一种抗人YKL-40中和性单克隆抗体及其制备与应用

技术领域

本发明涉及医学生物工程技术领域，具体地说，是一种抗人YKL-40中和性单克隆抗体及其制备与应用。

背景技术

YKL-40是一种分泌型糖蛋白，也叫Chi3l1、BRP39，由位于一号染色体的CHI3L1基因编码，属于18-糖基水解酶基因家族。近年来因为其广泛的生物学效应越来越被科学界关注。目前的研究发现YKL-40主要参与两类反应，一类是炎症反应，特别是肺部炎症反应；另一类是参与肿瘤进展，与患者的不良预后相关。

YKL-40是肺部炎症反应中重要的细胞因子，可由不同类型的细胞分泌，例如平滑肌细胞、肺上皮细胞、巨噬细胞等。YKL-40的表达与多种肺部慢性炎症性疾病相关。2007年《新英格兰杂志》报道了血清中YKL-40水平与哮喘严重程度呈正相关，可以作为反映哮喘严重程度的生物学标志物和治疗新靶点(CHUPP G L,LEE C G,JARJOUR N,et al.Achitinase-like protein in the lung and circulation of patients with severeasthma[J].N Engl J Med,2007,357(20):2016-27.)。在其它呼吸功能异常及肺部感染导致的炎症反应性疾病中，如肺炎、慢性阻塞性肺疾病等，患者血清中也可检测到YKL-40水平异常升高，造成下游的炎症反应、组织重塑以及细胞的恶性转化。YKL-40可由IL-6、IL-1b、IL13等多种炎症因子刺激分泌，参与炎性环境的维持，是炎症反应中重要的一环，因此抑制YKL-40的生物学效应有望作为一种抑制肺部炎症的新策略。

同时，YKL-40促进肿瘤转移的作用也被研究证实(KAWADA M,SENO H,KANDA K,etal.Chitinase 3-like 1promotes macrophage recruitment and angiogenesis incolorectal cancer.Oncogene,2012,31(26):3111-23；SHAO R,HAMEL K,PETERSEN L,etal.YKL-40,a secreted glycoprotein,promotes tumor angiogenesis.Oncogene,2009,28(50):4456-68.)。YKL-40的水平与诸多肿瘤的无瘤生存期及总体生存期呈负相关，例如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤、肾脏肿瘤、胆管癌等。其促进肿瘤进展的作用可以通过影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、转移以及增强肿瘤血管新生的方式实现。在之前的研究报道中，YKL-40可以促进乳腺癌和黑色素瘤肺转移的发生(MA B,HERZOG E L,LEE C G,et al.Roleof chitinase 3-like-1and semaphorin 7a in pulmonary melanoma metastasis[J].Cancer Res,2015,75(3):487-96)。

但是关于一种抗人YKL-40中和性单克隆抗体，其抗体序列信息以及该单克隆抗体在用于中和肺上皮细胞分泌的YKL-40进而抑制肝癌肺转移的应用目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗人YKL-40中和性单克隆抗体，并提供该抗体序列信息，以及该中和性单克隆抗体在用于中和肺上皮细胞分泌的YKL-40功能以及抑制肝癌细胞肺转移中的应用。

本发明课题组最新研究发现，在肝癌肺转移患者血清中存在YKL-40的高水平表达(图1)，且YKL-40的重组蛋白可以通过促进肝癌细胞的侵袭转移、参与肺部肿瘤转移前微环境的形成，促进肝癌肺转移的发生。同时，我们的研究发现Bortezomib可以通过抑制YKL-40的分泌减少肺转移灶的形成(于晗.肝癌细胞调控肺上皮细胞Chi3l1分泌促进肝癌肺转移的作用和机理研究[D].中国人民解放军海军军医大学,2019.)。由此可知，YKL-40可能是一种介导肝癌肺转移的关键因子，从而，阻断YKL-40的生物学功能可以抑制肝癌肺转移的发生。

