细胞保存液、细胞保存管和保存方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种细胞保存液、细胞保存管和保存方法。

背景技术

癌细胞从原发部位脱落，进入人体外周血，被称为循环肿瘤细胞(CirculatingTumor Cell，CTC)。循环肿瘤细胞通过血液传播转移到身体的其他器官，是导致患者死亡的主要原因。免疫磁珠捕获和免疫荧光鉴定是常用的富集及鉴定循环肿瘤细胞的方法，但现有的试剂对外周血中循环肿瘤细胞的保存效果不好，使得循环肿瘤细胞被免疫磁珠富集并进一步免疫荧光鉴定的效果不好。

上述内容仅用于辅助理解发明的技术方案，并不代表承认上述内容是现有技术。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种细胞保存液，旨在提高对外周血中循环肿瘤细胞的保存效果，从而提高循环肿瘤细胞被免疫磁珠捕获并免疫荧光鉴定的效果。

为实现上述目的，第一方面，本发明提出一种细胞保存液，包含：

KCl，浓度为大于或等于2mmol/L，且小于或等于2.5mmol/L；

NaCl，浓度为大于或等于130mmol/L，且小于或等于150mmol/L；

Na

腺苷，浓度为大于或等于1mmol/L，且小于或等于8mmol/L；

还原型谷胱苷肽，浓度为大于或等于1mmol/L，且小于或等于2mmol/L；

抗凝剂，包含枸橼酸盐、肝素或乙二胺四乙酸盐的至少一种，所述抗凝剂的浓度为大于或等于10g/L，且小于或等于15g/L；以及

葡萄糖，浓度为大于或等于0.1g/L，且小于或等于1g/L。

可选地，所述抗凝剂为乙二胺四乙酸盐。

第二方面，本发明还提出一种细胞保存管，所述细胞保存管包括管体和存放于所述管体内的细胞保存液，所述细胞保存液包含：

KCl，浓度为大于或等于2mmol/L，且小于或等于2.5mmol/L；

NaCl，浓度为大于或等于130mmol/L，且小于或等于150mmol/L；

Na2HPO4，浓度为大于或等于10mmol/L，且小于或等于12mmol/L；

腺苷，浓度为大于或等于1mmol/L，且小于或等于8mmol/L；

还原型谷胱苷肽，浓度为大于或等于1mmol/L，且小于或等于2mmol/L；

抗凝剂，包含枸橼酸盐、肝素或乙二胺四乙酸盐的至少一种，所述抗凝剂的浓度为大于或等于10g/L，且小于或等于15g/L；以及

葡萄糖，浓度为大于或等于0.1g/L，且小于或等于1g/L；

其中，所述细胞保存液与所述管体的体积比为大于或等于1：10，且小于或等于1：5。

可选地，所述细胞保存液与所述管体的体积比为大于或等于1：8，且小于或等于1：6。

可选地，所述抗凝剂为乙二胺四乙酸盐。

可选地，所述管体的规格为大于或等于2ml，且小于或等于10ml。

第三方面，本发明还提出一种血液循环肿瘤细胞的保存方法，包括如下步骤：

(1)配置细胞保存液；

(2)将采集的外周血加入至所述细胞保存液混匀，所述细胞保存液与所述外周血的体积比为大于或等于1：9，且小于或等于1：4；

其中，所述细胞保存液包含2～2.5mmol/L的KCl、130～150mmol/L的NaCl、10～12mmol/L的Na

可选地，所述细胞保存液与所述外周血的体积比为大于或等于1：6，且小于或等于1：5。

本发明细胞保存液包含2～2.5mmol/L的KCl、130～150mmol/L的NaCl、10～12mmol/L的Na

具体实施方式

需要说明，若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，全文中出现的“和/或”的含义为，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案，或B方案，或A和B同时满足的方案。

本发明提出一种细胞保存液。

本发明提出的细胞保存液包含KCl、NaCl、Na

在本发明细胞保存管中，KCl、NaCl、Na

所述抗凝剂包含枸橼酸盐、肝素或乙二胺四乙酸盐的至少一种。所述枸橼酸盐可以为枸橼酸钠，所述枸橼酸钠可以与血液中的钙离子结合形成螯合物，从而阻止血液凝固。所述肝素是一种生理性抗凝剂，是一种含硫酸基团的粘多糖，带有较多负电荷，可以加强抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)灭活丝氨酸蛋白酶，从而阻止凝血酶的形成，避免血小板聚集等。所述乙二胺四乙酸盐(EDTA)可以为EDTA钠盐和EDTA钾盐，所述EDTA能与血液中的钙离子结合形成螯合物，使钙离子失去凝血作用，从而达到抗凝目的。所述葡萄糖可以直接被细胞利用，提供能量，有助于延长循环肿瘤细胞的生存时间。

