修饰含有分析物的液体样品以增加分析物的SERS信号强度的方法，以及使用SERS检测远距离分析物的探针

根据35U.S.C.§119(e)(1)，本申请要求2019年8月22日提交的、美国临时申请序列号为US 62/890,216的权益。上述所有文件通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明涉及修饰待使用表面增强拉曼光谱法(SERS)进行分析的液体样品的方法。更具体地，本发明涉及修饰含有待分析物的液体样品以增加分析物的SERS信号强度的方法。本发明还涉及用SERS检测远距离分析物的探针。

背景技术

拉曼光谱学涉及通过分子的振动能量状态的变化，从而达到分子非弹性散射的光子能量的衰减或增强。由于散射光能量相对于入射光的变化对应于分子振动状态之间的能量差，非弹性散射光的光谱，即拉曼光谱，可用于识别分子，且非弹性散射光的强度可用于量化所述分子的数量。非弹性拉曼光散射很弱，因此需要分析物分子达到显著浓度才能有效检测，因此这种技术灵敏度低。然而，已有一些技术方法可以用来极大地提高非弹性散射光的强度。

表面增强拉曼光谱(SERS)通过增加光子非弹性散射而不是弹性散射的几率来增加非弹性散射光的强度。它通过将分析物分子先吸附在等离子体材料上，然后由入射光束照射来实现这一点。信号增强的确切机制目前在科学界有争议，但已知等离子体材料必须在纳米尺度上是粗糙的或由纳米结构构成，信号强度的增强可高达10

SERS的灵敏度和可重复性可以通过设计光学热点来提高，这些热点位于纳米结构显示最强电磁场的位置，例如纳米颗粒尖端或相邻纳米颗粒之间的纳米间隙内。热点处产生最高的SERS信号放大。然而，其灵敏度是受限的，因为待分析物分子必须同时位于热点上、拉曼激光束的采样区域之内，以及在探测器视场中。这个取样体积通常占整个样品体积可以忽略的部分。因此，在实践中，SM-SERS的检测限是在nM或pM水平(10

基底材料表面氧化可影响SERS检测限。据报道，当银纳米颗粒(AgNPs)或银膜被环境空气氧化形成亚单层Ag

发明内容

根据当前发明，提供：

1.修饰含有分析物的液体样品以增加所述分析物的SERS信号强度的方法，所述方法包含以下步骤:

提供待使用SERS分析的所述液体样品；以及

向所述液体样品中加入氧清除剂，以从所述液体样品中除去溶解氧。

2.根据第1项所述的方法，其中所述分析物是巯基化化合物、胺、杀虫剂、持久性有机污染物、过渡金属复合物、肽、蛋白质、核酸、多糖或激素。

3.根据第1或2项所述的方法，其中所述分析物是过渡金属复合物、肽、蛋白质、核酸、持久性有机污染物、杀虫剂或激素。

4.根据第1至3项中任意一项所述的方法，其中所述分析物是对氨基硫酚(pATP)或对硝基硫酚(pNTP)。

5.根据第1至4项中任意一项所述的方法，其中所述样品中的液体为水或有机溶剂，例如甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙腈、乙醚、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、二甲基甲酰胺、二甲苯、烃或其混合物。

6.根据第1至5项中任意一项所述的方法，其中所述液体为水。

7.根据第1至6项中任意一项所述的方法，其中所述方法还包括根据需要对所述分析物进行修饰以使其能够与用于所述SERS检测的等离子体材料的表面相互作用的步骤。

8.根据第7项所述的方法，其中对所述分析物的所述修饰是通过将巯基结合到所述分析物来完成的，由此分析物将通过该巯基化学吸附在Ag或Au等离子体表面。

9.根据第7项所述的方法，其中对所述分析物的所述修饰通过以下完成：通过疏水/亲水相互作用或范德华力进行物理吸附、通过其它结合原子进行化学吸附、通过与预先吸附的报告分子的化学反应间接检测、通过预先吸附的螯合剂螯合金属离子、通过亲和力间接检测，例如生物分子的抗体-抗原结合、通过与分析物的特异性相互作用保留带有SERS活性报告分子的等离子体纳米颗粒进行间接检测，所述分析物的特异性相互作用例如抗原抗体反应。

10.根据第1至9项中任意一项所述的方法，所述氧清除剂为亚硫酸钠、肼、抗坏血酸或抗坏血酸棕榈酸酯。

11.根据第1至10项中任意一项所述的方法，其中添加过量的氧清除剂。

12.根据第1至11项中任意一项所述的方法，其中加入足够的氧清除剂以除去所述液体样品中的DO的至少98％、99％、99.5％或99.9％，优选至少99.5％或99.9％。

13.根据第1至12中项任意一项所述的方法，其中加入足够的氧清除剂，使得剩余的DO的浓度至多为约0.020mM、约0.010mM、约0.005mM或约0.002mM，优选至多为约0.005mM或约0.002mM。

14.根据权利要求1至13中任意一项所述的方法，其中在修饰所述液体样品后，给定分析物的LOD降低至少约10

15.根据第1至14项中任意一项所述的方法，其中在修饰所述液体样品后，使用SERS的所述分析物的LOD至少降低了约10

16.根据第1至15项中任意一项所述的方法，其中使用SERS的所述分析物的LOD至多为约1pM、约100fM、约10fm、约1fm、约100aM、约10aM、约1aM、约100zM，或约10zM。

17.根据第1至16项中任意一项所述的方法，其中所述分析物的LOD至多为约l0zm。

18.根据第1至17项中任意一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述液体样品与等离子体材料接触的步骤。

19.根据第18项所述的方法，其中至少部分的所述分析物被吸附在或变得被吸附在所述等离子体材料的表面上。

20.根据第18或19项所述的方法，其中所述等离子体材料是由导电、半导电和/或介电材料、其组合或其复合材料制成的物质。

21.根据第18至20项中任意一项所述的方法，其中所述等离子体材料是金、银、铜或其混合物。

22.根据第18至21项中任意一项所述的方法，其中所述等离子体材料为金或银，优选为银。

23.根据第18至22项中任意一项所述的方法，其中所述等离子体材料具有粗糙的等离子体表面、由等离子体纳米颗粒组成，或两者皆有。

24.根据第23项所述的方法，其中所述粗糙的等离子体表面的粗糙度在约5nm和约50nm之间，优选地在约10nm和约20nm之间。

25.根据第23或24项所述的方法，其中所述粗糙的等离子体表面的粗糙度为至少约5nm、至少约10nm，或至少约20nm；和/或至多约200nm、至多约100nm，或至多约50nm。

26.根据第23至25项中任意一项所述的方法，其中所述等离子体材料由等离子体纳米颗粒组成。

27.根据第23至26项中任意一项所述的方法，其中所述等离子体纳米颗粒包含金、银或铜纳米颗粒(包括二氧化硅涂覆的金、银或铜纳米颗粒)。

28.根据第23至27项中任意一项所述的方法，其中所述等离子体纳米颗粒为银或金纳米颗粒(无涂层)，优选为银纳米颗粒(无涂层)。

29、根据第23至28项中任意一项所述的方法，其中所述等离子体纳米颗粒为棱锥状、类球状(包括球形)、血小板状或棒状。

30.根据第23至29项中任意一项所述的方法，其中所述等离子体纳米颗粒的直径的D50的尺寸在约2nm至约500nm之间。

31.根据第23至30项中任意一项所述的方法，其中所述等离子体纳米颗粒的直径的D50的尺寸为至少约2nm、至少约10nm、至少约25nm，或至少约50nm，和/或至多约500nm、至多约250nm、至多约200nm、至多约100nm、至多约75nm，或至多约50nm。

32.根据第23至31项中任意一项所述的方法，其中所述等离子体纳米颗粒凝聚，使得它们彼此紧密接近(和/或接触)。

33.根据第23至32项中任意一项所述的方法，其中所述等离子体纳米颗粒通过添加凝聚剂、调节pH、加入例如醇类等有机溶剂，或这些方法的组合而凝聚，所述凝聚剂为例如凝聚分子(即能够桥接纳米颗粒并诱导凝聚的分子)或电解质(例如盐)。

