沙场链霉菌及其生防菌剂的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种沙场链霉菌及其生防菌剂的制备方法与应用。

背景技术

核桃黑斑病是近年来一种常见的植物病害，分布于世界各地，严重影响核桃产业的持续与发展。病原菌主要侵染核桃的幼枝、叶片和幼果，造成核桃的连续减产。目前对于该病的防治主要以化学农药为主，但核桃树冠高大且处于山区，喷药条件差，且化学农药的使用容易造成土壤环境污染，并严重影响核桃产品品质。针对核桃黑斑病的防治产品开发需求，开发生防菌剂具有重大意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种沙场链霉菌及其生防菌剂的制备方法与应用，作为微生物农药防治核桃黑斑病，克服化学农药的缺陷。

本发明所采用的技术方案为：

沙场链霉菌，其特征在于：

所述沙场链霉菌(Streptomyces arenae)YNF36于2020年9月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.20690。

所述所述沙场链霉菌(Streptomyces arenae)YNF36的16S rDNA序列为：

GTACCAGGGGACGGGGTGTTTAAAATGTAAGTCGGACTATGAAACCGTTCGGTGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAACACTTCCACTCTCCTGAGTGGAGGTTAAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACGTCTGGAGACAGGCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTTTTGGAAAGAGGAGGCCCGCTT。

沙场链霉菌生防菌剂的制备方法，其特征在于：

所述方法包括以下步骤：

步骤一：活化菌株：

将保存于SYP培养基斜面上的沙场链霉菌YNF36划线于SYP培养基平板上，28℃倒置培养3-5d；

步骤二：种子液的培养：

使用无菌打孔器在步骤一得到的菌株YNF36平板上打出菌饼，接种于种子液培养基中，在恒温摇床28℃，120-220r/min培养50-100h，发酵液细胞数达2.0×10

步骤三：生防菌剂的固体发酵培养：

将步骤二得到的种子液按接种量体积质量比2-10％接种到装有固体发酵培养基浅盘中，将浅盘置于通风培养箱中，设置温度为25-30℃，湿度60-85％,通风速度0.2-2.0m

步骤一中，所述SYP培养基配方为：淀粉10g/L、酵母浸粉4g/L、蛋白胨10g/L、余量水，调节pH为6.2-7.4。

步骤二中，所述种子液培养基配方为：淀粉10g/L、酵母浸粉5g/L、蛋白胨5g/L、K

步骤三中，所述固体发酵培养基配方为：麸皮40％、豆饼粉20％、淀粉10％、燕麦粉10-15％、甘油1-5％、K

如所述的制备方法制得的沙场链霉菌生防菌剂。

如所述的沙场链霉菌生防菌剂在防治核桃黑斑病方面的应用。

本发明具有以下优点：

本发明所述的沙场链霉菌YNF36来源于酸性土壤，具有较强适应酸碱能力，可在pH值5.0-8.5生长，利用其制备的生防菌剂对核桃黑斑病的防治效果可达70％以上，且具有人畜无害、环境友好、不破坏生态平衡、抗药性发展缓慢，原料丰富，生产较为方便，是一种高效、低成本、绿色环保的微生物农药新技术产品。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。

本发明涉及一种沙场链霉菌，所述沙场链霉菌(Streptomyces arenae)YNF36于2020年9月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.20690。该沙场链霉菌(Streptomyces arenae)YNF36分离于酸性土壤，耐pH值5.0-8.5。

所述所述沙场链霉菌(Streptomyces arenae)YNF36的16S rDNA序列为：

GTACCAGGGGACGGGGTGTTTAAAATGTAAGTCGGACTATGAAACCGTTCGGTGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAACACTTCCACTCTCCTGAGTGGAGGTTAAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACGTCTGGAGACAGGCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTTTTGGAAAGAGGAGGCCCGCTT。

基于上述沙场链霉菌制备生防菌剂的方法，包括以下步骤：

步骤一：活化菌株：

将保存于SYP培养基斜面上的沙场链霉菌YNF36划线于SYP培养基平板上，28℃倒置培养3-5d；

步骤二：种子液的培养：

使用无菌打孔器在步骤一得到的菌株YNF36平板上打出菌饼，接种于种子液培养基中，在恒温摇床28℃，120-220r/min培养50-100h，发酵液细胞数达2.0×10

步骤三：生防菌剂的固体发酵培养：

将步骤二得到的种子液按接种量体积质量比2-10％接种到装有固体发酵培养基浅盘中，将浅盘置于通风培养箱中，设置温度为25-30℃，湿度60-85％,通风速度0.2-2.0m

