取溶剂乙腈，匀浆分散提取，离心分层，取上清液，剩余残渣按前述步骤重复提取，取上清液，合并两次离心得到的上清液得到上清液A；

其中，所述样品和乙腈的质量体积比为0.25～0.5g/mL；

b、向步骤a得到的上清液A里加入氯化钠，振荡，离心分层，取上清液后得到上清液B；

其中，所述氯化钠和步骤a中所述样品的质量比为0.3～0.5；

c、取一定体积步骤b得到的上清液B与N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基键合硅胶(C18)和石墨化碳黑(GCB)混匀净化后，离心，取上清液后得到上清液C；

其中，所述PSA、C18、石墨化碳黑的质量比为2.5:5:1；

所述PSA和步骤a中所述样品的质量比为0.005～0.015；

d、取一定体积步骤c得到的上清液C于35～45℃下氮气吹干，通过与所取上清液C等体积的20％乙腈溶液溶解定容后，过0.22μm滤膜，得到待测样品；

e、采用UPLC-MSMS检测植物源中咪鲜胺代谢物。

优选地，所述咪鲜胺代谢物为BTS44596、BTS45186中的至少一种。

优选地，所述植物源农产品为水果、蔬菜、中药材、粮食中的一种。

优选地，所述步骤a中的离心步骤包括一次离心和二次离心，所述一次离心的离心转速为9000～11000r/min，离心时间为0.5～1.5min，所述二次离心的离心转速为9000～10000r/min，离心时间为1～3min。

优选地，所述步骤b、c中的离心转速为9000～10000r/min，离心时间为1～3min。

优选地，所述步骤e中UPLC-MSMS检测的液相条件为：

色谱柱：Waters Acquity BEH C18,2.1×100mm,1.7μm；

色谱柱柱温：35℃；

流动相：色谱纯乙腈和纯水，采用梯度洗脱；

流动相比例：0min～0.5min为20％色谱纯乙腈，0.5min～3.5min由20％色谱纯乙腈变至80％色谱纯乙腈，3.5min～5.0min为80％色谱纯乙腈，5.0min～5.1min由80％色谱纯乙腈变至20％色谱纯乙腈，5.1min～7.0min为20％色谱纯乙腈；

流动相流速：0.300mL/min；

进样量：10.0μL；

优选地，所述步骤e中UPLC-MSMS检测的质谱条件为：

离子源：电喷雾离子源负源模式；

毛细管电压：2.0KV；

脱溶剂气流速：1000℃；

雾化气温度：500℃；

锥孔气流速：50L/h；

离子源温度：150℃；

离子扫描模式：多重反应监测模式；

检测离子对：196.7/160.6和196.7/34.5。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)采用共同基团法进行检测，降低了基质抑制效应，提高了残留分析的灵敏度，即，选定咪鲜胺其中一条代谢途径中的两种主要代谢产物BTS44596和BTS45186，以二者共有的2,4,6-三氯苯氧基基团为检测分析时的母离子，该方法尤其使得BTS44596的抗基质干扰能力大大提高；

(2)PSA、C18、石墨化碳黑这些净化吸附剂的选择亦显著提高了共同基团法检测下的灵敏度，对该方法起重要的辅助作用。

附图说明

图1是咪鲜胺的化学结构式；

图2是咪鲜胺的代谢途径表达式；

图3是比较例A1～A7的BTS44596测试结果；

图4是比较例A1～A7的BTS45186测试结果；

图5a是比较例A2的BTS44596和BTS45186的196.7/160.6离子对色谱图；

图5b是比较例A2的BTS44596和BTS45186的196.7/34.5离子对色谱图；

图5c是比较例A2的BTS44596和BTS45186的总离子流图；

图6a是实施例C1的BTS44596信噪比图；

图6b是实施例A13的BTS44596信噪比图；

图7a是实施例A13的BTS44596和BTS45186色谱图；

图7b是实施例D1的BTS44596和BTS45186色谱图；

图7c是实施例D2的BTS44596和BTS45186色谱图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

