基于ACP@Ce/Tb-IPA的比率荧光和比色双模式检测农药残留的方法

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，涉及农药残留的检测方法，尤其涉及一种基于ACP@Ce/Tb-IPA的比率荧光和比色双模式检测农药残留的方法。

背景技术

农药在保障农作物产量方面发挥了重要作用，但其长期大量使用不仅容易使病虫害产生耐药性，而且农药的残留也会在农作物、土壤和废水中不断累积。事实上，只有大约1％的农药真正发挥了作用，其余则进入自然环境，通过食物链大量积累并持久残留，最后对人体健康造成危害，导致急性中毒、致癌和多种疾病的发生，甚至影响到下一代，因此建立操作简单、成本低廉、准确度高的农药残留检测方法具有十分重要的意义。

目前农药残留的检测方法主要有色谱法、电化学法、光谱法以及表面增强拉曼光谱法等方法。例如：

中国专利CN113607861A《一种磁力搅拌结合溶胶凝胶通过液相色谱串联质谱检测蔬菜中48种农药残留的分析方法》公开了一种磁力搅拌结合溶胶凝胶通过液相色谱串联质谱检测蔬菜中48种农药残留的分析方法，它包括溶胶凝胶的合成，萃取装置的制作，标准工作溶液的配制，检测样品的制备，样品的萃取过程，结合液质联用技术，正离子MRM模式进行检测，测定蔬菜中48种农药的多残留分析方法。该方法操作简单，是一种全新的快捷、准确、高效的农药残留检测方法。

中国专利CN113804662A《一种生鲜果蔬中专用于敌敌畏农药残留的快速检测方法》公开了一种利用有机磷农药和氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶(AChE，来源于鸭血提取)活性的特异性抑制作用，应用超高灵敏荧光素荧光探针检测农药残留含量。该方法生物酶的底物原型和水解产物的荧光属性具有明显差异，且产物荧光具有更高的灵敏度，根据反应体系添加农药的前后荧光的变化达到检测目的。

中国专利CN109507144B《嵌入式水体有机磷农药残留检测装置与方法》公开了一种采用近红外光谱检测技术，直接放入待测水体中，实现了水体有机磷农药含量实时检测。浸入式光纤探头检测模块采集待测有机磷农药样品的透过光与背散光并输出至光谱仪中，光谱仪将光信号分解为光谱信号后输出至光谱信息处理模块中，根据输出信号的光谱数据差异进行检测。

中国专利CN113804666A《基于CYP3A4酶抑制法的生鲜果蔬中农药残留的快速检测方法》公开了一种基于CYP3A4酶抑制法的生鲜果蔬中农药残留的快速检测方法，其属于农药残留快速检测的技术领域。于农药对细胞色素氧化酶CYP3A4活性的特异性抑制作用，应用萘胺酰亚胺类荧光探针检测其抑制程度，开发了8种农药的快速检测方法。

中国专利CN113624741A《一种基于表面增强拉曼光谱SERS技术的柑橘中苯咪唑类农药残留快速检测方法及系统》公开了一种苯咪唑类农药残留拉曼信号的表面增强放大技术，依据相关的拉曼光谱基线校正、变量筛选结合定量预测方法，构建柑橘中苯咪唑类农药残留拉曼光谱的快速免标记的数据处理与预测流程，最终实现农残的定性定量检测。

上述已公开的农药残留检测方法虽然具有一定的检测效率，但仍具有以下缺点和不足：

(1)有些检测方法操作相对复杂，检测仪器设备相对昂贵；

(2)有些检测方法只有单一的输出信号，准确性得不到验证。

发明内容

为了解决上述现有技术存在的问题和不足，本发明的目的是提供一种基于ACP@Ce/Tb-IPA的比率荧光和比色双模式检测农残的方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种基于ACP@Ce/Tb-IPA的比率荧光和比色双模式检测农药残留的方法，包括如下步骤：