步骤一中，所述SYP培养基配方为：淀粉10g/L、酵母浸粉4g/L、蛋白胨10g/L、余量水，调节pH为6.2-7.4。

步骤二中，所述种子液培养基配方为：淀粉10g/L、酵母浸粉5g/L、蛋白胨5g/L、K

步骤三中，所述固体发酵培养基配方为：麸皮40％、豆饼粉20％、淀粉10％、燕麦粉10-15％、甘油1-5％、K

上述沙场链霉菌生防菌剂可用于防治核桃黑斑病。

实例1：

步骤一：活化菌株。将保存于SYP培养基斜面上的沙场链霉菌YNF36划线于SYP培养基平板上，28℃倒置培养3d。

所述SYP培养基配方为：淀粉10g/L、酵母浸粉4g/L、蛋白胨10g/L、余量水，调节pH为7.2。

步骤二：种子液的培养：使用无菌打孔器在上述菌株YNF36平板上打出菌饼，接种于种子液培养基中，28℃，120r/min培养100h，得到种子液。

所述种子液培养基配方为：淀粉10g/L、酵母浸粉5g/L、蛋白胨5g/L、K

步骤三：生防菌剂的固体发酵培养：将所述种子液按接种量体积质量比2％接种到固体发酵培养基中，在温度为25℃条件下培养240h，10℃风干至含水量10％左右，粉碎，120目过筛收集筛下物，即为制得的生防菌剂。

所述固体发酵培养基配方为：麸皮40％、豆饼粉20％、淀粉10％、燕麦粉10％、甘油5％、K

通过以上三个步骤可以制备获得菌种活力为2×10

实例2：

步骤一：活化菌株。将保存于SYP培养基斜面上的沙场链霉菌YNF36划线于SYP培养基平板上，28℃倒置培养4d。

所述SYP培养基配方为：淀粉10g/L、酵母浸粉4g/L、蛋白胨10g/L、余量水，调节pH为7.3。

步骤二：种子液的培养：使用无菌打孔器在上述菌株YNF36平板上打出菌饼，接种于种子液培养基中，28℃，180r/min培养80h，得到种子液。

所述种子液培养基配方为：淀粉10g/L、酵母浸粉5g/L、蛋白胨5g/L、K

步骤三：生防菌剂的固体发酵培养：将所述种子液按接种量体积质量比8％接种到固体发酵培养基中，在温度为28℃条件下培养180h，15℃风干至含水量10％左右，粉碎，120目过筛收集筛下物，即为制得的生防菌剂。

所述固体发酵培养基配方为：麸皮40％、豆饼粉20％、淀粉10％、燕麦粉12％、甘油5％、K

通过以上三个步骤可以制备获得菌种活力为5×10

实例3：

步骤一：活化菌株。将保存于SYP培养基斜面上的沙场链霉菌YNF36划线于SYP培养基平板上，28℃倒置培养5d。

所述SYP培养基配方为：淀粉10g/L、酵母浸粉4g/L、蛋白胨10g/L、余量水，调节pH为7.4。

步骤二：种子液的培养：使用无菌打孔器在上述菌株YNF36平板上打出菌饼，接种于种子液培养基中，28℃，220r/min培养50h，得到种子液。

所述种子液培养基配方为：淀粉10g/L、酵母浸粉5g/L、蛋白胨5g/L、K

步骤三：生防菌剂的固体发酵培养：将所述种子液按接种量体积质量比10％接种到固体发酵培养基中，在温度为30℃条件下培养150h，20℃风干至含水量10％左右，粉碎，120目过筛收集筛下物，即为制得的生防菌剂。

所述固体发酵培养基配方为：麸皮40％、豆饼粉20％、淀粉10％、燕麦粉15％、甘油5％、K

通过以上三个步骤可以制备获得菌种活力为7×10

防治效果检测：

实例3所得沙场链霉菌YNF36生防菌剂进行核桃黑斑病防治处理，设制5组处理，即沙场链霉菌YNF36生防菌剂500倍稀释液、沙场链霉菌YNF36生防菌剂1000倍稀释液、沙场链霉菌YNF36生防菌剂2000倍稀释液，2％春雷霉素1000倍稀释液，对照组为清水，以上稀释液体均为清水，每个处理重复3次，每株核桃苗接种2mL浓度为10

施药后10天后进行田间调查，调查叶片和果实黑斑病发生及防治情况。每个处理组随机抽样调查3株。调查时每株按东、南、西、北方向，选中层枝和下层枝，共计8个样点，每样点随机调查5片树叶或5个果实。根据黑斑面积设定分级标准，统计病情指数，计算药剂防治效果。

0级：无病斑；

1级：病斑面积占叶片面积的5％以下；

2级：病斑面积占叶片面积的6％-15％；

3级：病斑面积占叶片面积的16％-25％；

4级：病斑面积占叶片面积的26-50％；

5级：病斑面积占叶片面积的50％以上。

药效计算办法：

病情指数＝100×∑[(各级病叶数量×代表值)]/调查总叶数×5

防治效果(％)＝[1-(对照区药前病情指数×处理区药后病情指数)/(对照区药后病情指数×处理区药前病情指数)]×100％

利用SPSS软件18.0的S-N-K极差法进行数据分析比较差异，结果如表1所示。

表1沙场链霉菌YNF36生防菌剂对核桃黑斑病的防效

沙场链霉菌YNF36生防菌剂的500倍稀释液、1000倍稀释液、2000倍稀释液对核桃黑斑病均具有较好的防治效果，防效可达70％以上。

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。