本发明针对图2中其中一条代谢途径，即咪鲜胺降解为BTS44596并进一步降解为BTS45186，开发了此两种代谢产物的残留分析方法。该方法通过检测BTS44596和BTS45186的共同基团(即2,4,6-三氯苯氧基)进行定性定量分析。

比较例A1～A7：

a、标准母液的配制：称取约10mg纯度为99.0％的BTS44596标准品，用乙腈定容至10mL，得到浓度为1000mg/L的BTS44596标准母液；另称取约10mg纯度为99.69％的BTS45186标准品，用乙腈定容至10mL，得到浓度为1000mg/L的BTS45186标准母液；各准确移取1mL上述BTS44596和BTS45186标准母液，用乙腈定容至10mL，得到浓度为100mg/L的BTS44596和BTS45186混合标准母液。

b、基质标准工作液的配制：准确移取上述BTS44596和BTS45186混合标准母液，用20％乙腈溶液(乙腈/水＝20/80，V/V)逐级稀释，得到浓度为0.001mg/L、0.002mg/L、0.005mg/L、0.020mg/L、0.050mg/L、0.20mg/L、0.50mg/L的系列标准溶液，待空白样品净化液氮气吹干后，分别用1mL上述系列标准溶液定容，过膜，得到浓度为0.001mg/L、0.002mg/L、0.005mg/L、0.020mg/L、0.050mg/L、0.20mg/L、0.50mg/L的系列基质标准工作液；

c、将上述系列基质标准工作液采用UPLC-MSMS检测植物源中咪鲜胺代谢物(比较例A1～A7所测试的基质标准工作液浓度分别为0.001mg/L、0.002mg/L、0.005mg/L、0.020mg/L、0.050mg/L、0.20mg/L、0.50mg/L)，测试条件如下：

液相条件：色谱柱为Waters Acquity BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)；色谱柱柱温为35℃；进样量为10.0μL；流动相为色谱纯乙腈(A)和纯水(B)，采用梯度洗脱(如表1所示)；流动相流速为0.30mL/min。

表1液相梯度洗脱条件

质谱条件：离子源为电喷雾离子源负源模式(ESI^-)；毛细管电压为2.0KV；脱溶剂气流速为1000℃；雾化气温度为500℃；锥孔气流速为50L/h；离子源温度为150℃；离子扫描模式为多重反应监测模式(MRM)如表2所示。

表2多重反应监测条件

其中，测试时的空白溶液选用西瓜或菠菜的空白基质溶液。

比较例A1～A7的BTS44596和BTS45186测试结果分别如图3和图4所示，其中图3测试时选用的空白溶液为西瓜的空白基质溶液，图4测试时选用的空白溶液为菠菜的空白基质溶液。

比较例A2的BTS44596和BTS45186的196.7/160.6离子对色谱图如图5a所示，比较例A2的BTS44596和BTS45186的196.7/34.5离子对色谱图如图5b所示，比较例A2的BTS44596和BTS45186的总离子流图如图5c所示，测试时选用的空白溶液为菠菜的空白基质溶液。

为了衡量分析方法的正确度和精密度，本发明利用添加回收方法来进行试验，分别向空白样品中添加BTS44596和BTS45186混合标准溶液，添加浓度分别为0.01mg/kg、0.1mg/kg、1mg/kg，每个浓度重复5次。