(1)分别于1.5mL离心管中加入50μL 1mg/mL的ACP@Ce/Tb-IPA分散液，加入不同浓度的有机磷农药对氧磷，室温孵化30min；

(2)继续加入930μL NaAc-HAc溶液和20μL浓度为10mM的AAP溶液，37℃反应1～25min得混合体系，优选20min；其中，所述对氧磷在混合体系内的最终浓度分别为30ng/mL、60ng/mL、100ng/mL、160ng/mL、240ng/mL、400ng/mL、600ng/mL、800ng/mL、1200ng/mL；用荧光分光光度计检测混合体系的荧光，记录在250nm激发波长下，发射波长为358nm和496nm处的发射波长强度，绘制以对氧磷浓度为横坐标，以496nm与358nm处的发射波长强度比值为纵坐标的标准工作曲线；

(3)再向混合体系中加入30μL的TMB溶液，室温孵化1～15min得混合液，优选11min；其中，所述对氧磷在混合液中的最终浓度分别为29.13ng/mL、58.25ng/mL、97.09ng/mL、155.34ng/mL、233.00ng/mL、388.35ng/mL、582.52ng/mL、776.70ng/mL、1165.05ng/mL；用紫外-可见吸收分光光度计测定混合液的吸光度；记录波长为652nm处的吸光度，并绘制以对氧磷浓度为横坐标，652nm处的吸光度为纵坐标的标准工作曲线；

(4)取20μL待测的对氧磷样品置于含有50μL 1mg/mL的ACP@Ce/Tb-IPA分散液的1.5mL离心管中，室温孵化30min，继续加入930μL NaAc-Hac缓冲溶液和20μL浓度为10mM的AAP溶液，37℃反应1～25min得混合体系，用荧光分光光度计检测荧光，记录在250nm激发波长下，发射波长为358nm和496nm处的发射波长强度；再加入30μL的TMB溶液室温孵化1～15min，用紫外-可见吸收分光光度计记录波长为652nm处的吸光度，通过计算再与标准工作曲线对比，即可获得有机磷农药对氧磷浓度。

本发明较优公开例中，步骤(2)中所述NaAc-HAc缓冲液的浓度为0.2M，pH为4.0。

本发明较优公开例中，步骤(3)中所述TMB溶液，将TMB溶解于乙醇中，浓度为10mM。

本发明较优公开例中，步骤(4)中所述待测对氧磷的可检测浓度范围为29.13～1200.00ng/mL，检测限低至15.00ng/mL。

本发明的另外一个目的，在于公开了上述ACP@Ce/Tb-IPA即负载酸性磷酸酶的Ce/Tb-IPA配位聚合物纳米酶的制备方法，包括如下步骤：

A.0.274g硝酸铈铵(Ce(NH

B.取干燥Ce/Tb-IPA 100mg、600μL ACP溶液(20mg/mL)和1mL三乙胺混合于20mL去离子水中，超声处理后低温磁搅拌24h，离心收集固体，用去离子水和乙醇多次洗涤，将收集的ACP@Ce/Tb-IPA真空干燥，即得。

进一步，步骤A中离心产物时转速10000r/min，离心时间10min，真空干燥温选50℃。

进一步，步骤B中离心产物时转速8000r/min，离心时间5min，真空干燥温度45℃；酸性磷酸酶(ACP)来源于小麦胚芽(0.4U/mg)。

根据本发明所公开的方法制得的ACP@Ce/Tb-IPA纳米颗粒作为类氧化物酶，是粒径为200nm左右的黄色球形纳米颗粒。

本发明所公开的ACP@Ce/Tb-IPA的制备方法，参考自Wang,L.；Chen,Y.,Areaction-triggered luminescent Ce

本发明以ACP@Ce/Tb-IPA为类氧化酶模拟物，在酸性条件下，能够催化体系中的溶解氧产生超氧阴离子，显色剂(TMB)与超氧阴离子发生氧化还原反应，产生显色产物(TMBox)，使溶液由无色变成蓝色。除此之外，间苯二甲酸(IPA)配体吸收外界能量并将其转移给Ce

本发明所用反应物、试剂均为市售。

在本说明书中，术语“纳米酶”是指具有类酶催化活性的材料。具体地，纳米酶是一类蕴含酶学特性的纳米材料，在纳米尺度表现出只有天然酶才具有的酶学催化特性，它能够在生理条件下催化天然酶所介导的生化反应，表现出天然酶所具有的反应动力学和催化机制。

