一种止咳化痰中药的指纹图谱检测方法

技术领域

本发明涉及一种止咳化痰中药的指纹图谱检测方法，属于中成药质量检测方法领域。

背景技术

本发明所述的止咳化痰中药为咳露口服液，该产品是陕西步长有限公司的独家专利，为步长制药中成药大品种。由1999年开始研制，2004年批准生产,国家药品监督管理局批准文号为国药准字Z20027542，国家药品标准编号为WS-11419(ZD-1419-2002。其主要由川贝母、麻黄、紫苑、枇杷叶、黄芩、罂粟壳、薄荷脑、甘草8味中药配伍组成，具有宣肺平喘、止咳化痰功效。临床上可用于平喘、祛痰、抗感染等作用，能针对呼吸系统感染所致咳嗽、痰多、咽喉肿痛、咳喘等症状进行治疗,且对咽喉、气管、肺部病变等引起的咳嗽均可迅速起效,临床疗效显著。鉴于先前本申请人对该产品布局多件专利申请，其申请号为：02153462.4、200410022068.6、201110327915.X、201110327912.6、201110327913.0、201110327914.5，上述专利技术保护主题主要为：该药品的组方、制备工艺、滴丸、软胶囊等。目前咳露口服液产品的质量标准执行的现行标准为WS-11419(ZD-1419)-2002，该检测标准中薄层鉴别鉴定的成分有黄芩苷、磷酸可待因和吗啡对照品，该检测方法中以每1ml含麻黄以盐酸麻黄碱(C10H15No·HCl)计，不得少于65μg。但现有的该产品检测方法仅检测单一的指标成分，以不能满足中药复方有效成分众多的内在质量的控制要求，故研究一种多指标检测质量控制方法显得尤为重要。

中药复方药效物质基础研究是中医药现代化研究的关键热点技术领域，其也是决定中药安全性、有效性和质量控制性的基础。对于目前传统的中药由于有效物质成分复杂，药物作用机制不明确也是制约中医药现代化的制约因素。近年来，中药指纹图谱作为现代综合分析手段，可用于分析活性成分的药效成分及非药效成分，符合中医药整体观和系统性特点。并通过对活性化合物基础性研究，建立既能客观反映物质基础又能明确其整体组成的控制，是一种有效的分析方法，已广泛应用于中药质量标准的控制。由于咳露口服液在临床实践应用中的效果良好，市场前景广阔，仅通过单一成分不能够全面控制其内在质量，故在原有单成分基础上建立多指标成分分析结合色谱指纹图谱的中药质量控制模式，解决从整体上全面控制中药质量的方法学问题。本发明采用UPLC分析方法，建立咳露口服液中药制剂指纹图谱并对已确定成分指认及含量测定，进行较全面的质量控制。

发明内容

根据上述问题，本发明提供一种止咳化痰中药的指纹图谱检测方法，其中本专利采用的UPLC法具有检测时间短，溶剂消耗少，同时在不同检测波长下标定出19～25个色谱峰，并指认出芹糖异甘草苷、异甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵等6种有效成分，该指纹图谱检测方法具有检测成分全面、操作简便、专属性强、方法稳定可靠的优点，该指纹图谱检测方法可用于不同本发明中药的内在质量评价。

本发明提供的技术方案如下：

一种止咳化痰中药的指纹图谱检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

⑴、供试品溶液的制备：取本发明中药，置于量瓶中，加水稀释并定容至刻度线，摇匀，过滤，备用；

⑵、对照品溶液的制备：称定芹糖异甘草苷、异甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵对照品，加甲醇稀释并定容置刻度线，超声助溶，配制对照品溶液；

⑶、色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)；梯度洗脱条件为0～5min，2％～5％(A)；5～10min，5％～10％(A)；10～15min，10％～13％(A)；15～20min，13％～20％(A)；20～35min，20％～30％(A)；35～45min，30％～40％(A)；45～50min，40％～20％(A)；50～55min，20％～2％(A)，流速：0.1～1ml/min，检测柱温度：20～30℃，所述检测波长：200～400nm；

⑷、指纹图谱建立：分别吸取步骤⑴本发明供试品溶液和步骤⑵对照品溶液，采用步骤⑶色谱条件方法，进行测定，采用步骤(1)制备多批次的供试品溶液，按照步骤(3)色谱条件分别测定，得到多次批指纹图谱，导入中药指纹图谱相似度评价软件，并进行相似度评价。