本发明细胞保存液包含2～2.5mmol/L的KCl、130～150mmol/L的NaCl、10～12mmol/L的Na

可选地，所述抗凝剂为乙二胺四乙酸盐。本发明经过多次实验验证发现，所述抗凝剂为乙二胺四乙酸盐时，对后续循环肿瘤细胞被免疫磁珠捕获和被免疫荧光鉴定的影响最小。

本发明还提出一种细胞保存管。

本发明提出的细胞保存管包括管体和存放于所述管体内的细胞保存液，所述细胞保存液包含KCl、NaCl、Na

本发明细胞保存管内含有上述细胞保存液，可以长时间有效稳定外周血中循环肿瘤细胞的活性及其表面抗原的表达，从而提高循环肿瘤细胞被免疫磁珠捕获并免疫荧光鉴定的效果。

可选地，所述细胞保存液与所述管体的体积比为大于或等于1：8，且小于或等于1：6。

可选地，所述抗凝剂为乙二胺四乙酸盐。

可选地，所述管体的规格为大于或等于2ml，且小于或等于10ml。所述管体包括多种规格，例如可以为2ml、5ml、10ml，适用不同检测要求下对不同体积的外周血样本的收集。

可选地，所述管体的周侧面上粘设有标签。这样设置，方便检测者直接对加入所述管体内的样本进行命名和记录。在本发明中，所述细胞保存管还包括管盖，所述管体的一端呈敞口，所述管盖设于所述敞口处。所述管盖可以设置为不同的颜色或者不同的形状，更加方便检测者对不同样本进行区分。

本发明还提出一种血液循环肿瘤细胞的保存方法。

本发明提出的血液循环肿瘤细胞包括如下步骤：(1)配置细胞保存液；(2)将采集的外周血加入至所述细胞保存液混匀，所述细胞保存液与所述外周血的体积比为大于或等于1：9，且小于或等于1：4；其中，所述细胞保存液包含2～2.5mmol/L的KCl、130～150mmol/L的NaCl、10～12mmol/L的Na

在本发明保存方法中，当所述细胞保存液与所述外周血的体积比为小于1：9时，所述细胞保存液的含量不足以长时间有效稳定所述管体内的循环肿瘤细胞的活性及其表面抗原的表达，降低了循环肿瘤细胞被免疫磁珠捕获和进一步被免疫荧光鉴定的效果。当所述细胞保存液与所述外周血的体积比大于1：4时，所述细胞保存液的含量过多，离子浓度过高，会对后续抗体特异性结合循环肿瘤细胞表面抗原产生影响，也会降低了循环肿瘤细胞被免疫磁珠捕获和进一步被免疫荧光鉴定的效果。

本发明细胞保存管含有上述细胞保存液，可以长时间有效稳定外周血中循环肿瘤细胞的活性及其表面抗原的表达，从而提高循环肿瘤细胞被免疫磁珠捕获和进一步被免疫荧光鉴定的效果。

可选地，所述细胞保存液与所述外周血的体积比为大于或等于1：6，且小于或等于1：5。当所述细胞保存液与所述外周血的体积比处于上述范围时，所述细胞保存液对所述循环肿瘤细胞的保存效果比较好。

实施例一

(一)配制不同配方的细胞保存液

1、分别取KCl、NaCl、Na

2、混合所述KCl、所述NaCl、所述腺苷、所述还原型谷胱苷肽和所述Na

3、对溶液进行定容；

4、采用滤孔直径为0.2μm的过滤膜，将上步溶液过滤除菌，得到细胞保存液，将所述细胞保存液倒入管体内；

5、用抽真空设备以0.29个标准大气压抽真空处理并密闭所述细胞保存管的管塞和管体，并置于2～8℃环境下稳定保存(可保存2年)，细胞保存液与管体的体积比为1：10。