在本说明书中，术语“类氧化酶”是指具有氧化酶催化活性。具体地，本发明的类氧化酶以溶解氧作为电子受体，通过催化氧化显色底物生成有色物质，用于比色检测。

在本说明书中，术语“Tb-IPA”是单一铽离子配位聚合物的缩写名称，二者可互换使用。

在本说明书中，术语“TMB”是化合物“3,3’,5,5’-四甲基联苯胺”的缩写名称，二者可互换使用。

在本说明书中，术语“TMBox”是化合物“3,3’,5,5’-四甲基联苯胺”氧化产物的缩写名称，二者可互换使用。

在本说明书中，术语“ACP”是指酸性磷酸酶，二者可互换使用。

在本说明书中，术语“AAP”是指抗坏血酸磷酸酯镁，二者可互换使用。

有益效果

本发明利用ACP活性的特异性触发抑制以及副产物对ACP@Ce/Tb-IPA类氧化酶和发光特性的潜在影响，实现对农药残留的双模式间接检测；通过比率荧光模式ACP@Ce/Tb-IPA+AAP体系检测对氧磷，检测限低至15ng/mL，可检测范围宽至0.03-1.20μg/mL；比色模式ACP@Ce/Tb-IPA+AAP+TMB体系检测对氧磷，检测限低至21ng/mL，可检测范围宽至0.029-1.17μg/mL；与此同时，利用ACP@Ce/Tb-IPA+AAP体系与ACP@Ce/Tb-IPA+AAP+TMB体系检测蔬菜中的农药残留含量，验证了其在真实环境和食品分析中的巨大潜力。

附图说明

图1.不同反应体系的紫外-可见吸收光谱；

图2.ACP@Ce/Tb-IPA+TMB体系的条件优化(其中A：ACP@Ce/Tb-IPA类氧化酶的pH缓冲液优化图；B：ACP@Ce/Tb-IPA+TMB体系不同反应时间的紫外-可见吸收光谱)；

图3.ACP@Ce/Tb-IPA荧光光谱；

图4.不同反应体系的荧光光谱；

图5.不同反应体系的紫外-可见吸收光谱；

图6.对氧磷影响ACP@Ce/Tb-IPA+AAP体系反应的荧光光谱以及ACP@Ce/Tb-IPA+AAP+TMB体系反应的紫外-可见吸收光谱；(其中，A：反应30min时的荧光光谱；B：F

图7.比率荧光与比色双模式检测体系的选择性验证。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

1.将物质的量均为0.50mmol的硝酸铈铵(Ce(NH

2.将溶液A倒入含间苯二甲酸(IPA，100mM)的40mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，搅拌20min，形成黄色的均匀溶液B；

3.将溶液B倒入反应釜，在鼓风式烘箱中以150℃加热反应5h；产物自然冷却后，以10000r/min的转速离心10min分离产物，并用乙醇洗涤干净，50℃真空干燥12h；

4.取干燥后的反应产物100mg，加入600μL ACP溶液(20mg/mL)和1mL三乙胺混合在20mL去离子水中，超声处理10min后，低温磁力搅拌12h，离心收集固体，用去离子水和乙醇多次洗涤；将收集的ACP@Ce/Tb-IPA在45℃真空干燥12h，得到粒径为200nm左右的ACP@Ce/Tb-IPA黄色固体纳米颗粒。

ACP@Ce/Tb-IPA作为类氧化物酶催化氧化TMB反应的应用实验，步骤是：

取920μL的NaAc-HAc溶液(0.2M,pH 4.0)，依次向其中加入50μL 10mM的TMB和50μL1mg/mL的ACP@Ce/Tb-IPA分散溶液，混合均匀，室温反应11min，液体颜色随时间由无色变化为蓝色，用紫外-可见吸收分光光度计测定吸光度。

图1记录了制备的ACP@Ce/Tb-IPA在不同体系中催化氧化TMB反应的UV-Vis图。由图可知，只有当TMB和ACP@Ce/Tb-IPA共同存在时，才会有颜色反应发生,且在空气介质中反应才彻底；当TMB或ACP@Ce/Tb-IPA单独存在时，不会发生颜色反应。此反应是由ACP@Ce/Tb-IPA催化体系中的溶解氧产生超氧阴离子，显色剂(TMB)与超氧阴离子发生氧化还原反应导致的，证明制备的ACP@Ce/Tb-IPA具有良好的类氧化物酶活性。