34.根据第23至33项中任意一项所述的方法，其中所述等离子体纳米颗粒通过添加诸如硫酸盐或亚硫酸盐的凝聚剂而凝聚。

35.根据第33或34项所述的方法，其中所述凝聚剂和所述氧清除剂是不同的材料。

36.根据第33或34项所述的方法，其中所述凝聚剂是所述氧清除剂，其优选为亚硫酸盐，优选为亚硫酸钠。

37.根据第23至36项中任意一项所述的方法，通过添加溶解的盐和/或调节pH使所述纳米颗粒凝聚。

38.根据第32至37项中任意一项所述的方法，其中在凝聚之前将所述液体样品的pH值调节至约4。

39.根据第32至38项中任意一项所述的方法，其中在所述纳米颗粒凝聚之前和在使用氧清除剂去除溶解氧之前，将所述等离子体纳米颗粒添加到所述液体样品中。

40.根据第23至39项中任意一项所述的方法，其中所述等离子体纳米颗粒由小的松散结合的被覆分子(capping molecules)稳定，所述被覆分子优选为柠檬酸盐、乙醇、乙二醇和/或聚乙二醇，更优选为柠檬酸盐和/或乙醇。

41.根据第23至40项中任意一项所述的方法，其中与特定分析物相互作用以产生独特信号的分子在与所述分析物接触之前被预吸附到所述等离子体纳米颗粒或粗糙的等离子体表面，所述分子为例如金属离子的螯合剂。

42.根据第1至41项中任意一项所述的方法，其中所述方法还包括测量所述液体样品的SERS光谱的步骤。

43.根据第42项所述的方法，其中测量步骤包括使用通常来自激光器的光照射所述等离子体材料，并检测由所述等离子体材料散射的拉曼信号。

44.一种使用SERS对液体样品中的分析物进行远距离检测的探针，所述探针包括：

检测室，其具有对SERS激发光和拉曼散射信号透明的窗口；以及

具有第一端和第二端的导管，所述导管的第一端可流动地连接到所述检测室，且所述导管的所述第二端被配置为与液体样本接触，

其中：

所述的检测室和所述第一端和第二端之间的所述导管包含浸在除氧溶剂中的等离子体纳米颗粒，其中所述等离子体纳米颗粒彼此紧密接近，从而允许等离子体场从所述检测室到所述导管的所述第二端的不受阻碍的传播及返回，和/或

所述检测室的内壁和所述第一端和第二端之间的所述导管的内壁涂覆有等离子体纳米层，其中，所述等离子体纳米层从所述检测室到所述导管的所述第二端是连续的，从而允许等离子体场从所述检测室到所述导管的所述第二端的不间断的传播和返回，且其中所述导管和所述检测室里充满除氧溶剂；以及

其中所述除氧溶剂包含氧清除剂，所述氧清除剂从所述除氧溶剂中除去溶解氧。

45.根据第44项所述的探针，其中所述等离子体纳米颗粒如第23至41项中任意一项所定义，和/或所述等离子体层是等离子体材料层，所述等离子体材料层包括如第23至25项中任意一项所定义的粗糙等离子体表面。

46.根据第44或45项所述的探针，其中所述检测室和在所述第一端和所述第二端之间的所述导管包含浸在除氧溶剂中的等离子体纳米颗粒。

47.根据第44至46项中任意一项所述的探针，其中使用第33至39项中任意一项所定义的技术，如第32至39项中任意一项所定义的使所述等离子体纳米颗粒沿着所述导管的纵向凝聚。

48.根据第44至47项中任意一项所述的探针，其中所述溶剂为水或有机溶剂，例如甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙腈、乙醚、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、二甲基甲酰胺、二甲苯、烃或其混合物。

49.根据第44至48项中任意一项所述的探针，其中所述溶剂为水。

50.根据第44至49项中任意一项所述的探针，其中所述氧清除剂为如第1至43项中任意一项所定义的。

51.根据第44至50项中任意一项所述的探针，其中添加的氧清除剂的浓度以及剩余的DO的浓度如第1至43项中任意一项所定义。

52.根据第44至51项中任意一项所述的探针，其中所述导管的所述第二端是打开的或关闭的(优选为打开的)。

53.根据第44至52项中任意一项所述的探针，其中所述导管的所述内壁涂覆有等离子体层，并且所述导管充满除氧溶剂。

54.根据第44至53项中任意一项所述的探针，其中所述导管的第二端是打开的，并且用例如来自泵或储液装置的除氧溶剂(和等离子体纳米颗粒，如果使用它们的话)重新填充所述检测室和所述导管，使得所述导管和所述检测室保持充满除氧溶剂(和等离子体纳米颗粒，如果使用它们的话，使等所述离子体纳米颗粒彼此保持紧密接近)。

55.根据第54项所述的探针，其中所述泵或所述储液装置直接连接到所述导管的所述第一端，或者以这样的方式连接到所述检测室，使得从所述导管的所述第二端流出的任何除氧溶剂/等离子体纳米颗粒被替换。

56.根据第44至55项中任意一项所述的探针，其中尽管所述导管的第二端是打开的，但毛细管力将除氧溶剂(和等离子体纳米颗粒，如果使用它们的话)保持在在所述导管内。

57.根据第44至56项中任意一项所述的探针，其中所述导管的所述第二端是打开的，并且所述导管的所述第二端至少部分地涂覆有等离子体层。

58.根据第44至57项中任意一项所述的探针，其中所述导管的所述第二端包含等离子体纳米颗粒和端壁、朝向所述导管的所述第二端的所述内壁，且朝向所述第二端的所述外壁涂覆有等离子体层。

59.根据第44至58项中任意一项所述的探针，其中所述导管的所述内壁涂覆有等离子体层，且所述等离子体层还覆盖所述端壁和朝向所述导管的所述第二端的外壁。

60.根据第44至59项中任意一项所述的探针，其中所述导管的所述第二端也被等离子体层封口。

61.根据第44至60项中任意一项所述的探针，其中所述导管由金属、石英、玻璃或聚合物塑料制成，所述聚合物塑料例如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚醚醚酮、聚氯乙烯、聚四氟乙烯或聚二甲基硅氧烷。

62.根据第44至61项中任意一项所述的探针，其中所述导管是聚醚醚酮(PEEK)聚合物管或玻璃毛细管。

63.根据第44至62项中任意一项所述的探针，其中所述导管的所述内径在约0.08毫米至约1厘米之间，优选地在约0.3毫米至约0.5毫米之间。

64.根据第44至63项中任意一项所述的探针，其中所述导管的所述内径至少为约0.08mm；至少为约0.1mm；至少为约0.2mm；或至少为约0.3mm；和/或至多为约1cm；至多为约5mm；至多为约2mm；至多为约1mm；至多为约0.75mm；或至多为约0.5mm。

65.根据第44至64项中任意一项所述的探针，其中所述导管的所述内径为约0.3毫米或约0.5毫米。

66.根据第44至65项中任意一项所述的探针，其中所述导管的长度至少为约5cm；至少为约10cm；至少为约20cm；至少为约50cm；或至少为约75cm；和/或至多为约50m；至多为约20m；至多为约10m；至多为约5m；至多为约2m；或至多为约1m。

67.根据第44至66项中任意一项所述的探针，其中所述导管的所述长度为约1m或约2m。

68.根据第44至67项中任意一项所述的探针，其中所述导管的横截面是圆形、椭圆形或矩形。

69.根据第44至68项中任意一项所述的探针，其中“紧密接近”意味着相距至多约15nm的距离，优选为至多约10nm的距离，更优选为至多约5nm的距离(等离子体纳米颗粒之间、等离子体纳米颗粒和等离子体层之间，或在这些之一与分析物之间)。

