一种针对表位点为SSCSSCPLSK的TCR所设计的引物及其应用

技术领域

本发明涉及质粒克隆技术领域，尤其涉及一种针对表位点为SSCSSCPLSK的TCR所设计的引物及其应用。

背景技术

载体是一种运载体(vehicle)，通过其可将多核苷酸序列(例如，外源基因)引入至宿主细胞中，以便转化宿主并促进引入的序列的表达(例如转录和翻译)。载体包括质粒、噬菌体、病毒等。载体的最普遍的类型是质粒，其是指闭合的环状双链DNA环，其中可连接含有目标基因的另外的DNA段。载体的另一种类型为病毒载体，其中将待运输的核酸构建体连接至病毒基因组中。病毒载体可在它们被引入的宿主细胞中自主复制、或可将它们自身整合至宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体可指导与其可操作连接的基因的表达。

要将某一目标基因片段克隆进质粒载体，必须有与目标基因片段序列相匹配的引物。我公司克隆到了3条针对免疫分型为HLA A11的病人体内的EBV病毒蛋白的SSCSSCPLSK表位点的TCR，并对这3条TCR的基因序列申请了专利保护。但是，现有技术中尚没有将此3条TCR的基因序列克隆进质粒载体的引物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种引物对，用于质粒克隆。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案。

本发明提供了一种引物对，所述引物对包括L11-3位点的引物对、L11-6位点的引物对和L11-15位点的引物对中的一种、两种或三种。

作为优选，所述引物对针对分型为HLA A11、表位点为SSCSSCPLSK的患者体内EBV病毒抗原肽段的TCR所设计。

作为优选，所述L11-3位点的引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

作为优选，所述L11-6位点的引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

作为优选，所述L11-15位点的引物对的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供了所述的引物对在质粒克隆中的应用。

本发明提供了一种针对表位点为SSCSSCPLSK的TCR所设计的引物及其应用，所述引物对包括L11-3位点的引物对、L11-6位点的引物对和L11-15位点的引物对中的一种、两种或三种。本发明的引物对针对分型为HLA A11、表位点为SSCSSCPLSK的患者体内EBV病毒抗原肽段的TCR所设计，能够实现特定质粒的克隆。

附图说明

图1为TCRPCR扩增后胶回收电泳结果；

图2为骨架载体质粒图谱；

图3为TCR与载体重组质粒酶切电泳结果；

图4为TCR与载体重组质粒测序峰图；

图5为TCR转染Jurkat细胞，流式检测转染效率；

图6为TCR转染Jurkat细胞后，功能验证流式检测INFg；

图7为TCR转染Jurkat细胞后，功能验证流式检测INFg。

具体实施方式

本发明提供了一种引物对，所述引物对包括L11-3位点的引物对、L11-6位点的引物对和L11-15位点的引物对中的一种、两种或三种。

在本发明中，所述引物对针对分型为HLA A11、表位点为SSCSSCPLSK的患者体内EBV病毒抗原肽段的TCR所设计。

在本发明中，所述L11-3位点的引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

在本发明中，所述L11-6位点的引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

在本发明中，所述L11-15位点的引物对的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供了所述的引物对在质粒克隆中的应用。

在本发明中，所述质粒优选为MP71。

在本发明中，所述质粒骨架为public available information。

在本发明中，所述MP71的序列如SEQ ID NO.7所示。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

引物对设计实例：以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为例。

Forwardprimer(SEQ ID NO.1):GGCCGCGCCACCATGCTGCTGATCA；

Reverse primer(SEQ ID NO.2):GTAGGTCCTCCACCACGGTCAGTCTT。

实施例2载体构建

载体构建其方法包括如下步骤：

1、TCR基因合成后进行PCR扩增以合成的TCR基因为模板，运用SEQ ID NO.1和SEQID NO.2进行PCR扩增；PCR反应体系如下：PCR预混液25μl，正向引物5μl，引物浓度：10μm/μl，反向引物5μl，引物浓度：10μm/μl，合成的TCR基因序列1μl，浓度：10ng/μl，Nuclease-Free Water 14μl，总反应体系共50μl；PCR反应程序：98℃，2min；(98℃，15s；64℃，15s；72℃，20s)30循环；72℃，2min。

2、PCR产物胶回收

对步骤1中的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后胶回收，具体步骤参照试剂盒TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0说明书，制备琼脂糖凝胶，对回收产物片段运行电泳，其结果如图1示。

3、线性化载体与胶回收片段进行同源重组

步骤2中的胶回收PCR产物片段与线性化的载体重组摩尔比为1:1，然后加入10μl的2X Seamless Cloning Mix，并用水补至20μl，50℃反应30min，载体骨架核酸序列如SEQID NO.7所示，重组质粒图谱信息如图2所示。