优选的，所述检测方法步骤⑴供试品溶液的制备中加水稀释的倍数为5～50倍。

优选的，所述检测方法步骤⑵对照品溶液的制备中所述芹糖异甘草苷的浓度为：200～400μg/mL、异甘草苷的浓度为300～400μg/mL、黄芩苷的浓度为70～150/mL、汉黄芩苷的浓度为400～600μgmL、黄芩素的浓度为60～120μg/mL、甘草酸铵的浓度为120～180μg/mL。

进一步优选，所述检测方法步骤⑵对照品溶液的制备中所述为芹糖异甘草苷的浓度为311μg/mL、异甘草苷的浓度为369.433μg/mL、黄芩苷的浓度为111.6μg/mL、汉黄芩苷的浓度为541.858μgmL、黄芩素的浓度为80.120μg/mL、甘草酸铵的浓度为161.2μg/mL。

优选的，所述检测方法步骤⑶色谱条件中，所述流速：0.1～0.4ml/min。

优选的，所述检测方法步骤⑶色谱条件中，所述流速：0.2ml/min。

优选的，所述检测方法步骤⑶的色谱条件为：所述检测柱温度：25℃、所述检测波长为250nm、354nm。

优选的，所述检测方法步骤⑶的色谱条件为：所述色谱柱的型号为：Waters BEHC18。

优选的，所述检测方法，其特征在于，所述检测方法步骤⑷中的多批次供试品溶液的指纹图谱相似度≥0.85。

本发明所述止咳化痰中药可以为含有贝母、枇杷叶、紫菀、麻黄、黄芩等相类似功能主治的中药复方制剂。本发明所述中药所对应的具体产品为：咳露口服液。

本发明中药指纹图谱测定的批次通常不少于8批次，一般测定批次在10～30批次。

在本发明技术指纹图谱研究方案中，本申请的发明人经过大量的试验摸索，对供试品溶液制备步骤(1)、检测方法步骤(3)、指纹图谱建立步骤(4)进行相应的优选，并获得稳定性可靠，操作简便的质量检测方法。为了体现突出本发明技术方案创新性，我们将本项目研究技术中优选的部分筛选方案提供如下。

1.供试品溶液的制备

本实验对步骤(1)本发明中药进行24h、48h、72h下，采用20％、40％、60％、80％醇沉溶液考察，以及对样品溶液稀释，采用超声提取时间为10min、30min、60min，进行考察。

结果显示：醇沉浓度、醇沉时间对色谱峰的数量、含量及色谱柱柱效等未产生较大的影响，同时不同超声时间对指标成分无明显变化，优选出的供试品制备方法为直接稀释进样分析。

进一步对样品稀释考察，分别进行原液，稀释2倍、5倍、10倍、50倍筛选，采用供试品原液、稀释2倍、稀释10倍，部分指标峰响应过高或指标峰响应较低，最终优选出5倍、50倍作为供试品溶液的制备。

2.本发明指纹图谱中色谱条件的筛选

2.1流动相色谱条件优化

本发明实验对步骤(3)色谱条件中的流动相，乙腈-0.1％甲酸水、乙腈-0.1％磷酸水、乙腈-不同PH磷酸氢二钾水优选。采用磷酸氢二钾水溶液随着ph值的增加，色谱峰分离度较好，然而ph虽在C18色谱柱酸碱范围内，但液相色谱柱效发生较大变化，且大大降低了色谱柱的使用寿命，在相同条件下，磷酸水色谱峰峰型、分离度差、色谱峰数量较甲酸水好，最终优选：0.1％磷酸水进行咳露口服液的分离研究。

2.2检测波长的选择

进一步对本发明步骤(3)检测波长优选，通过UPLC全波长扫描，色谱峰在230nm、250nm、280nm、354nm等波长下部分峰的灵敏度及吸收较好，而在单波长250nm或354nm下部分色谱峰响应值低，为使该色谱方法更全面的进行咳露口服液质量评价，综合考虑优选用250nm及354nm进行波长检测。

2.3本发明咳露中指标成分的确定

在本发明步骤(4)指纹图谱建立过程中，通过查阅相关资料，对本发明中药中含有的有效组分进行测定分析，在步骤(3)下进样，根据供试品溶液、对照品溶液的保留时间及紫外光谱图，并指认出5个化学指标成分，分别为芹糖异甘草苷、异甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵。上述有效成分如：黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素这些成分与本发明中药的清热功效相关，芹糖异甘草苷、异甘草苷、甘草酸铵属甘草黄酮类的有效成分这也与本发明中药功效中的祛痰止咳的功效相关。

本发明检测方法的有益效果表现在：

①、本发明通过对UPLC的优化，建立了咳露口服液中药制剂UPLC指纹图谱，该指纹图谱在250nm下标记出25个共有峰，指认了4个色谱峰。在354nm下标记出19个共有峰，指认出5个色谱峰，各特征色谱峰分离度好，可用于本发明止咳中药的全面的质量评价。