70.根据第44至69项中任意一项所述的探针，其中所述等离子体纳米颗粒的密度沿所述导管的纵向变化。

71.根据第44至70项中任意一项所述的探针，其中所述检测室和所述导管的所述第一端通过由所述检测室定义的孔彼此可通过流体连接。

72.根据第44至71项中任意一项所述的探针，其中所述检测室由玻璃、塑料或石英制成，更优选地由玻璃或石英制成。

73.根据第44至72项中任意一项所述的探针，其中将包含在所述液体中的所述分析物与包含在所述探针中的如第18至41项中任意一项所定义的等离子体材料接触(例如，在关闭的第二端的情况下完全涂覆所述第二端的等离子体层；或在打开的第二端的情况下涂覆所述第二端的等离子体层或浸在所述除氧溶剂中的等离子体纳米颗粒)。

74.根据第44至73项中任意一项所述的探针，其中如第18至41项中任意一项所定义的，所述液体样品与等离子体材料接触，优选地吸附在所述等离子体材料上。

75.根据第44至74项中任意一项所述的探针，其中所述液体样品已被除氧，优选地如第1至43项中任意一项所定义的使用氧清除剂。

76.根据第44至75项中任意一项所述的探针，其中所述液体样品中的氧清除剂的量以及剩余的DO浓度为如第1至43项中任意一项所定义。

77.根据第44至76项中任意一项所述的探针，其中所述液体样品为如第1至43项中任意一项所定义的液体样品。

78.根据第44至77项中任意一项所述的探针，其中使用如第1至43项中任意一项所定义的方法对所述液体样品进行修饰。

79.根据第44至78项中任意一项所述的探针，其中所述分析物变得被吸附到等离子体材料的表面，所述等离子体材料的表面可以所述是导管中的所述纳米颗粒的表面、涂覆在所述导管的所述第二端的等离子体层和/或吸附(capping)所述导管的所述第二端的等离子体层。

80.根据第44至79项中任意一项所述的探针，其中所述分析物位于根据第1至43项中任意一项所定义的方法产生的除氧液体样品中，并且包含如第23至41项中任意一项所定义的凝聚的等离子体纳米颗粒或粗糙的等离子体表面，其任一都与所述导管中的所述纳米颗粒、涂覆在所述导管的所述第二端的等离子体层，和/或吸附所述导管的所述第二端的等离子体层接触。

81.根据第44至80项中任意一项所述的探针，其中与特定分析物相互作用产生独特信号的分子被预先吸附在所述导管内的所述等离子体纳米颗粒上、所述液体样品中的所述等离子体纳米颗粒上、涂覆在所述导管的所述第二端的等离子体层上，和/或吸附所述导管的所述第二端的等离子体层上，所述分子为例如金属离子的螯合剂或与生物分子相互作用的抗体、肽或适配体。

82.根据第44至81项中任意一项所述的探针，其中所述探针被配置为配合用于远距离检测的表面增强拉曼光谱仪一起工作，所述表面增强拉曼光谱仪可通过将入射激光照射到样品保存室或检测室并使用测量器测量散射光以检测分析物。

83.根据第82项所述的探针，其中检测反向散射光，即相对于所述入射光散射180°的光。

84.根据第1至43项中任意一项所述的方法，其中使用如第44至83项中任意一项所定义的所述探针来执行所述测量步骤。

85.根据第1至43项中任意一项所述的方法，其中所述SERS系统为为如第44至83项中任意一项所定义。

附图说明

附图中：

图1A为根据本发明的探针的实施例的导管g的第二端的纵向截面图。

图1B为根据本发明探针的实施例的含有等离子体纳米颗粒的导管g的第二端的纵向截面图。

图1C为根据本发明的探针的另一实施例的导管g的第二端的纵向截面图，其中导管g的内壁涂覆有等离子体层。

图1D为含有等离子体纳米颗粒的导管g的第二端的纵向截面图，其中端壁、朝向导管g的第二端的内壁和朝向第二端的外壁都涂覆有等离子体层。

图1E为导管g的第二端的纵向截面图，其中内壁涂覆有等离子体层，该等离子体层也覆盖端壁和朝向导管g的第二端的外壁。

图1F为导管g的第二端的纵向截面图，该导管g包含等离子体纳米颗粒，且被等离子体层封口。

图1G为导管g的第二端的纵向截面图，其中内壁涂覆有等离子体层，该等离子体层也封口导管g的第二端。

图2为常规表面增强拉曼光谱仪的示意图。

图3为包括本发明的探针的用于远距离检测的表面增强拉曼光谱仪的示意图。

图4为本试验使用的银纳米颗粒及聚集体的透射电子显微照片；具体地，图4示出了A)个体；B)和C)银纳米颗粒的聚集体；D)银纳米颗粒之间的纳米间隙的显微照片。

图5示出了整合的等离子体电磁场产生的光电流；具体地，图5A)示出了显示入射辐射和蜂窝电极的相对位置的实验示意图；图5B示出了在恒定离子强度下，有和无溶解氧的情况下，通过距离电极表面1厘米处的NIR(λ＝785nm)照射产生的光电流。

图6示出了银纳米颗粒聚集体内部和聚集体之间的表面等离子体偶联。具体来说，图6给出了在以下条件下受照射的银纳米颗粒聚集体的电荷分布(上图)和电场(下图)：A)未包被的纳米颗粒；B)纳米间隙中有两个氧分子的未包被的纳米颗粒；C)未包被的纳米颗粒，左纳米颗粒表面结合有氧分子；D)未包被的纳米颗粒，左右纳米颗粒表面分别结合有氧分子；E)Ag

图7示出了银纳米颗粒聚集体内部和之间的表面等离子体偶联。示出了在无氧(脱氧)条件下，被照射的A-C)银纳米例子和D-F)氧化银涂覆(厚度2nm)的银纳米颗粒聚集体的电荷分布(上图)和电场分布(下图)与最右侧的纳米棱柱与其余聚集体之间的距离的函数关系。上述距离为A)10、B)13、C)17、D)8、E)9.8和F)17nm。图7还示出了在G)无溶解氧和H)有溶解氧的情况下，电磁场通过银纳米棒的传输，所述银纳米棒的直径分别为4nm和50nm。图7还示出了通过二聚体在I)和K)无溶解氧和J)和L)有溶解氧存在的情况下的电磁场传输，所述二聚体由I–J)纳米三菱柱和纳米球组成及K–L)两个纳米三菱柱组成。此外，，图7还示出了在无溶解氧的情况下，电磁场在纳米颗粒四元体之间的传输。该四元体由M)三个纳米棱柱加上一个纳米球组成，以及N)由两个纳米棱柱加两个纳米球组成。

图8示出了存在或不存在溶解氧时的表面增强拉曼光谱。具体地，图8示出了1fM的A)对氨基硫酚和B)对硝基硫酚在去除溶解氧和不去除溶解氧的情况下的表面增强拉曼光谱(空白包含了Na

图9示出了氧清除对表面增强拉曼光谱检测限的影响；具体地说，图9A)和B)示出了在溶解氧未被去除情况下不同浓度的对氨基硫酚的表面增强拉曼光谱；C)示出了C-S的伸缩模(stretching mode)强度与浓度的对数值之间的函数关系。图9D)和E)示出了在溶解氧被去除情况下不同浓度的对氨基硫酚的表面增强拉曼光谱。此外，图9示出了F)C-H伸缩模和G)C-S伸缩模强度作为浓度的对数。

图10示出了银纳米颗粒特征以及小于1000cm

图11示出了通过去除溶解氧增强灵敏度的范围。具体地，图11示出了在A)溶解氧存在(10pM)和B)不存在(8zM)的情况下的巯基化的寡核苷酸序列的表面增强拉曼光谱。

