一种ELISA法检测人肿瘤坏死因子TNF-α的方法

技术领域

本发明属于生物医疗检测技术领域，具体涉及一种ELISA法检测人肿瘤坏死因子TNF-α的方法。

背景技术

TNF-α(肿瘤坏死因子α)，是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子，是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子之一。

ELISA检测原理包括向载体酶标板孔中加入捕获抗体，捕获抗体包被在该载体上，形成固相抗体，保持其免疫活性；然后向酶标板孔中加入样品，样品中待检测蛋白与固相抗体特异性结合，形成固相抗原复合物，洗涤除去杂质；再向酶标板孔中加入带有生物素的检测抗体，检测抗体与固相抗原复合物结合；最后向酶标板孔中加入带有亲和素的辣根过氧化酶。再加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，有色产物的量与样品中待检测蛋白的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定量分析。

目前市面上存在许多人TNF-α的ELISA检测试剂盒，原理基本一致，通过抗原抗体反应联合TMB显色来检测TNF-α。但这些试剂盒在TNF-α存在标准品稀释浓度偏低，无细胞共培养材料、使用不便等不足之处。

发明内容

针对上述不足，本发明的目的是提供一种ELISA法检测人肿瘤坏死因子 TNF-α的方法。

本发明提供了如下的技术方案：

一种ELISA法检测人肿瘤坏死因子TNF-α的方法，包括如下步骤：

S1、样品处理：

血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右(2000-3000转/分)；

S2、ELISA检测：

S21、标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50ul；

S22、加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔，在酶标包被板上待测样品孔中加样品50ul；

S23、加酶：每孔加入酶标试剂100ul，空白孔除外；

S24、温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟；

S25、配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用；

S26、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔洗涤液(250ul左右)，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；

S27、显色：每孔先加入显色剂A 50ul，再加入显色剂B 50ul，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；

S28、终止：每孔加终止液50ul，终止反应(此时蓝色立转黄色)；

S29、测定：450nm波长依序测量各孔的吸光度OD值；

S210、计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线，计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

优选地，所述S1样品处理步骤中，收集的上清保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

优选地，所述S22加样步骤中，加样时将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

优选地，所述所述S29测定步骤中，测定应在加终止液后15分钟以内进行。

优选地，所述S1、S2步骤完成后，具体的验证方法分别为：

(1)线性：分别取不同浓度的标准品溶液，按照S2中方法进行检测，分别做3个平行，记录各孔OD值，作标准曲线，并给出标准曲线线性方程及相关系数；

(2)重复性：取来源于3个志愿者的血清，按照S2中的方法进行TNF- α检测，各做6个平行，进行显色后，记录各孔OD值，代入标准曲线计算TNF- α含量及RSD值；

(3)准确度：选择一份血清样品，分别加入浓度为40pg/ml、20pg/ml、 10pg/ml的标准品溶液进行2倍稀释制备加标样品，按照S2中的方法进行检测，分别做3个平行，记录各孔OD值，根据标准曲线计算TNF-α含量，计算回收率重复三次试验；

(4)区间精密度：由两名不同实验人员各自独立操作，按照S2中的方法对来源于3个志愿者的血清进行检测，分别做6个平行，酶标仪读取OD值后，计算样品浓度，求出平均值，并计算所得结果含量的RSD值。

本发明的有益效果是：

1、本发明只需要少量的血清样品，便可以对疾病进行更加便捷的检测；

2、本方法的检测方案中线性、重复性、准确度、区间精密度等检测结果均满足适用血清样本TNF-α的含量测定；

3、本发明操作简单、检测速度快、可定量检测和大批量检测，具有良好的应用前景。

附图说明

图1-3是本发明的OD值与TNF-α浓度三次独立试验标准曲线图。

具体实施方式

方法原理：本法应用双抗体夹心法测定标本中人TNF-α水平。用纯化的人 TNF-α捕获得到的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入含人TNF-α的样品，再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人肿瘤坏死因子(TNF-α)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中人肿瘤坏死因子(TNF-α)含量。