4、重组质粒载体转化DH5α感受态细菌

取5μl步骤4的反应样品加入到50μl DH5α等感受态细胞中，轻轻混匀，将该混合物置于冰上30min；42℃水浴中90秒进行热激，然后迅速放回冰浴中，静置3～5min；加入300μl不含抗生素的LB培养液，轻轻混匀，37℃震荡培养1h；然后全部均匀涂布到含适当抗生素的LB平板上，37℃培养箱中培养过夜。

5、质粒提取

挑取步骤4中的单克隆菌落，摇菌过夜；取5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，12,000rpm离心1min，吸除上清；向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1，吹散沉淀；向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解；向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，12,000rpm离心10min；将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱中，12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；向吸附柱中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱入收集管中；重复上一步骤；将吸附柱C放入收集管中,12,000rpm离心2min；将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μl洗脱缓冲液，室温放置2min，12,000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

6、重组质粒的鉴定

对步骤5中提取的质粒进行双酶切、测序鉴定，酶切电泳结果及测序峰图见图3、图4。

实施例3载体的使用

本过程包括病毒液的制备及细胞的转染，详细过程如下所述：

1、制备病毒液

Lipo3000转染293FT细胞，转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔板培养板中，Lipo3000试剂转染操作流程详细步骤参见试剂Invitrogen

2、病毒转染Jurkat细胞

293T细胞转染后第二天，用Retronectin包被24孔培养板，4℃过夜备用；将病毒液加入Retronectin包被过的24孔培养板中，32℃，2000g，离心2h，弃去上清液；取适量转染的Jurkat细胞加入24孔培养板中，30℃，600g，离心30min，使细胞贴于底壁；离心完毕后，将培养板置于37℃，5％CO

实施例4：结果验证

结果验证详细过程如下所述：

收集K562细胞，重悬并计数，在24孔板中进行刺激共培养，每孔4e

由以上实施例可知，本发明提供了一种针对表位点为SSCSSCPLSK的TCR所设计的引物及其应用，所述引物对包括L11-3位点的引物对、L11-6位点的引物对和L11-15位点的引物对中的一种、两种或三种。本发明的引物对针对分型为HLA A11、表位点为SSCSSCPLSK的患者体内EBV病毒抗原肽段的TCR所设计，能够实现特定质粒的克隆。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 广东天科雅生物医药科技有限公司

<120> 一种针对表位点为SSCSSCPLSK的TCR所设计的引物及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggccgcgcca ccatgctgct gatca 25

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtaggtcctc caccacggtc agtctt 26

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gccgcgccac catgaagaga at 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtaggtcctc cagcactgtc ag 22

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgcgccacc atggcgacgg gttcaa 26

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgtaggtcct ccagcaccag cagtctt 27

<210> 7

<211> 5979

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaggacctac gtaacgtgac ccctcccaag gtgtccctgt tcgagcctag caaggccgag 60

atcgccaaca agcagaaggc cacactcgtc tgcctggcta gaggcttctt cccagaccac 120

gtggagctgt cttggtgggt gaacggcaag gaggtgcact caggagtgtc taccgaccct 180

caggcctaca aggagagcaa ctacagctac tgcctgtcct ccagactcag ggtctgcgcc 240

accttttggc acaaccctcg gaaccacttc cgctgtcagg tccagttcca cggcctgtcc 300

gaggaagaca agtggccaga gggctctcct aagccagtga cacagaacat cagcgccgag 360

gcttggggaa gagccgattg cggaatcacc agcgcctctt accagcaggg agtgctgtca 420

gctaccatcc tgtacgagat cctgctgggc aaggccacac tgtacgcagt gctggtgtcc 480

actctggtcg tgatggctat ggtgaagcgg aagaacagct aggaattcga gcatcttacc 540

gccatttatt cccatatttg ttctgttttt cttgatttgg gtatacattt aaatgttaat 600

aaaacaaaat ggtggggcaa tcatttacat tttatgggat atgtaattac tagttcaggt 660

gtattgccac aagacaaaca tgttaagaaa ctttcccgtt atttacgctc tgttcctgtt 720

aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg atattcttaa ctatgttgct 780

ccttttacgc tgtgtggata tgctgcttta atgcctctgt atcatgctat tgcttcccgt 840

acggctttcg ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 900

tggcccgttg tccgtcaacg tggcgtggtg tgctctgtgt ttgctgacgc aacccccact 960

ggctggggca ttgccaccac ctgtcaactc ctttctggga ctttcgcttt ccccctcccg 1020

atcgccacgg cagaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctaggttg 1080

ctgggcactg ataattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 1140

gcctgtgttg ccaactggat cctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggctctc 1200