图12示出了A)球形银纳米颗粒的透射电子显微镜照片和B)吸附(于球形纳米银颗粒上)的对氨基噻酚的依赖于氧去除的信号增强。

图13示出了在用A)抗坏血酸和B)肼除氧的情况下，不同浓度的对硝基硫酚的表面增强拉曼光谱。

图14示出了溶解氧浓度与表面增强拉曼散射强度之间的相关性。具体地，图14示出了在分别通过A)和B)加入Na

图15示出了介电氧化物表面对表面增强拉曼光谱的氧去除增强的影响。具体地，图15示出了A)Ag

图16A)示出了金纳米棒的吸光光谱，而B)示出了它们在溶解氧存在和不存在时的表面增强拉曼光谱(提供十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)被覆剂的拉曼光谱作为参考)。

图17A)示出了二氧化硅涂覆的银纳米颗粒的透射电镜照片，而B)示出了在对氨基苯硫酚存在下除氧后的它们的表面增强拉曼光谱，及C)作为参考的还带有50aM的对硝基硫酚的它们的表面增强拉曼光谱。

图18示出了对吸附在石英NMR管底部银镜上的分析物的远程检测。具体地，图18示出了从银镜出发并通过银纳米颗粒传输的A)对氨基硫酚和B)对硝基硫酚的表面增强拉曼光谱，该光谱在入射激光和探测器视场相距10厘米时测定。图18还示出了吸附于银镜的对氨基硫酚的通过二氧化硅涂覆的银纳米颗粒传输的表面增强拉曼C)光谱以及D)C-S伸缩带强度与距离的函数关系。

图19示出了在96孔微量滴定板上远程检测吸附在除氧并聚集的银纳米颗粒上的分析物；具体地，图19示出了使用预先填充除氧和聚集的新鲜的银纳米颗粒的玻璃毛细管测量的表面增强拉曼光谱(入射激光距离毛细管插入端6cm)。图19示出了A)对氨基硫酚和B)对硝基硫酚的光谱与积分时间的函数关系。

图20示出了通过整体化的等离子体耦合的超过1m的分析物远距离检测。具体地，图20示出了A)使用本发明的探针在1m长的PEEK毛细管远端对分析物远距离检测的示意图。此外，图20示出了用A)中的装置对B)对氨基苯硫酚和C)对硝基硫酚的检测。

具体实施方式

提供了改变含有分析物的液体样品以增加所述样品中分析物的SERS信号强度的方法，以及使用SERS远距离检测液体样品中的分析物的探针。

本发明人发现液体样品中的溶解氧(DO)是等离子体场在整个液体样品中传输的主要限制因素，从而限制了SERS的灵敏度。具体来说，发明人发现通过使用化学氧清除剂去除DO，可以实现提高的SERS灵敏度，例如在水中检测出zM浓度水平的分析物。关键的是，利用其它除氧的方法达不到如此好的结果，例如用无氧气体(进行喷射不能实现充分的DO去除。此外，当使用氧清除剂时，发明人在检测器视场(field-of-view of the detector)外检测到分析物，这表明存在出乎意料地沿着等离子体材料的长距离信号传播，这允许例如用本文所述的探针对分析物进行远距离检测。

改变液体样品的方法

本发明的第一方面提供了修饰含有分析物的液体样品以增加所述分析物的SERS信号强度的方法。本发明的方法包含以下步骤:

(a)提供待使用SERS分析的所述液体样品；以及

(b)向所述液体样品中加入氧清除剂，以从所述液体样品中除去溶解氧。

液体样品

样品中的待分析物可以是任何常被SERS测量的分析物，即包括两个或更多个原子的分子和离子，有机或无机。还已知的是，利用SERS可以间接地检测单原子离子，例如通过形成振动活性复合物(vibrationally active complex)。在这种情况下，所研究的物质严格说来是一个原子，但是SERS检测到的分析物(即振动活性复合物)是多原子的。在实施例中，分析物为含巯基的化合物、胺类、杀虫剂、持久性有机污染物、过渡金属复合物、肽、蛋白质、核酸、多糖或激素。在优选的实施例中，分析物为过渡金属复合物、肽、蛋白质、核酸、持久性有机污染物、杀虫剂或激素。例如，分析物可以是对氨基苯硫酚(pATP)或对硝基硫酚(pNTP)。

样品中的液体优选为水或有机溶剂，例如甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙腈、乙醚、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、二甲基甲酰胺、二甲苯、烃或其化合物。在优选的实施例中，所述液体是水。

在实施例中，本发明的方法进一步包含了对分析物进行必要修饰的步骤，从而使待分析物能与用于SERS检测的等离子体材料表面发生互作。这些修饰对于SERS光谱学领域的技术人员是众所周知的。一个常用的方法是在分析物上连接巯基，由此，分析物可以通过该巯基化学吸附到银或金等离子体材料表面。其它方法包括通过疏水/亲水相互作用或范德华力进行物理吸附；通过其它结合原子的化学吸附；通过与预吸附的报告分子(pre-adsorbed reporter molecule)的化学反应实现间接检测；通过预吸附的螯合剂螯合金属离子；通过亲和作用实现间接检测，例如通过生物分子的抗原抗体的结合；以及利用与分析物的特异性相互作用，例如抗体-抗原相互作用，通过保留带有SERS活性报告分子的等离子体纳米颗粒进行间接检测。

将使用SERS分析要用本发明所述方法进行修饰的液体样品。由于本发明所述方法旨在增加液体样品中分析物的SERS信号强度，液体样品含有待分析物。应理解，如果液体样本不含分析物(例如空白对照)，那么自然地，所期望的SERS信号强度增长将不会发生。

氧清除剂

如前述，发明人发现利用氧清除剂去除DO从而使SERS的灵敏度得到增强。相应地，氧清除剂可以是本领域已知的任何氧清除剂，以减少液体中的DO。在实施例中，氧清除剂为亚硫酸钠、肼、抗坏血酸或抗坏血酸棕榈酸酯。

优选地，尽量多地除去液体样品中的溶解氧。相应地，优选地加入过量的氧清除剂以确保尽可能多的DO被去除。实施例中，足量的氧清除剂加入，以去除液体样本中至少98％、99％、99.5％或99.9％的DO，优选的是至少99.5％或99.9％。实施例中，足量的氧清除剂被加入，使得剩余的DO浓度最多为约0.020mM、约0.010mM、约0.005mM或约0.002mM，优选的是至多约0.005mM或约0.002mM。

其它可选步骤

如上所述，液体样品将供SERS分析。这种光谱学技术依赖于局部表面等离激元共振(localized surface plasmon resonance(LSPR))。当等离子体材料的自由传导电子与入射光(通常为激光)共振时产生LSPR。LSPR条带的位置和强度都依赖于等离子体材料的特性，并且它们对周围的媒介基质的介电性质高度敏感。尤其地，当不同基团被吸附到(或紧密接近)等离子体材料时，LSPR条带的位置和强度会发生变化。的确，当光照射到等离子体材料上时，电磁场被局部放大(由于局部表面等离子体激元的激发)，进而产生我们所熟知的“热点”，在热点区域电磁场增强会更高。当分析物分子与等离子体材料接触(或接近)时(例如吸附在材料表面)，这些分子会与这些热点相互作用，从而导致表面等离激元波共振条件的变化。这些共振条件的变化导致能被SERS光谱检测器检测的SERS信号，最终使分析物能被检测和定量。

液体样品与等离子体材料的接触

因为液体样品将供SERS分析，在实施例中，本方法还包括将如上所述修饰的(或即将如上文所述修饰的)液体样品与等离子体材料(也称为SERS基底)接触的步骤。这样做是为了使分析物能与等离子体材料的表面紧密接近(从而使待分析物可以与经SERS激光照射的等离子体材料产生的放大的电磁场相互作用，进而受益于SERS技术固有的SERS信号放大因子)。提高该SERS增强因子(以及相应的测量的信号)的各种方式对于本领域技术人员来而言众所周知的。

在实施例中，至少一部分分析物被(或变得)吸附在等离子体材料的表面。如上所述，实现这一目标的一种常见技术是将分析物化学吸附到等离子体材料上，例如，将带有巯基的分析物化学吸附在Ag或Au等离子体材料表面。