具体的实验过程如下：

1、仪器设备：酶标仪，培养箱(37℃)，离心机；

2、试剂与材料：肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒(上海酶联生物技术有限公司)，含包被板、标准品、酶标试剂、样品稀释液、显色剂、终止液和洗涤液，蒸馏水、1.5ml EP管，多道微量移液器，单通道移液器(2ul、20ul、200ul、1ml)，微量移液器吸头(无菌，无致热源)，加样槽，烧杯，量筒。

3、检测方法

3.1样品处理

血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右(2000-3000转/ 分)。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

3.2 ELISA检测

3.2.1标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50ul。

3.2.2加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中加样品50ul。加样时将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.2.3加酶：每孔加入酶标试剂100ul，空白孔除外。

3.2.4温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。

3.2.5配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

3.2.6洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔洗涤液(250ul左右)，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

3.2.7显色：每孔先加入显色剂A 50ul，再加入显色剂B 50ul，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。

3.2.8终止：每孔加终止液50ul，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

3.2.9测定：450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

3.2.10计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线，计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

4、方法验证

4.1线性

分别取不同浓度的标准品溶液,按照3.2中方法进行检测，分别做3个平行。记录各孔OD值，作标准曲线，并给出标准曲线线性方程及相关系数。相关系数应大于0.95。

4.2重复性

取来源于3个志愿者的血清，按照3.2中方法进行TNF-α含量检测，各做 6个平行。进行显色后，记录各孔OD值，代入标准曲线计算TNF-α含量及 RSD值。

4.3准确度

选择一份血清样品，分别加入浓度为40pg/ml、20pg/ml、10pg/ml的标准品溶液进行2倍稀释制备加标样品。按照3.2中方法进行检测，分别做3个平行。记录各孔OD值，根据标准曲线计算TNF-α含量，计算回收率重复三次试验。

4.4区间精密度

由两名不同实验人员各自独立操作，按照3.2中方法对来源于3个志愿者的血清进行检测，分别做6个平行，酶标仪读取OD值后，计算样品浓度，求出平均值，并计算所得结果含量的RSD值。

5、验证结果

5.1线性

分别取浓度为2.5pg/ml、5pg/ml、10pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml的 TNF-α标准品溶液,按照3.2中方法进行检测，分别做3个平行。记录各孔OD 值，作标准曲线，结果表明TNF-α在浓度范围为2.5pg/ml-80pg/ml的范围内， OD值与TNF-α浓度呈现良好的回归关系，三次独立试验标准曲线及回归系数如图1-3。由图1-3可以看出三次试验相关系数均大于0.95，符合要求。

5.2重复性

取来源于3个志愿者的血清，按照3.2中方法进行TNF-α含量检测，各做 6个平行。进行显色后，记录各孔OD值，代入标准曲线计算TNF-α含量及 RSD值。结果如下：

由上表可看出，三个样本TNF-α含量测定结果RSD均在15％以内，重复性良好。

5.3准确度

选择一份血清样品，分别加入浓度为40pg/ml、20pg/ml、10pg/ml的标准品溶液进行2倍稀释制备加标样品。按照3.2中方法进行检测，分别做3个平行。记录各孔OD值，根据标准曲线计算TNF-α含量，计算回收率。结果如下：

由上表可看出，高中低三个浓度加标回收率均处于70％-130％之间，符合要求。

5.4区间精密度

取来源于3个志愿者的血清，由本实验室两名不同的实验人员A与B分别独立操作，各检测六次。计算各样本的TNF-α含量及RSD。

由上表可看出两个不同人员分别测定三个样本TNF-α含量，结果RSD均在15％以内，区间精密度良好。

6、结论

本验证方案对该方法的线性、重复性、准确度区间精密度等方面进行了考察，结果表明该方法适于血清样本TNF-α含量测定。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。