因此，通过中和性单克隆抗体中和阻断YKL-40的生物学功能有望成为一种肝癌肺转移的治疗新策略。

本发明研究基于YKL-40与肝癌特异性肺转移的密切关系，具体在临床肝癌肺转移患者的血清中，YKL-40的水平显著高于无转移的肝癌患者和其它部位转移的肝癌患者，提示其可能作为一种肝癌肺转移的血清学标志物。另外肝癌细胞可诱导肺上皮细胞分泌YKL-40，而高水平的YKL-40具有促进肝癌细胞侵袭转移的生物作用，提示YKL-40可能与肝癌肺转移密切相关。

因此，本发明进一步设想应用YKL-40中和性单克隆抗体特异识别YKL-40的功能结构域，封闭其生物学功能，进而抑制肝癌肺转移的发生，阻断YKL-40的作用可能对肺转移高风险的肝癌患者起到个性化的治疗效果。

本发明的第一方面，提供一种抗人YKL-40中和性单克隆抗体，可以抑制YKL-40的生物学功能，该单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。可人工合成该单克隆抗体。

进一步的，所述的单克隆抗体也可以由保藏编号为CCTCC No：C202067的杂交瘤细胞分泌产生。

所述的抗人YKL-40中和性单克隆抗体在制备过程中，对抗原蛋白进行筛选，筛选标准为可以发挥促进肝癌细胞转移功能的YKL-40重组蛋白(图2)，经筛选后用YKL-40的Tyr22-Thr 383结构区域蛋白免疫小鼠获得，由此得到可特异性识别人YKL-40蛋白并中和封闭YKL-40的生物学功能的中和性抗体。

本发明的第二方面，提供一种多核苷酸，其包含编码如上所述的单克隆抗体的核苷酸序列。

进一步的，所述的多核苷酸包含编码所述的重链可变区的如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，和编码所述的轻链可变区的如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

本发明的第三方面，提供一种杂交瘤细胞株，命名为Hyb-NAY，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏日期2020年6月10日，其保藏编号为CCTCC No：C202067。

本发明的第四方面，提供了一种如上所述的抗人YKL-40中和性单克隆抗体、多核苷酸或杂交瘤细胞株在制备抑制YKL-40生物学功能及抑制肝癌肺转移药物中的应用。

进一步的，所述的应用为在制备中和肝癌肺转移患者血清中高水平的YKL-40的药物中的应用。

进一步的，所述的应用为在制备通过封闭YKL-40对肝癌细胞生物学功能，抑制肝癌肺转移的药物中的应用。

本发明优点在于：

本发明提供一种抗人YKL-40中和性单克隆抗体，并提供其抗体序列信息，具有中和肺上皮细胞分泌的YKL-40以及抑制肝癌细胞肺转移的功能，为肝癌肺转移患者的临床个性化治疗应用提供了新的思路。

生物材料样品的保藏信息：

保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)

地址：中国湖北省武汉市武汉大学

保藏日期：2020年6月10日

保藏编号：CCTCC No：C202067

分类命名：杂交瘤细胞Hyb-NAY

附图说明

图1.检测临床血清中YKL-40的水平。HCC-lung M：肝癌肺转移组；HCC-other M：HCC伴其它转移组；HCC-no M：HCC无转移组；Healthy control：健康人群对照组。***P<0.001。(引自于晗.肝癌细胞调控肺上皮细胞Chi3l1分泌促进肝癌肺转移的作用和机理研究[D].中国人民解放军海军军医大学,2019。)

图2.检测不同的YKL-40重组蛋白对肝癌细胞迁移能力的生物学功能。在transwell迁移实验下室内加入不同的YKL-40重组蛋白，24小时后观察肝癌细胞迁移穿膜情况。

图3.Elisa检测抗人YKL-40中和性单克隆抗体对肝癌肺转移患者血清中YKL-40的中和效果。三例肝癌肺转移患者血清经抗人YKL-40中和性单克隆抗体(简称N-AY)10ug/mL及对照抗体溶剂4度过夜孵育后检测血清中YKL-40的水平。

图4.Elisa检测抗人YKL-40中和性单克隆抗体对肺上皮细胞分泌的YKL-40的中和效果。肺上皮细胞Beas2B的培养上清经不同浓度的抗人YKL-40中和性单克隆抗体(简称N-AY)及对照抗体溶剂4℃过夜孵育后检测培养上清中YKL-40的水平。