通过利用本发明的方法对液体样品进行修饰，与未修饰的液体样品相比，分析物的检测限(LOD)会出乎意料的大幅度降低。在实施例中，对于给定的分析物/等离子体组合，LOD通常下降倍数是约10

基于下面讨论的实验结果，除氧导致SERS场有效耦合，而这种等离子体耦合使电磁(EM)场在整个样品体积中传播，传播过程中没有显著性的信号能量丢失(即有限的淬灭)。等离子体材料的光激发而产生的等离子体场在整个样品中传播，以到达等离子体材料(该等离子体材料与分析物接触或靠近)并返回，从而将分析物的拉曼散射信号返回到检测器。本文已发现，如下所述的实验和计算机模拟表明在没有去除DO时，氧因具有高电子亲和力，能捕获电子，并阻止SERS场沿着等离子体材料的有效产生、耦合、传播和整合。反之，DO的去除使等离子体耦合及SERS场传播成为可能。这是导致分析物的SERS信号强度提高的原因。

一般而言，氧分子悬停在纳米间隙中或吸附在等离子体材料表面导致电荷重新分配，并淬灭等离子体场和耦合。然而下述实验表明，使用本发明的方法就可避免这种情况。即使对于Ag

如上所述，对SERS的传统理解是基于单个纳米结构的信号放大或相邻纳米颗粒在等离子场的耦合(即在纳米间隙处)——这就是“热点”理论。然而，在本实验(见下文)中证明，在用氧清除剂去除DO后，大规模长距离等离子体场耦合(即整合的表面等离子体场共振)变成可能。这个整合场使得单个分子的SERS信号在整个液体样品中得以有效传输，该单个分子位于与任何单独的等离子体材料(例如等离子体纳米颗粒)紧密接近或接触的地方(最好是吸附在其表面)，例如，每个纳米颗粒变为SERS活性，并可作为被吸附的分析物的“热点”或传播SERS信号，从而实现真正意义上的单分子检测。

已经在不同等离子体纳米材料中观察到由于本发明的方法中的氧去除而导致的信号增强(参见下文的实施例)，所述的等离子纳米材料包括银纳米颗粒，以及甚至包括二氧化硅涂覆的等离子体纳米颗粒，例如AgNPs(即SHINERS技术)，其中观察到LOD从500nM下降至50aM(10

因此，在本发明的方法中，等离子体材料为适用于SERS的任何等离子体材料。这些材料为本领域的技术人员所熟知，并在文献里也有广泛的描述。正如本领域技术人员所熟知，用于SERS的等离子体材料由在用SERS激光照射时可产生局部表面等离子体共振的物质制成，这些物质可能是导电的、半导电的，和/或介电材料，它们的组合或它们的复合材料。当用SERS激光照射时，可以表现出局部表面等离子体共振的优选的物质的非限制性的例子包括金、银和铜，以及表面被各种薄的介电氧化物层(例如现有技术报道的二氧化硅或氧化铝的薄层)覆盖的金、银和铜。优选的等离子体材料是金、银和铜，优选为金和银，更优选为银。

此外，众所周知，等离子体材料要么具有粗糙的表面(本文称为“粗糙的等离子体表面”)，要么由纳米颗粒组成(本文称为“等离子体纳米颗粒”)，或是它们的组合。在优选的实施例中，等离子体材料为等离子体纳米颗粒。

为清楚起见，当提到“粗糙的等离子体表面”时，粗糙度应足以产生预期的局部表面等离子体共振。本领域技术人员会理解在SERS的上下文中的“粗糙的等离子体表面”这一表达的意义。为清楚起见，在具体实施例中，粗糙的等离子体表面的粗糙度(Ra)在约5nm和约50nm之间，优选在约10nm和约20nm之间。在实施例中，等离子体表面的粗糙度至少为约5nm、至少为约10nm，或至少为约20nm；和/或至多约200nm、至多约100nm，或至多约50nm。为清楚起见，粗糙的等离子体表面不一定需要进行单独的“粗糙化”处理；表面在制备出来后可能已经具有上述定义的粗糙度。

本领域技术人员将理解，尽管上述粗糙度参数与粗糙的等离子体表面有关，其它等离子体材料(例如等离子体纳米颗粒)可能具有高曲率区域(如边缘和顶点)在该处的电磁场强度通常是最高的。

等离子体纳米颗粒的常见例子包括金、银或铜纳米颗粒(包括二氧化硅涂覆的金、银或铜纳米颗粒)。在优选的实施例中，等离子体纳米颗粒是银或金纳米颗粒(无涂层)，更优选银纳米颗粒(无涂层)。

为本领域技术人员周知的是，等离子体纳米颗粒可以有不同(纳米)形状、尺寸、形貌和尺寸分布。具体来说，可以调整纳米颗粒的尺寸和形状以提高给定分析物的SERS增强。在优选的实施例中，等离子体微粒为棱锥状、类球形(包括球形)、血小板状或棒状。在实施例中，等离子体纳米颗粒直径的D50的尺寸在约2nm至约500nm之间。在实施例中，等离子体纳米颗粒直径的D50的尺寸为至少约2nm、至少约10nm、至少约25nm，或至少约50nm，和/或至多约500nm、至多约250nm、至多约200nm、至多约100nm、至多约75nm，或至多约50nm。

在本发明的方法的优选实施例中，等离子体纳米颗粒凝聚，使得它们彼此紧密接近(和/或接触)。确实，如下文的例子所示，配合使用氧清除剂，可以实现沿等离子体材料的长距离信号传播，进而实现对分析物进行远距离检测。可以使用本领域任何已知技术使等离子体纳米颗粒凝聚。本领域技术人员众所周知，有许多方法可以使纳米颗粒凝聚，例如添加凝聚剂、调节pH、加入例如有机醇的有机溶剂，或这些方法的结合，所述凝聚剂为例如凝聚分子(即能够桥接纳米颗粒并诱导凝聚的分子)或电解质(例如盐)。在本发明优选的实施例中，通过添加溶解的盐和/或调节pH值使纳米颗粒凝聚。

在实施例中，等离子体纳米颗粒通过添加诸如硫酸盐或亚硫酸盐的凝聚剂而聚集。在实施例中，凝聚剂和氧清除剂是不同的材料。在实施例中，凝聚剂是氧清除剂，优选亚硫酸盐，优选为亚硫酸钠。在一些实施例中，液体样品的pH值在凝聚前调节到约4。例如，SiO

此外，在优选实施例中，等离子体纳米颗粒可以由小的松散结合的被覆分子稳定，所述被覆分子优选为柠檬酸盐、乙醇、乙二醇和/或聚乙二醇，更优选为柠檬酸盐和/或乙醇。这些分子可作为还原剂和结构导向剂，意味着它们可在合成过程中决定颗粒形状，并且稳定形成的纳米颗粒。这种被覆分子(被覆配体)也可以改善等离子体材料(其作为SERS基底)的光学性质，同时易于被巯基化的分析物取代。

在优选的实施例中，在所述纳米颗粒凝聚之前和在使用氧清除剂去除溶解氧之前，将所述等离子体纳米颗粒添加到所述液体样品中。

在实施例中，与特定分析物相互作用以产生独特信号的分子在与所述分析物接触之前被预吸附到所述等离子体纳米颗粒或粗糙的等离子体表面，所述分子为，例如，金属离子的螯合剂。

测量SERS光谱

一旦液体样品按照上述方法进行修饰，且然后与等离子体材料接触，本发明描述的方法可进一步包括测量该液体样品的SERS光谱的步骤。

该步骤可以使用本领域任何已知的SERS技术，使用本领域任何已知的SERS系统来执行，一般而言，该步骤包括用通常来自激光器的光照射所述等离子体材料，并检测由所述等离子体材料散射的拉曼信号。