②、优选的UPLC色谱方法，可在同一色谱条件下同时测定6种成分，通过方法验证及样品含量测定。精密度试验结果表明，测得本发明供试品溶液色谱共有峰保留时间RSD值为0.02％，共有峰相对峰面积的RSD值为0.67％～1.35％，表明仪器精密度良好。稳定性试验表明，测得共有峰保留时间RSD值为0.19％～0.26，共有峰相对峰面积的RSD值为0.27％～2.27％。表明供试品溶液在24h内稳定。重复性试验表明，测得共有峰保留时间RSD值为0.08～0.13％，共有峰相对峰面积的RSD值为1.07％～2.20％。表明操作方法重复性良好。上述检测结果表明，该指纹图谱检测方法稳定，可靠，重复性好，指标成分稳定。可以满足指纹图谱技术及制剂质量控制要求，为咳露口服液质量控制提供参考。

③、经过10批次的液相检测结果可知，以S1为参照色谱，354nm下各批次样品间的相似度为0.991～1.000，同时在250nm下各批次样品与参照色谱的相似度分别为1.000、0.999、1.000、1.000、0.999、0.996、1.000、0.999、0.999、0.998，均符合指纹图谱质量控制规定。由此可知，采用本发明检测方法所测定指纹图谱检测方法的相似度在0.991以上。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1-250nm下10批次指纹图谱图；

图2-354nm下10批次指纹图谱图；

图3-本发明止咳化痰中药供试品溶液液相色谱图，其中色谱峰1-芹糖异甘草苷，色谱峰2-异甘草苷，色谱峰3-黄芩苷，色谱峰4-汉黄芩苷，色谱峰5-黄芩素，色谱峰6-甘草酸铵；

图4-对照品溶液色谱图。

具体实施方式

为了更加充分理解本发明的实施，下面列举一个实验例，下面通过典型的实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1本发明指纹图谱检测方法

1.1仪器与试剂

Waters H-class超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；KUDOU超声仪(上海科导超声仪器有限公司)；MS430TS电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；XPE205电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；Merck Milli-Q纯水仪(默克化工技术上海有限公司)；甲醇、乙腈[GR塞默飞世尔科技(中国)有限公司]；甲醇(AR国家化学集团化学试剂有限公司)、磷酸(AR，天津市河东区红岩试剂厂)。

1.2材料

汉黄芩苷(批号：MUST-20111601，纯度≥99.06％成都曼斯特生物科技有限公司)；甘草酸铵(批号：MUST-21061007，纯度≥99.06％成都曼斯特生物科技有限公司)；异甘草苷(批号：MUST-21051501，纯度≥99.31％成都曼斯特生物科技有限公司)；芹糖异甘草苷(批号：PS012516，纯度≥99.87％成都普思生物科技有限公司)；黄芩苷(批号110715-201720，纯度≥93.5％中国食品药品检定研究院)；黄芩素(批号：1115-201720，纯度≥98.5％中国食品药品检定研究院)；咳露口服液(陕西步长制药有限公司，批号详见下表1)。

表1不同批次咳露口服液

1.3供试品溶液的制备

取咳露口服液5mL，分别置于25mL、50mL量瓶中，加水稀释并定容至刻度线，摇匀，过0.2μm滤头，备用。

1.4对照品溶液的制备

精密称定芹糖异甘草苷、异甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵对照品适量，加甲醇稀释并定容置刻度线，超声助溶。配制为浓度分别为311μg/mL、369.433μg/mL、111.6μg/mL、541.858μgmL、780.120μg/mL、161.2μg/mL对照品溶液。

1.5液相色谱条件

色谱柱为Waters BEH C

2方法学验证

2.1精密度

取批次2(S2)咳露口服液，按“1.1”方法制备供试品溶液，在“1.5液相色谱条件下”连续进样6次，以13号峰(黄芩苷)为参照，测得共有峰保留时间RSD值为0.02％，共有峰相对峰面积的RSD值为0.67％～1.35％。表明仪器精密度良好。

2.2稳定性

取批次2(S2)咳露口服液，按“1.1”方法制备供试品溶液，在“2”项色谱条件下于0、2、4、6、8、10、12、24h进样，以13号峰(黄芩苷)为参照，测得共有峰保留时间RSD值为0.19％～0.26，共有峰相对峰面积的RSD值为0.27％～2.27％。表明供试品溶液在24h内稳定。

2.3重复性

取批次2(S2)咳露口服液，按“1.1”方法平行制备6份供试品溶液，在“2”项色谱条件下进样，以13号峰(黄芩苷)为参照，测得共有峰保留时间RSD值为0.08～0.13％，共有峰相对峰面积的RSD值为1.07％～2.20％。表明操作方法重复性良好。