图5.检测抗人YKL-40中和性单克隆抗体对YKL-40重组蛋白促进肝癌细胞迁移的生物学功能的封闭效果。在transwell迁移实验下室内加入YKL-40重组蛋白及中和单抗(简称N-AY)10ug/mL，18小时后观察肝癌细胞迁移穿膜情况。

图6.检测抗人YKL-40中和性单克隆抗体对YKL-40重组蛋白促进肝癌细胞信号通路活化的生物学功能的封闭效果。在肝癌细胞LM3中加入100ng/mLYKL-40及中和单抗(简称N-AY)10ug/mL，15分钟后蛋白印迹法检测Akt通路活化情况。

图7.检测抗人YKL-40中和性单克隆抗体对YKL-40重组蛋白促进血管生成的生物学功能的封闭效果。在血管内皮细胞HUVEC中加入100ng/mL YKL-40及中和单抗(简称N-AY)10ug/mL，6小时后观察HUVEC成管情况。

图8.检测抗人YKL-40中和性单克隆抗体对肺上皮细胞分泌的YKL-40促进肝癌细胞迁移的生物学功能的封闭效果。在transwell迁移实验下室内加入肺上皮细胞Beas2B培养上清及中和单抗(简称N-AY)10ug/mL，18小时后观察肝癌细胞迁移穿膜情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1：YKL-40蛋白抗原筛选

抗原筛选：选取不同商家的人源YKL-40重组蛋白，用transwell细胞迁移体系检测蛋白对肝癌细胞MHCC-LM3迁移能力的影响，将不同YKL-40重组蛋白分别加入到transwell下室中，筛选标准为可以显著促进肝癌细胞MHCC-LM3的迁移。根据图2，可知不同的YKL-40重组蛋白对肝癌细胞迁移的作用效果不同，我们选取的YKL-40重组蛋白可以显著促进肝癌细胞的迁移能力，该YKL-40重组蛋白的抗原序列是Tyr 22-Thr 383结构区域，该区域经实验验证是可以发挥肝癌细胞趋化作用的功能结构域。

实施例2：抗人YKL-40中和性单克隆抗体在抑制肝癌细胞肺转移中的应用

1)中和性单抗可显著降低肝癌肺转移患者血清中YKL-40浓度

本发明研究发现，肝癌患者合并肺转移时血清中YKL-40浓度显著上升(附图1)。取3例肝癌肺转移患者血清，预先用PBS将血清1:100稀释，加入YKL-40中和性单抗，浓度为10ug/mL，以IgG(10ug/mL)为对照组，4℃过夜孵育，ELISA检测血清中YKL-40浓度，结果如图3所示，抗人YKL-40中和性单抗可以结合YKL-40并将患者血清中YKL-40可检出的浓度降至低水平，从而可能起到抑制肝癌细胞肺转移的作用。

2)中和性单抗可中和肺上皮细胞分泌的YKL-40

肺上皮细胞可分泌YKL-40，在肝癌细胞肺转移过程中发挥重要的促进作用。取肺上皮细胞Beas2B细胞的培养上清，经检测其中有基础量的YKL-40分泌，将上清分成四份，三份分别加入5、10、20ug/mL的抗人YKL-40中和性单抗，另一份加入10ug/mL IgG对照，4℃过夜孵育，12小时后利用ELISA检测培养上清中YKL-40浓度，结果如图4所示，本发明的中和性单抗具有显著的中和肺上皮细胞Beas2B所分泌的YKL-40的作用。

3)中和性单抗可抑制YKL-40重组蛋白促进肝癌细胞迁移的生物学功能

YKL-40重组蛋白可以促进肝癌细胞的侵袭迁移。利用Transwell体系，在下室内加入YKL-40重组蛋白(1ug/mL)，实验组同时加入10ug/mL中和性单抗，对照组加入等量IgG，将肝癌细胞系MHCC-LM3消化重悬于无血清DMEM培养基，在上室内加入50，000细胞/孔，18小时后固定染色，观察穿膜细胞并计数。结果如图5所示，本发明的中和性单抗可显著减少穿膜细胞数，抑制YKL-40重组蛋白促进肝癌细胞迁移的生物学功能。