在优选实施例中，使用本发明的探针进行测量步骤，该测量步骤在下文描述。

在优选实施例中，所用的SERS系统在下一节被定义。

使用SERS进行远距离探测的探针

在本发明的第二方面，提供了一种使用SERS对液体样品中的分析物进行远距离检测的探针。本发明的探针包括：

检测室，其具有对SERS激发光和拉曼散射信号透明的窗口；以及

具有第一端和第二端的导管，所述导管的第一端可流动地连接到所述检测室，且所述导管的所述第二端被配置为与液体样本接触，

其中：

所述的检测室和所述第一端和第二端之间的所述导管包含浸在除氧溶剂中的等离子体纳米颗粒，其中所述等离子体纳米颗粒彼此紧密接近，从而允许等离子体场从所述检测室到所述导管的所述第二端的不受阻碍的传播及返回，和/或

所述检测室的内壁和所述第一端和第二端之间的所述导管的内壁涂覆有等离子体纳米层，其中，所述等离子体纳米层从所述检测室到所述导管的所述第二端是连续的，从而允许等离子体场从所述检测室到所述导管的所述第二端的不间断的传播和返回，且其中所述导管和所述检测室里充满除氧溶剂；以及

其中所述除氧溶剂包含氧清除剂，所述氧清除剂从溶剂中除去溶解氧。

等离子体层是一层含有粗糙等离子体表面的等离子体材料。在本节中，等离子体材料(包括等离子体纳米颗粒和粗糙的等离子体表面)如上一节所述(例如材料、粗糙度、形状等是相同的)。

在使用探针过程中，SERS激发光将通过透明的窗口进入检测室。SERS激发光将照射在检测室中的纳米颗粒上，从而产生等离子体场。由于等离子体纳米颗粒在整个探针(导管和检测室)内彼此靠近(或等离子体层是连续的)，并且因为它们在包含氧清除剂的除氧溶剂中，该等离子体场将以不间断的方式从检测室传播到导管的第二端。在此，该等离子体场将与分析物相互作用，产生信号等离子体场(即SERS信号)，该场将沿着导管传播返回检测室。最后，该信号等离子体场将穿过检测室的透明的窗口离开检测室，并最终被光检测器检测到。

如所提及的，本发明的探针利用SERS进行远距离检测。具体而言，通过将导管的第二端与液体样品直接接触，尽管样品与光谱仪相距一定距离(即导管的长度)，但仍可获得样品的SERS光谱。这允许直接测量样品的光谱，而不必使样品靠近光谱仪，且还允许在其它情况下对光谱仪来说太小的空间中测量样品(因为只有管道需要进入液体样品所在的空间)。

探针的尺寸和长度取决于导管和检测室的尺寸，其将在下文详细定义。例如，使用更长、更窄的管子自然会使探针更长、更窄。然而，本领域技术人员明白探针的尺寸可以根据探针的预期用途来选择和调整。例如，如果探针打算用于测量核反应堆中的液体样品，导管(以及因此探针)的尺寸将被调整，以便导管能够安全地到达并检测核反应堆内的液体样品。

在优选实施例中，在所述检测室和在所述第一端和所述第二端之间的所述导管包含浸在除氧溶剂中的等离子体纳米颗粒。在实施例中，使用上一节所讨论的任何技术如上一节所定义的使所述等离子体纳米颗粒沿着所述导管的纵向凝聚。

所使用的除氧溶剂可以是本领域已知的任何溶剂。在实施例中，溶剂是水或有机溶剂，如甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙腈、乙醚、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、二甲基甲酰胺、二甲苯、烃或其混合物。在优选的实施例中，溶剂选用水。如前所述，溶剂被除氧，并且溶剂包括从溶剂中除去溶解氧的氧清除剂，这意味着它的溶解氧已被氧清除剂去除。氧清除剂如上一节所定义。此外，加入的氧清除剂的浓度以及剩余的DO的浓度如上一节所定义。

如上一节所述，溶解氧的去除导致SERS场的有效耦合，该等离子体耦合使电磁场长距离传播而没有明显的信号能量损失。因此，通过使用除氧溶剂，电磁场沿着导管的纵向传播。

导管

本发明的探针的导管允许等离子体场从检测室传播到导管的第二端并返回。信号等离子体场可以通过多种方式在第二端产生。一个例子是，如果液体样品中包含的分析物在导管的第二端处与等离子体材料接触(优选为吸附)，比如浸于除氧溶剂中的纳米颗粒。另一个例子是，如果液体样品本身产生等离子体场(例如如果液体样品已经使用前文所定义的方法修饰并且包含凝聚的等离子体纳米颗粒)。后一个例子意味着液体样品和包含在导管中的除氧溶剂都已经使用氧清除剂进行了除氧处理。

图1A为根据本发明的探针的实施例的导管(g)的第二端的纵向截面图。该图显示了导管g的内壁(12)和外壁(16)以及导管g该端的端壁(14)。

导管的第二端可以是打开的，也可以是关闭的(优选为打开的)。图1B和1C示出了导管g的第二端是打开的实施例。图1B为根据本发明的探针的实施例的导管g的第二端的纵向截面图，所述导管g包含浸在除氧溶剂中的等离子体纳米颗粒(18)。图1C为根据本发明的探针的另一个实施例的导管g的第二端的纵向截面图，其中导管g的内壁12涂覆有等离子体层(20)，导管g填充除氧溶剂(23)。

当导管打开，则除氧溶剂(以及等离子体纳米颗粒，如果使用)在一些情况下可能会流出导管的第二端。相应地，在导管的第二端是打开的一实施例中，检测室和导管用例如来自泵或储液装置的除氧溶剂(和等离子体纳米粒子，如果它们被使用)重新填充，使得管子和检测室保持充满脱氧溶剂(和等离子体纳米粒子，如果它们被使用，因此等离子体纳米颗粒可以彼此保持紧密接近)。泵或储液装置可以直接连接到导管的第一端，或其可以连接检测室，使得任何从导管第二端流出的除氧溶剂/等离子体纳米颗粒被替换。在其它情况下，特别是当导管直径较小时，尽管导管的第二端是打开的，毛细管力可能将除氧溶剂(和等离子体纳米粒子，如果它们被使用)保持在导管内。在另外的情况下，即使导管的第二端是打开的，只要确保检测室和导管中没有漏气就足以确保除氧溶剂(和等离子体纳米粒子，如果它们被使用)保留在导管中(这类似于从一杯水中取出顶端被堵住的吸管：只要吸管的顶端被堵住，水就会留在吸管中)。

在导管的第二端是打开的优选实施例中，导管的第二端至少部分地涂覆有等离子体层。图1D和1E示出了该涂层的实施例。图1D为包含等离子体纳米颗粒18的导管g的第二端的纵向截面图，其中，端壁14、朝向导管g的第二端的内壁(22)和朝向导管g的第二端的外壁(24)涂覆有等离子体层(26)。这个等离子体层26与等离子体纳米颗粒和除氧溶剂紧密接近(优选为相接触)，从而确保了等离子体场在纳米颗粒和该层之间的传播。图1E是导管g的第二端的纵向截面图，其中内壁12涂覆有等离子体层(28)(类似于图1C所示)，但其中等离子体层(28)也覆盖端壁14以及朝向导管g的第二端的外壁(24)。这些等离子体层(26，28)也与液体样品接触，从而允许分析物和等离子体场之间的期望的相互作用。

在替代实施例中，导管的第二端也可以被等离子体层封口。图1F和1G示出了该封口的实施例。图1F是导管g的第二端的纵向截面图，所述导管g包含等离子体纳米颗粒18，末端被等离子体层(30)封口。等离子体层(30)的内侧紧密接近(优选地接触)等离子体纳米颗粒和除氧溶剂，从而确保等离子体场在纳米颗粒和所述层之间的传播。图1G是导管g的第二端的纵向截面图，其中内壁12和被等离子体层(32)涂覆(类似于图1C所示)，但其中等离子体层32也封口导管g的第二端。在使用中，这些等离子体层(30，32)的外侧与液体样品接触，从而允许分析物和等离子体场之间发生期望的相互作用。的确，任何与等离子体层接触或紧密接近的分析物都会产生信号等离子体场，该信号等离子体场将被传输到检测室，在检测室中SERS信号可以通过光谱仪被检测。使用这样的配置，无需不断地补充浸在除氧溶剂中的等离子体纳米颗粒，因为没有等离子体纳米颗粒会从第二端逸出(与第二端打开的配置不同)。