按照以上配制方法，共配制了七组不同浓度和成分的细胞保存液，具体请参阅表1。本实施例还采用市面上购买的细胞保存液(组号：八)，作对对比试剂。

表1八组细胞保存液的成分及浓度

(二)NCI-H1993细胞的准备

1、培养NCI-H1993至体积覆盖率达到80～90％；

2、把原有培养基吸掉，加入3ml的PBS漂洗，洗掉PBS；

3、加1ml的胰蛋白酶，37℃消化3min；

4、细胞都变圆后，加入1ml含血清的培养基终止消化；

5、用移液枪吹打悬浮细胞；

6、把细胞吸到离心管中，轻轻吹打至分散，300×g离心5min；

7、倒掉上清液，加2ml培养基，把细胞吹散悬浮；

8、收集NCI-H1993细胞，分为数份，每份10

(三)NCI-H1993细胞与外周血样本的孵育

1、通过常规手臂静脉采血的方式，采集健康者的外周血4ml；

2、分别向外周血中加入10

3、加入实施例一的八组细胞保存液1ml，上下颠倒混匀，分别常温放置3天、5天和7天。

(四)免疫磁珠分离血液中的循环肿瘤细胞

1、取15mL分离液加入50mL的无菌Leucosep

2、依次加入3mL的PBS、7.5mL的抗凝外周全血和4.5mL的PBS，800g离心15min；

3、真空抽滤泵吸除白膜层上液体，将剩余液体小心倒入新的50mL离心管中，沿壁加入5mL的PBS冲洗分离管，冲洗液倒入50mL离心管，重复冲洗3次；

4、300g离心10min，弃上清；

5、取20μL的闭液加入50mL离心管中，轻弹离心管底，将细胞完全分散，置于2～8℃冰箱中静置10min；

6、将免疫磁珠进行振荡均匀，每个样本取50μL至1.5mL离心管中，按样本量进行分装，吸去磁珠保护液用孵育润洗3次后备用；

7、将细胞与磁珠混合，旋转摇床上2～8℃，10rpm/min孵育90min；

8、从旋转摇床上取下，放入磁力架静置3min，磁珠完全被吸附后，去液；

9、从磁力架上取下离心管，用1mL的PBS冲洗离心管，后放入磁力架静置3min，磁珠完全被吸附后，去液体，重复步骤两次；

10、从磁力架上取下离心管，加入100μL的孵育液；

11、2～8℃保存分离后的细胞，用于后续分析。

上述实验中，所述免疫磁珠可以为用以富集白细胞的CD45免疫磁珠或CA72-4免疫磁珠，用以富集NCI-H1993细胞的CEA免疫磁珠、EpCAM免疫磁珠或EGFR免疫磁珠等多种免疫磁珠。

(五)CK、CD45和DAPI对分离细胞进行染色

CD45染色分离细胞的步骤如下：

1、将100×的CD45、200×的显色液，用孵育液稀释成1×的工作液，置于2～8℃保存，固定液置于-20℃预冷；

2、取被磁珠孵育过的样本，用磁力架吸附珠，去除孵育液，加入-20℃预冷的固定液100μL，固定5min，用磁力架吸附珠，去除固定液；

3、加入100μL的孵育液重悬，用磁力架吸附珠，去除孵育液；

4、加入40μL的通透液，混匀后静置5min，用磁力架吸附珠去除通透液；

5、加入40μL的封闭液重悬，20min，用磁力架吸附珠，去除封闭液；

6、加入40μL的1×CD45重悬，孵育20min(每10min重悬一次)，用磁力架吸附磁珠，去除1×CD45；

7、加入100μL的孵育液重悬，用磁力架吸附珠去除；

8、加入40μL的1×显色液重悬，染色20min(每10min重悬一次)，用磁力架吸附磁珠，去除1×显色液；

9、加入100μL复染液重悬，1min，磁力架吸附珠，去除复染液；

10、加入100μL孵育液重悬，将快速滴入准备好的载玻片免疫组化圈内，保持免疫组化盖住磁铁吸附制片；

11、在免疫组化圈内，加入3μL封片剂，盖上玻片；

12、荧光显微镜下观察染色结果。

CK和DAPI染色分离细胞的步骤与CD45类似，不再赘述。

(六)荧光显微镜下观察染色结果

对染色后的产物进行扫描计数。比较八组细胞保存液分别保存NCI-H1993细胞与外周血中混合细胞3天、5天和7天后，得到的白细胞及NCI-H1993的数量。表2为10

表2实施例一细胞染色计数结果

由表2可知，本发明细胞保存液(组一和组二)可以稳定保存NCI-H1993和外周血7天，并且维持NCI-H1993细胞和外周血中白细胞表面抗原的表达。细胞保存液试剂浓度的改变(组三和组四)影响NCI-H1993和白细胞的保存效果，细胞被免疫磁珠捕获和进一步免疫荧光鉴定的结果不佳。缺少腺苷、还原型谷胱苷肽或葡萄糖的细胞保存液(组四至组五)对NCI-H1993和白细胞的保存效果也不佳。现有细胞保存液(组八)的保存NCI-H1993和外周血7天的效果不如本发明细胞保存液。

实施例二

采集27例肺癌患者的外周血4ml，加入实施例一的八组细胞保存液1ml，上下颠倒混匀，分别常温放置3天、5天和7天。采用实施例一中的免疫磁珠捕获和免疫荧光鉴定方法，对细胞的保存效果进行检测。细胞染色计数的结果请参阅表3，数值均为平均值。

表3实施例二细胞染色计数结果

由表3可知，本发明细胞保存液可以稳定保存肺癌患者的外周血7天，并且保存期间可以维持白细胞和循环肿瘤细胞(CTC)表面抗原的表达，从而可被免疫磁珠捕获并进一步免疫荧光鉴定。本发明细胞保存液具有重要的临床应用价值，可用于癌症的诊断、病情的实时监测和预后防控等。

实施例三

分别采集31例胃癌患者、20例乳腺癌患者、25例肝癌患者的外周血4ml，加入实施例一的八组细胞保存液1ml，上下颠倒混匀，常温放置7天。采用实施例一中的免疫磁珠捕获和免疫荧光鉴定方法，对细胞的保存效果进行检测。细胞染色计数结果请参阅表4。

表4实施例三细胞染色计数结果

由表4可知，本发明细胞保存液可以稳定保存胃癌患者、乳腺癌患者、肝癌患者的外周血7天，并且保存期间同样可以维持胃癌循环肿瘤细胞、乳腺癌循环肿瘤细胞及肝癌循环肿瘤细胞表面抗原的表达。