实施例2

1.取制备好的ACP@Ce/Tb-IPA 10mg溶于10mL超纯水中，并超声搅拌，形成黄色的均匀溶液；

2.分别取920μL pH值分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的NaAc-HAc溶液，依次向其中加入50μL 10mM的TMB和50μL 1mg/mL的ACP@Ce/Tb-IPA分散溶液，混合均匀，室温反应11min，液体颜色随时间由无色变化为蓝色；

3.用紫外-可见吸收分光光度计测定吸光度；

结果如图2A所示，随着pH的增大，吸光度值呈先增大后减小的趋势，并在pH控制在4.0时吸光度(652nm)值最高，达到峰值。由图可知，pH控制在4.0时，酶的催化活性最好；

4.分别取920μL的NaAc-HAc溶液(0.2M,pH 4.0)，依次向其中加入30μL 10mM的TMB和50μL 1mg/mL的ACP@Ce/Tb-IPA分散溶液，然后将上述溶液混合均匀，利用紫外-可见吸收分光光度计测定不同时间内的吸光度，随着时间的增加，吸光度值逐渐增大的趋势。由图2B可知，在反应时间为11min时，吸光度(652nm)达到目标值。

实施例3

1.取制备好的ACP@Ce/Tb-IPA 10mg溶于10mL超纯水中，超声搅拌，形成黄色的均匀溶液；

2.分别取920μL NaAc-HAc溶液(0.2M,pH 4.0)，依次向其中加入50μL 1mg/mL的ACP@Ce/Tb-IPA分散溶液，混合均匀，用荧光分光光度计测定上述混合溶液荧光光谱。

由图3可知，在358nm和496nm有两处荧光信号。

实施例4

ACP@Ce/Tb-IPA+AAP反应体系的荧光光谱

1.分别取930μL NaAc-HAc溶液(0.2M,pH 4.0)于1.5mL离心管中，依次向其中加入50μL的ACP@Ce/Tb-IPA(1mg/mL)分散溶液和20μL AAP溶液(10mM)，37℃反应20min，用荧光分光光度计检测ACP@Ce/Tb-IPA+AAP体系的荧光；

结果如图4所示，ACP@Ce/Tb-IPA体系中的荧光信号分别是弱的358nm处的Ce

2.分别取50μL 1mg/mL的ACP@Ce/Tb-IPA分散溶液和20μL的50mg/L对氧磷溶液于1.5mL离心管中，37℃反应30min；加入930μL NaAc-HAc溶液(0.2M,pH 4.0)和20μL AAP溶液(10mM)，继续反应20min；用荧光分光光度计检测含有对氧磷的ACP@Ce/Tb-IPA+AAP体系的荧光。

由图4可知，358nm处的Ce

实施例5

ACP@Ce/Tb-IPA+AAP+TMB反应体系的紫外-可见吸收光谱

1.分别取930μL 0.2M的NaAc-HAc溶液(0.2M,pH 4.0)于1.5mL离心管中，依次向其中加入50μL 1mg/mL的ACP@Ce/Tb-IPA分散溶液和30μL TMB溶液(10mM，用乙醇配制)，室温反应11min，用紫外-可见分光光度计检测ACP@Ce/Tb-IPA+TMB体系的吸光度；

结果如图5所示，ACP@Ce/Tb-IPA+TMB体系液体颜色随时间由无色变化为蓝色，在652nm处有较强的紫外吸收信号；

3.分别取50μL 1mg/mL的ACP@Ce/Tb-IPA分散溶液和20μL AAP溶液(10mM)，37℃反应20min；然后加入930μL NaAc-HAc溶液(0.2M,pH 4.0)和30μL TMB溶液(10mM，用乙醇配制)，室温下再次反应11min；用紫外-可见分光光度计检测ACP@Ce/Tb-IPA+AAP+TMB体系的紫外吸收信号；