导管可以由本领域已知的且不会对等离子体场的产生和传递产生不利影响的任何导管材料制成。通常的理解是，探针的预期用途可能会影响导管材料的选择。例如，当探针用于需要弯曲导管的情况时，更柔软的材料可能是优选的。在实施例中，导管由金属、石英、玻璃或聚合物塑料制成，所述聚合物塑料例如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚醚醚酮、聚氯乙烯、聚四氟乙烯或聚二甲基硅氧烷。在优选的实施例中，导管为聚醚醚酮(PEEK)聚合物管或玻璃毛细管。

总的来说，导管较细更有利。通过使用较小内径的导管，将需要较少的浸泡在除氧溶剂中的等离子体纳米颗粒来填充导管，导管内的毛细管作用增加；等离子体场沿导管纵向的传输将得到改善，因为它将更容易将等离子体纳米颗粒充分地包装在一起，从而使它们彼此紧密接近。此外，外径较小的导管的尺寸也较小(意味着导管能够进入较小的空间)。此外，导管的内径应适合于散射检测。在实施例中，导管的内径在约0.08毫米与约1厘米之间，优选地在约0.3毫米与约0.5毫米之间。在实施例中，导管的内径至少为约0.08毫米；至少为约0.1毫米；至少为约0.2毫米；或至少为约0.3毫米；和/或至多为约1厘米；至多为约5毫米；至多为约2毫米；至多为约1毫米；至多为约0.75毫米；或至多为约0.5毫米。在优选的实施例中，导管的内径约为0.3毫米或约0.5毫米。

如前所述，增加导管的长度将增加探针的长度，从而允许在距SERS光谱仪更大的距离处测量样品的SERS光谱。在实施例中，导管的长度至少为约5cm；至少为约10cm；至少为约20cm；至少为约50cm；或至少为约75cm；和/或至多为约50m；至多为约20m；至多为约10m；至多为约5m；至多为约2m；或至多为约1m。在优选的实施例中，导管的长度为约1m或约2m。

本领域普通技术人员将理解，导管不一定需要具有圆形横截面。事实上，其横截面可以是任何形状(椭圆形、矩形等)。

“紧密接近”

本领域谱技术人员很清楚随着离等离子体材料表面的距离的增加，在等离子体材料表面产生的等离子体场强度将降低(或多或少地以指数方式)。

在分析物与等离子体纳米颗粒或等离子体层紧密接近的上下文中，“紧密接近”意味着分析物与层/纳米颗粒足够接近，从而与纳米颗粒/层的等离子体场相互作用，进而产生等离子信号场。

在本文等离子体纳米颗粒的上下文中，“紧密接近”意味着纳米颗粒足够接近，使得纳米颗粒的等离子体场可以激发下一个邻近的纳米颗粒，从而使其产生等离子体场，这种等离子体场的传播以不间断的方式重复从检测室出发到导管第二端并返回。当然，“紧密接近”包括粒子相互接触的情况。在等离子体层与等离子体纳米颗粒紧密接近的情况下，类似地，“紧密接近”意味着纳米颗粒和层足够接近，使得纳米颗粒的等离子体场可以激发等层的等离子体场，从而在层上产生等离子体场(反之亦然)。

值得注意的是，等离子体场的准确传输距离取决于所用的等离子体材料。例如，如下文进一步讨论的，计算模型表明，对于崭新(未涂层)和氧化银涂层的银纳米颗粒，等离子体场的传输似乎分别在17nm和9.8nm的距离处结束。较近的距离有更强烈的共振，因此它们可能会进一步传递等离子体场。因此，在实施例中，“紧密接近”意味着相隔至多约15nm的距离，优选为至多为约10nm的距离，最优选为至多约5nm的距离(等离子体纳米颗粒之间、等离子体纳米颗粒和等离子体层之间，或前述之一和分析物之间)。

应该清楚的是，等离子体纳米颗粒可以以这样的方式紧密接近，使得这些等离子体纳米颗粒的密度沿导管纵向变化；重要的是SERS信号可沿着导管的纵向被传输。

由于等离子体纳米颗粒彼此紧密接近(或由于等离子体层是连续的)，因此导管的第二端出现的信号等离子体场能够沿着导管传输到导管的第一端，这里可以用光谱仪测量SERS信号。需要重点强调的是，如果不使用氧清除剂去除溶解氧，上述等离子体场传播(在等离子体纳米颗粒之间或沿等离子体层)不会发生。在这种情况下，即使在使用其他除氧技术(如注入惰性气体于样品)时，等离子体场也会在非常短的距离内被淬灭。

检测室

检测室是探针的一个组件，它可通过液体与导管的第一端相连。探针的检测室配置为与表面增强拉曼光谱仪一起使用，使得表面增强拉曼光谱仪的入射光可进入检测室。检测室也是表面增强拉曼光谱仪通过光谱仪检测器的视场测量从导管返回的SERS信号的地方。这就是为什么检测室对SERS激光和拉曼散射光是透明的，因为这允许SERS激光作用于检测室，且因为这允许探测器的视场测量样品中返回的分析物SERS信号。

检测室与导管的第一端之间通过流体连接，优选通过检测室的孔连接，使得除氧溶剂(和等离子体纳米颗粒，如果使用的话)可以在检测室和导管之间流动，或使得等离子体层从检测室到导管是连续的(即不间断的)。检测室还包括浸泡在除氧溶剂中的等离子体纳米颗粒或涂有等离子体层的内壁，因为这将使已经传输到导管的第一开口端的SERS信号传播到整个检测室，在此其可以被检测室的视场测量。

本领域普通技术人员将理解，检测室可具有适用于SERS检测的任何形状和结构，并且可以由任何适合SERS检测的材料制成，在优选实施例中，检测室由玻璃、塑料或石英制成，更优选为玻璃或石英。

液体样本

液体样品可以是待探针测量的任何液体样品。在实施例中，包含在液体中的分析物可以被放置为与包含在探针中的等离子体材料(在前一节定义)接触(例如在封闭的第二端的情况下完全涂覆第二端的等离子体层；或在打开的第二端的情况下，涂覆第二端的等离子体层或浸泡在除氧溶剂中的等离子体纳米颗粒)。在实施例中，液体样品可以被放置为与前一节中定义的等离子体材料接触。在这样的实施例中，等离子体材料(并且因此液体样品)可以定位在与导管的第二端接触的表面和/或容器上。在优选的实施例中，分析物被吸附到等离子体材料上。

在优选的实施例中，液体样品已经被除氧，优选地使用上一节中定义的氧清除剂除氧。氧清除剂的量以及液体样品中剩余的DO浓度可为如上一节所定义。

在实施例中，液体样品是如上一节所定义的液体样品。在优选的实施例中，使用本发明的方法对液体样品进行修饰。

本领域的普通技术人员将理解，由于探针旨在用于SERS测量，液体样品可以是能进行SERS测量的任何液体样品。

如上所述，本发明的探针配置为被放置为与液体样品接触。例如，探针的第二端可以浸入液体样品中，或者第二端可以置于液体样品的表面。为清楚起见，是导管第二端的末端(无论是否关闭)被置于与液体样品接触。