4)中和性单抗可抑制YKL-40重组蛋白激活肝癌细胞促癌信号通路的生物学功能

YKL-40重组蛋白可以在肝癌细胞中促进磷酸化Akt通路的活化。在肝癌细胞系MHCC-LM3的培养基中加入100ng/mL的YKL-40重组蛋白，实验组同时加入10ug/mL的中和性单抗，对照组加入等量IgG。孵育15分钟后，收蛋白利用western-blot检测细胞Akt信号通路的活化情况。结果如图6所示，YKL-40重组蛋白可激活肝癌细胞磷酸化Akt，而中和性单抗可抑制YKL-40重组蛋白对Akt的激活效果。

5)中和性单抗可抑制YKL-40重组蛋白促进血管生成的生物学功能

血管生成是转移前微环境的重要特征之一，YKL-40重组蛋白可以促进血管生成进而促进促进肿瘤转移。利用成管实验体系，将血管内皮细胞HUVEC按5000/孔均匀铺在Matrigel上，在培养基中加入100ng/mL的YKL-40重组蛋白，实验组同时加入10ug/mL的中和性单抗，对照组加入等量IgG。6小时后观察HUVEC成管情况。结果如图7所示，YKL-40重组蛋白可促进血管内皮细胞成管生长，而中和性单抗可抑制YKL-40重组蛋白对血管内皮细胞成管的促进效果。

6)中和性单抗可抑制肺上皮细胞分泌YKL-40促进肝癌细胞迁移的效应

Transwell下室内加入肺上皮细胞Beas2B的培养上清，内含基础量的YKL-40，上室加入肝癌细胞系MHCC-LM3(50,000个/孔)，实验组下室内加入10ug/mL中和性单抗，对照组加入等量IgG，18小时后观察穿膜细胞并计数。结果如图8示，本发明的中和性单抗可抑制肺上皮细胞分泌YKL-40促进肝癌细胞迁移的生物学效应，进而发挥抑制肝癌细胞肺转移的保护作用。

实施例3:单克隆抗体测序

将筛选得到的YKL-40中和性单克隆抗体测序得到其全长序列，具体流程为：1)使用TRIZol法将单克隆抗体的杂交瘤细胞株提取RNA；

2)使用SMART Race技术将RNA反转录合成cDNA；

3)PCR扩增获得重链和轻链全长；

4)使用连接酶将目标片段连接至载体，并将连接产物转化进大肠杆菌感受态细胞，后挑取单克隆进行测序；

5)进行测序结果分析与注释。

6)该单克隆抗体轻重链可变区序列信息(碱基和氨基酸)如下：

重链可变区碱基序列，如SEQ ID NO：3所示；

轻链可变区碱基序列，如SEQ ID NO：4所示；

重链可变区氨基酸序列，如SEQ ID NO：1所示；

轻链可变区氨基酸序列，如SEQ ID NO：2所示。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110> 中国人民解放军海军军医大学第三附属医院

<120> 一种抗人YKL-40中和性单克隆抗体及其制备与应用

<130> /

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Asp Ala

20 25 30

Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Ile Arg Ser Lys Gly Asn Asn His Thr Pro Tyr Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Arg Asn Ser

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Arg Thr Val Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Ser Cys Ala Met

100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Gly Ala Ser Asn Leu Ala Asp Asp Met Ser Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu His Pro

65 70 75 80

Asp Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Asn Val Leu Arg Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc 60

tcttgtgctg cctctggatt cactttaagt gacgcctgga tggactgggt ccgccagtct 120

ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attagaagta aaggtaataa tcatacacca 180

tactatgctg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc cagaaatagt 240

gtctacctgc aaatgaacac cttaagagct gaagatactg gcacttatta ctgtaccagg 300

actgtttatt actacggtag tagctcctgt gctatggact actggggtca gggaacctca 360

gtcaccgtct cctca 375

<210> 4

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

gacatccaga tgactcagtc tccagcttca ctgtctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60

atcacatgtg gagcaagtga gaatatttac ggtgctttaa attggtatca gcggaaacag 120

ggaaaatctc ctcagctcct gatctttggt gcaagcaact tggcagatga catgtcatcg 180

aggttcagtg gcagtggatc tggtagacag tactctctca agatcagtag cctgcatcct 240

gacgatgttg caacgtattt ctgtcaaaat gtattacgta ctccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaacc tggaaatcaa a 321