由图5可知，652nm处的紫外吸收信号被抑制；

4.分别取50μL 1mg/mL的ACP@Ce/Tb-IPA分散溶液和20μL的50mg/L对氧磷溶液于1.5mL离心管中，37℃反应30min；然后加入930μL NaAc-HAc溶液(0.2M,pH 4.0)和20μL AAP溶液(10mM)，再次反应20min；加入30μL TMB溶液(10mM，用乙醇配制)，室温反应11min，用紫外-可见分光光度计检测含有对氧磷的ACP@Ce/Tb-IPA+AAP+TMB体系的紫外吸收信号。

由图5可知，652nm处的紫外吸收信号恢复。

实施例6

利用荧光和紫外双模式反应体系检测对氧磷含量

1.分别取50μL 1mg/mL的ACP@Ce/Tb-IPA分散溶液和20μL的不同浓度的对氧磷溶液于1.5mL离心管中，37℃反应30min；然后加入930μL NaAc-HAc溶液(0.2M,pH 4.0)和20μLAAP溶液(10mM)，再次反应20min；用荧光分光光度计检测含有不同浓度对氧磷的ACP@Ce/Tb-IPA+AAP体系的荧光；所述对氧磷在体系内的最终浓度分别为30ng/mL、60ng/mL、100ng/mL、160ng/mL、240ng/mL、400ng/mL、600ng/mL、800ng/mL、1200ng/mL；

2.再向混合液中依次加入30μL TMB溶液，室温下反应11min，用紫外-可见分光光度计检测含有不同浓度对氧磷的ACP@Ce/Tb-IPA+AAP+TMB体系的紫外吸收信号；

3.将上述混合液用荧光分光光度计测定在358nm和496nm处的荧光信号强度，绘制以对氧磷浓度为横坐标，以496nm与358nm处荧光信号强度的比值为纵坐标的标准工作曲线；紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液在652nm处的吸光度，绘制以对氧磷浓度为横坐标，以652nm处吸光度为纵坐标的标准工作曲线。

利用本方法对于对氧磷浓度检测的结果如图6所示。其中，图6A表明随着对氧磷浓度的增加，溶液在358nm处的荧光信号强度逐渐减小，在496nm处的荧光信号强度逐渐增大。图6B是荧光光谱在496nm与358nm处荧光信号强度比值的拟合直线，表明该方法对于对氧磷浓度的可检测范围为0.03-1.20μg/mL，有优良的检测效果；图6C说明随着对氧磷浓度的增加，溶液的吸光度逐渐增大。图6D是紫外吸收光谱在652nm处吸光度的拟合直线，说明在该方法对于对氧磷浓度的可检测范围为0.029-1.17μg/mL，有优良的检测效果。

实施例7

利用反应体系检测对氧磷的选择性

1.分别于1.5mL离心管中加入50μL 1mg/mL的ACP@Ce/Tb-IPA分散溶液和20μL240ng/mL的对氧磷溶液，37℃反应30min；然后向混合溶液中加入20μL AAP溶液(10mM)，再次反应20min；然后加入930μL NaAc-HAc溶液(0.2M,pH 4.0)混匀均匀后，用荧光分光光度计检测信号；再向上述混合溶液加入30μL 10mM的TMB溶液，在室温下反应11min，用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液在652nm处的吸光度；

2.向上述混合液中分别加入10μL 10mM不同种类的阳离子、阴离子以及葡萄糖和谷氨酸，重复试验；

结果如图7所示，图7是用反应体系检测对氧磷的选择性的柱状图，柱状图从左到右依次为空白、钠离子(Na

实施例8

利用反应体系检测实际样品中的对氧磷的浓度

首先在温室条件下栽培了两组菠菜。在种植过程中，不添加任何化学试剂营养物质。20d后，取一组菠菜作为空白样品，另一组喷洒对氧磷溶液(10μg/mL)，2h后，去除根部土壤，称取整棵菠菜置于甲醇溶液中，超声浸泡5min后高速离心菠菜中的对氧磷。采用上述方法对提取样品进行测定。

结果如表1所示：

表1.本方法及国家标准方法对实际样品检测结果对比

由上表可知，反应体系对实际样品中对氧磷含量的变化响应灵敏，与国家标准方法相比，结果较为精准。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，并非因此限制本发明的专利范围。凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。