aatccagcgg acctcccttc ccgaggcctt ctgccggttc tgcggcctct cccgcgtctt 1260

cgctttcggc ctccgacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tgtttcgcct 1320

cggcgtccgg tccgtgttgc ttggtcgtca cctgtgcaga attgcgaacc atggattcca 1380

ccgtgaactt tgtctcctgg catgcaaatc gtcaacttgg catgccaaga ataattcgga 1440

tccaagctta ggcctgctcg ctttcttgct gtcccatttc tattaaaggt tcctttgttc 1500

cctaagtcca actactaaac tgggggatat tatgaagggc cttgagcatc tggattctgc 1560

ctagcgctaa gcttaacacg agccatagat agaataaaag attttattta gtctccagaa 1620

aaagggggga atgaaagacc ccacctgtag gtttggcaag ctagcttaag taacgccatt 1680

ttgcaaggca tggaaaatac ataactgaga atagagaagt tcagatcaag gttaggaaca 1740

gagagacagc agaatatggg ccaaacagga tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct 1800

cagggccaag aacagttgga acagcagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca 1860

gttcctgccc cggctcaggg ccaagaacag atggtcccca gatgcggtcc cgccctcagc 1920

agtttctaga gaaccatcag atgtttccag ggtgccccaa ggacctgaaa tgaccctgtg 1980

ccttatttga actaaccaat cagttcgctt ctcgcttctg ttcgcgcgct tctgctcccc 2040

gagctcaata aaagagccca caacccctca ctcggcgcgc cagtcctccg atagactgcg 2100

tcgcccgggt acccgtgttc tcaataaacc ctcttgcagt tgcatccgac tcgtggtctc 2160

gctgttcctt gggagggtct cctctgagtg attgactgcc cacctcgggg gtctttcatt 2220

ctcgagcagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct 2280

cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg 2340

agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct 2400

gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg 2460

gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 2520

ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 2580

aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 2640

ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 2700

gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 2760

cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 2820

gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 2880

tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 2940

cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 3000

cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 3060

gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 3120

agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 3180

cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 3240

tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 3300

tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag 3360

ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat 3420

cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc 3480

cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat 3540

accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag 3600

ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg 3660

ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc 3720

tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca 3780

acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg 3840

tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc 3900

actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta 3960

ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc 4020

aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg 4080

ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc 4140

cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc 4200

aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat 4260

actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag 4320

cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc 4380

ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa 4440

taggcgtatc acgaggccct ttcgtctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg 4500

acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca 4560

agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggctggctta actatgcggc 4620

atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt 4680

aaggagaaaa taccgcatca ggcgccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg 4740

gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag 4800

gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag 4860

tgaattagta ctctagctta agtaacgcca ttttgcaagg catggaaaat acataactga 4920

gaatagagaa gttcagatca aggttaggaa cagagagaca gcagaatatg ggccaaacag 4980

gatatctgtg gtaagcagtt cctgccccgg ctcagggcca agaacagttg gaacagcaga 5040

atatgggcca aacaggatat ctgtggtaag cagttcctgc cccggctcag ggccaagaac 5100

agatggtccc cagatgcggt cccgccctca gcagtttcta gagaaccatc agatgtttcc 5160

agggtgcccc aaggacctga aatgaccctg tgccttattt gaactaacca atcagttcgc 5220

ttctcgcttc tgttcgcgcg cttctgctcc ccgagctcaa taaaagagcc cacaacccct 5280

cactcggcgc gccagtcctc cgatagactg cgtcgcccgg gtacccgtat tcccaataaa 5340

gcctcttgct gtttgcatcc gaatcgtgga ctcgctgatc cttgggaggg tctcctcaga 5400

ttgattgact gcccacctcg ggggtctttc atttggaggt tccaccgaga tttggagacc 5460

cctgcccagg gaccaccgac ccccccgccg ggaggtaagc tggccagcgg tcgtttcgtg 5520

tctgtctctg tctttgtgcg tgtttgtgcc ggcatctaat gtttgcgcct gcgtctgtac 5580

tagttggcta actagatctg tatctggcgg tcccgcggaa gaactgacga gttcgtattc 5640

ccggccgcag cccctgggag acgtcccagc ggcctcgggg gcccgttttg tggcccattc 5700

tgtatcagtt aacctacccg agtcggactt tttggagctc cgccactgtc cgaggggtac 5760

gtggctttgt tgggggacga gagacagaga cacttcccgc ccccgtctga atttttgctt 5820

tcggttttac gccgaaaccg cgccgcgcgt cttgtctgct gcagcatcgt tctgtgttgt 5880

ctctgtctga ctgtgtttct gtatttgtct gaaaattagc tcgacaaagt taagtaatag 5940

tccctctctc caagctcact tacaggcggc cgcgccacc 5979