实施例A1～A15：

a、标准母液的配制：同比较例A1；

b、称取5g均质后的植物源农产品空白样品置于50mL离心管中，分别添加不同量的BTS44596和BTS45186混合标准溶液；

c、分别向上述步骤b中的离心管中加入15.0mL乙腈，以10000r/min匀浆提取1min后，以9500r/min离心2min，取上清液，剩余残渣加入10.0mL乙腈，以10000r/min匀浆提取1min后，以9500r/min离心2min，合并两次上清液；

d、加入2g氯化钠于上清液中，剧烈震荡1min，再以9500r/min离心2min，待净化；

e、吸取2mL上清液于装有50mg PSA、100mg C18和20mg GCB的10mL塑料离心管中，漩涡振摇1min后9500r/min离心2min；

f、吸取净化液1mL于40℃下氮气吹至近干，用1mL20％乙腈溶液溶解残渣，过0.22μm滤膜后供UPLC-MS/MS测定；

g、采用UPLC-MSMS检测植物源中咪鲜胺代谢物，测试条件同比较例A1。

实施例A1～A15的反应条件和测试结果如表3和表4所示。

表3实施例A1～A15不同农产品中BTS44596的添加回收试验结果

表4实施例A1～A15不同农产品中BTS45186的添加回收试验结果

该方法适用于水果、蔬菜、中药材、粮食等产品上咪鲜胺代谢物的检测分析，为验证该分析方法的实际应用效果，于市场上购买了柑橘、杨梅、山核桃、菠菜、西瓜等样品各三份进行试验。

实施例B1～B15：

a、称取均质后的植物源农产品样品5g置于50mL离心管中，加入15.0mL乙腈，以10000r/min匀浆提取1min后，以9500r/min离心2min，取上清液，剩余残渣加入10.0mL乙腈，以10000r/min匀浆提取1min后，以9500r/min离心2min，合并两次上清液；

b、加入2g氯化钠于上清液中，剧烈震荡1min，再以9500r/min离心2min，待净化；

c、吸取2mL上清液于装有50mg PSA、100mg C18和20mg石墨化碳黑的10mL塑料离心管中，漩涡振摇1min后9500r/min离心2min；

d、吸取净化液1mL于40℃下氮气吹至近干，用1mL20％乙腈溶液溶解残渣，过0.22μm滤膜后供UPLC-MS/MS测定；

e、采用UPLC-MSMS检测植物源中咪鲜胺代谢物，测试条件同比较例A1。

实施例B16：

a、称取均质后的植物源农产品样品5g置于50mL离心管中，加入10.0mL乙腈，以9000r/min匀浆提取0.5min后，以9000r/min离心1.5min，取上清液，剩余残渣加入15.0mL乙腈，以9000r/min匀浆提取0.5min后，以9000r/min离心1.5min，合并两次上清液；

b、加入1.5g氯化钠于上清液中，剧烈震荡1min，再以9000r/min离心1.5min，待净化；

c、吸取2mL上清液于装有25mg PSA、50mg C18和10mg石墨化碳黑的10mL塑料离心管中，漩涡振摇1min后9000r/min离心1.5min；

d、吸取净化液1mL于35℃下氮气吹至近干，用1mL 20％乙腈溶液溶解残渣，过0.22μm滤膜后供UPLC-MS/MS测定；

e、采用UPLC-MSMS检测植物源中咪鲜胺代谢物，测试条件同比较例A1。

实施例B17：

a、称取均质后的植物源农产品样品5g置于50mL离心管中，加入20.0mL乙腈，以11000r/min匀浆提取1.5min后，以10000r/min离心3min，取上清液，剩余残渣加入20.0mL乙腈，以11000r/min匀浆提取1.5min后，以10000r/min离心3min，合并两次上清液；