2.4指纹图谱的建立及色谱峰指认

按照本发明“1.3供试品溶液的制备方法”制备10批次样品稀释溶液，在“2”色谱条件下进样分析。导入“2012版中药指纹图谱相似度评价系统”，以S1为参照图谱，采用平均数时间窗宽度为0.1min生成对照指纹图谱，进行不同批次色谱图进行自动匹配。结果详见图1，图2。由说明书附图1可知，在高效液相色谱250nm下，标记出25个色谱峰。经过分析比对可指认出4个色谱峰，其中13号峰为黄芩苷、19号峰为汉黄芩苷、21号峰为黄芩素、23号峰为甘草酸铵。由图2知，在354nm下标记出19个色谱峰。指认出5个色谱峰，其色谱峰为11号峰为芹糖异甘草苷、12号峰为异甘草苷、13号峰为黄芩苷、17号峰为汉黄芩苷、19号峰甘草酸铵。

2.5相似度评价

由表2的实验结果知，以S1为参照色谱，354nm下各批次样品间的相似度为0.991～1.000，同时在250nm下各批次样品与参照色谱的相似度分别为1.000、0.999、1.000、1.000、0.999、0.996、1.000、0.999、0.999、0.998，均符合指纹图谱质量控制规定。试验结果表明，企业生产的咳露口服液差异性小，质量稳定，建立的UPLC指纹图谱法适用于咳露口服液的质量评价与控制。

表2不同批次样品相似度

实施例2：本发明检测方法含量测定

本发明供试品溶液样品及对照品溶液制备方法、色谱条件如同色谱1，色谱条件中检测波长芹糖异甘草苷、异甘草苷354nm，黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵250nm；色谱见下图3，图4。

1方法学验证

1.1线性

分别精密吸取各对照品溶液适量，置于量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度线，摇匀，得系列线性对照品溶液，在实施例1色谱条件下进样，以峰面积Y为纵坐标，浓度X(μg·mL-1)为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表3。

表3 6种指标成分的标准曲线及线性范围

1.2精密性

精密吸取各对照品适量，混合，在实施例1项色谱条件下，连续进样6次，计算芹糖异甘草苷、黄芩苷、异甘草苷、汉黄芩苷、甘草酸铵、黄芩素6种成分峰面积的RSD值分别为0.90％、0.73％、1.25％、0.67％、1.35％、1.10％。表明仪器精密度良好。

1.3稳定性

取批次2供试品溶液及对照品溶液，在实施例1项色谱条件下，分别于0、2、4、6、8、10、12、24h进样，测定芹糖异甘草苷、异甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸铵峰面积，计算得样品溶液RSD值分别为0.54％、1.31％、0.63％、0.71％、2.64％、1.52％，对照品溶液RSD值分别为0.50％、0.51％、0.39％、0.41％、0.45％、0.68％，均小于3％，表明样品及对照品溶液24h内稳定性较好。

1.4重复性

称取同一批次2咳露口服液，平行制备6份供试品溶液，在UPLC色谱条件下测定，依次测得6种成分峰面积，得RSD值分别为2.64％、2.71％、2.33％、2.56％、2.40％、2.29％，均小于3％，该方法重复性良好。

1.5加样回收率

取同一批已知含量的咳露口服液6份，2.5mL，置25mL量瓶中，按照与待测定样品成分量100％比例水平精密加入对应的对照品，制备供试品溶液，在实施例1色谱条件下测定，计算加样回收率，测得各对照品的平均加样回收率范围为99.57％～102.24％，其RSD(n＝6)<3％，说明该方法准确度良好。

2含量测定

按本发明实施1项下的方法制备10批次样品溶液，并在同色谱条件下测定咳露口服液中6种成分含量，检测含量测定结果见下表4。

表4 10批次咳露口服液含量测定(单位：μg/mL)

实验结果表4可知，该检测方法10批次咳露口服液各成分含量范围为芹糖异甘草苷25.057～29.652μg/mL，异甘草苷26.404～32.072μg/mL，黄芩苷824.457～1291.929μg/mL，汉黄芩苷319.541～557.251μg/mL，黄芩素4.243～15.839μg/mL，甘草酸铵250.566～479.037μg/mL，上述检测方法对本发明中药中的有效成分含量限度的上下限进行限定，有利控制本发明中药内在质量。

最后应说明是：本发明所并不局限于上述具体实施方案，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下，但凡在本发明的精神和实质范围内，所作的任何改变、等同替换和改进，均在本发明的保护范围之内。