b、加入2.5g氯化钠于上清液中，剧烈震荡1min，再以10000r/min离心3min，待净化；

c、吸取2mL上清液于装有75mg PSA、150mg C18和30mg石墨化碳黑的10mL塑料离心管中，漩涡振摇1min后10000r/min离心3min；

d、吸取净化液1mL于45℃下氮气吹至近干，用1mL 20％乙腈溶液溶解残渣，过0.22μm滤膜后供UPLC-MS/MS测定；

e、采用UPLC-MSMS检测植物源中咪鲜胺代谢物，测试条件同比较例A1。

实施例B1～B17的反应条件和测试结果如表5所示。

表5实施例B1～B17部分市售农产品中BTS44596和BTS45186的残留检测结果

为了说明本发明的有益效果，本发明提供以下实施例：

实施例C1：

与实施例A13不同之处在于，其检测模式为电喷雾正离子源模式(ESI+)，定量离子对为355/84.8。

实施例D1：

与实施例A13不同之处在于，其仅仅采用石墨化碳黑为净化吸附剂进行净化。

实施例D2：

与实施例A13不同之处在于，其未采用PSA、C18和石墨化碳黑在内的净化吸附剂进行净化。

实施例C1的BTS44596信噪比图如图6a所示，实施例A13的BTS44596信噪比图如图6b所示，测试时选用的空白溶液为西瓜的空白基质溶液。

实施例A13的BTS44596和BTS45186色谱图如图7a所示，实施例D1的BTS44596和BTS45186色谱图如图7b所示，实施例D2的BTS44596和BTS45186色谱图如图7c所示，测试时选用的空白溶液为西瓜的空白基质溶液。

注：

所有比较例和实施例中使用的原料、设备等均为已知产品，并可通过购买市售产品获得：

UPLC-MS/MS(Waters Acquity UPLC-XEVO TQ-S Micro,美国Waters)；匀浆机(T25，德国IKA)；高速离心机(3K15，德国Sigma)；旋涡混合器(GENIUS3，德国IKA)；电子天平(Quintix124，瑞士Mettler Toledo)；十万分之一电子天平(XPE205，瑞士MettlerToledo)；

乙腈(色谱纯，德国Merk)；N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基硅烷键合硅胶(C18)、石墨化碳黑(GCB)(天津博纳艾杰尔科技有限公司)；氯化钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；纯水(娃哈哈集团有限公司)；BTS44596标准品(纯度为99.0％，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH)、BTS45186标准品(纯度为99.69％，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH)。

对实验结果分析如下：

(1)从图3和图4中可以看出，进样浓度与响应值之间的线性关系良好，相关系数r均在0.998以上；

从图5可以看出，BTS44596和BTS45196两种化合物分离度较好，BTS44596响应值低于BTS45186，但整体而言检测背景较为干净，说明基质干扰较轻；

(2)从表3和表4可以看出，该分析方法BTS44596和BTS4518的回收率均较高，精密度良好，满足农药残留分析的相关要求；

(3)从表5可以看出，部分样品中有检出BTS44596和BTS45186，说明本方法能够快速准确地检测出实际样品中咪鲜胺代谢物的残留量，应用效果良好；

(4)从图6可以看出，相同浓度下，BTS44596共同基团法的色谱图信噪比显著高于ESI+模式下的信噪比。虽然BTS44596在ESI+模式下离子碎片信息丰富，但此模式下本底值很高，背景杂乱，降低了其检测灵敏度，尤其菠菜等叶菜类在低浓度时基质抑制效应尤其明显；但采用共同基团法进行检测时，背景值大大降低，进而提高了灵敏度，因此有较高的信噪比；

(5)从图7可以看出，PSA、C18和GCB净化后提高了检测灵敏度，可见采用共同基团法结合PSA、C18和石墨化碳黑净化能够明显降低基质抑制效应，提高检测灵敏度。

综上所述，本发明共同基团法结合UPLC-MSMS检测植物源农产品中的BTS44596和BTS45186，前处理过程安全、简便、高效，共同基团检测方法能有效改善基质效应，检测灵敏得到提高，PSA、C18和GCB净化则进一步提高了灵敏度。分析方法的准确度和精密度等亦均符合农药残留的分析要求，对市售农产品的检测分析则更加快速高效，可以为监测植物源农产品中BTS44596和BTS45186代谢物残留量提供一定的技术支撑。