与SERS光谱仪一起工作的探针

本节将描述如何配置探针，使其与SERS光谱仪如何一起工作。图2为常规表面增强拉曼光谱仪的示意图。图2的系统由透明样品容器、激光光源、检测器、用于将激光光源和检测器连接到样品容器的光缆和用于解释和显示检测器获得的数据的计算机组成。而图3描绘了用于远距离检测的表面增强拉曼光谱仪的示意图，其包括与图2中给出的表面增强拉曼光谱仪的大多数相同的组件。然而，由探针的检测室代替样品容器，在检测室引入入射光和检测到在导管中传播的散射光(即SERS信号)，所述导管连接到尖端(导管的第二端)，导管第二端尖端与液体样品接触(例如浸入样品内部或接触其表面)。图3所示的检测室与泵和储液装置相连，用于向导管充填液体。

还应注意的是，本发明的探针可以用于SERS光谱仪系统，例如用于下文实验部分的远程测试的系统。

本发明的探针在使用中与分析物相接触，即导管的第二端与分析物接触。在优选的实施例中，分析物优选地吸附到等离子体材料的表面，该表面可以是导管中纳米颗粒的表面、涂覆(coated)在导管的第二端的等离子体层，和/或吸附(capping)在导管的第二端的等离子体层。在替代实施例中，分析物在根据本发明的方法产生的除氧液体样品中，所述样品包含聚集的等离子体纳米颗粒或粗糙的等离子体表面，其中之一与导管中的纳米颗粒接触；涂覆在导管的第二端的等离子体层接触；和/或吸附在导管的第二端的等离子体层接触。

在实施例中，与特定分析物相互作用以产生不同信号的分子(例如金属离子的螯合剂或与生物分子相互作用的抗体、肽或适配体)可以预先吸附在导管中的等离子体纳米颗粒上、液体样品中的等离子体纳米颗粒上、涂覆在导管的第二端的等离子体层上和/或吸附在导管第二端的等离子体层上。

图2的表面增强拉曼光谱仪(当使用根据本发明方法修饰的液体样品时)和图3所示的用于远距离检测的表面增强拉曼光谱仪(包括本发明的探针)可通过将入射激光照射到样品容器或检测室，并使用检测器测量散射光来检测分析物。在优选的实施例中，检测到反向射散光(相对于入射光散射180°的光)，但可能检测到相对于入射光外任何角度散射的光。

在使用化学氧清除剂去除氧时，在图2的表面增强拉曼光谱仪(当使用根据本发明方法修饰的液体样品时)和图3所示的用于远距离检测的表面增强拉曼光谱仪(包括本发明的探针)中观察到显著的信号放大。除氧还使本发明的探针的表面增强拉曼光谱仪的远距离检测能力得以实现。

本发明的优点

在研究本发明的方法时，发明人发现了令人惊讶的结果，即在使用氧清除剂去除DO后分析物的SERS光谱信号强度显著增加。

在实施例中，除了先前讨论的优点外，本发明的方法以及探针可展现以下一个或多个优点：

·分析物的检出限(LOD)可达10zm(相比于需氧(非除氧)样品的10pm，灵敏度提高10

·当使用二氧化硅涂覆的纳米颗粒(如AgNPs)时(即SHINERS技术)，也可以观察到信号增强，其中LOD从500nM降低到50aM

(10

·尽管绝对敏感性依赖于等离子体颗粒本身，但去除DO时的相对信号增强(与未修饰的液体样品相比)可以保持在10

·分析物不再需要被照射(意味着它不再必须在入射光源的光束直径内),也不必在探测器的视场内，这允许本发明的方法和探针的更广泛的潜在应用，例如环境监测。

·检测时间不是由分析物扩散到检测器视场中决定的，而是由等离子体场的传输决定的。SERS信号可在导管另一端照射后立即获得。这种快速响应除了具有高灵敏度外，还产生了高时间分辨率，这允许监测快速化学事件，例如研究化学反应或在单分子水平上检测存在时间很短的不稳定中间态物质(short-lived species)。

·本发明的方法具有成本效益，只需要常规的拉曼光谱仪而不需要昂贵的SERS检测器。这大大减少了进行SERS实验的投资，并将促进全球在这一领域的研究，特别是在发展中国家和资源有限的地区。相信所述技术前所未有的检测灵敏度、快速响应时间和远距离检测能力可在医学诊断、环境监测和国家安全等方面产生许多应用。

定义

术语“一”、“一个”和“所述”的使用以及在描述发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)的类似提及应解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。

术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即意思是“包括但不限于”)，除非另有说明。

除非本文件另有说明，本文中数值范围的叙述仅旨在用作单独引用落入该范围内的每个单独值的速记方法。且每个单独的值被并入说明书中，就像它在本文中单独地叙述一样。在这些范围内的值的所有子集也被合并到说明书中，就像它们在本文中单独地叙述一样。

本文所述的所有方法都可以按任何合适的顺序执行，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。

本文提供的任何和所有例子或示例性语言(如“例如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且除非另有要求，否则不对本发明的范围构成限制。

说明书中的任何语言都不应被理解为表明任何未要求保护的元素对于本发明的实践是必不可少的。

在此，术语“约”有其普通含义。在实施例中，其可以指限定数值的正负10％或正负5％。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

本发明的其他目的、优点和特征将通过阅读以下仅参考附图以示例方式给出的具体实施例的非限制性描述变得更加清晰明了。

说明性实施例的描述

通过以下的非限制性示例对本发明进行更详细的说明。

实验程序

表面增强拉曼光谱图用785nm的固态Nd-YAG激光器记录(线宽<3.2厘米

材料和试剂

所有试剂都是市售的，且在没有进一步纯化即可使用。硝酸银(AgNO

银纳米颗粒合成

银纳米颗粒(AgNPs)由小的松散结合的被覆分子稳定，即柠檬酸盐和乙醇。所述银纳米颗粒被用作SERS基底，因为它们具有优异的光学性质和容易被巯基化分析物取代的被覆配体。使用“Q.Zhang,N.Li,J.Goebl,Z.Lu,Y.Yin,A Systematic Study of theSynthesis of Silver Nanoplates:Is Citrate a“Magic”Reagent？J.Am.Chem.Soc.133,18931–18939(2011)”中报道的方法合成该银纳米颗粒，该文献的全部内容通过引用并入本文。所得的AgNPs在590nm处有最大吸光度。TEM成像显示平均直径为17±2nm的三角形纳米颗粒(图4示出了用于以下试验的银纳米颗粒和聚集体的透射电子显微照片)。如所制备的，浓度为0.3nM的AgNP以12,000rpm离心20分钟浓缩至7nM。除非另有说明，否则以下实验中对AgNPs的所有提及均指上述制备的AgNPs。

二氧化硅涂覆的银纳米颗粒的制备

等体积的AgNPs(7nM)和TEOS(1μm)在1.5毫升EtOH中用聚丙烯微量离心管超声10分钟。12500转/分离心20分钟后未观察到聚集。在加入凝聚剂进行SERS测量之前，将pH值调整为4。除非另有说明，否则以下实验中对二氧化硅涂覆的AgNPs的所有提及均指上述制备的除非另有说明，否则以下实验中对AgNPs的所有提及均指上述制备的AgNPs。

电化学测量

使用双恒电位仪(bipotentiostat)(CS2350，武汉科斯特仪器有限公司，中国武汉)进行电流分析。丝网印刷的蜂窝状金工作电极和对电极与外部Ag/AgCl参考电极一起使用(Pine Research instrument，美国北卡罗来纳州Durham)。蜂窝状电极有19个直径为0.50毫米直径，深1.5毫米的孔，孔之间相隔0.75毫米，其允许AgNPs通过工作电极。以1200转/分的速度搅拌溶液。对于所有的电位范围测量，初始电位为0V，低电位为-0.9V、-1V和-1.7V，高电位设为+0.9V、+1V和+1.7V。电流增强与施加电压无关，没有观察到电极不稳定性的影响。脉冲宽度为10s，频率为10Hz。使用石英比色皿作为样品容器(没有观察到背景干扰)。在电极区域外用785nm激光照射样品。图5A示出了用于电化学测量的上述系统的实验装置示意图。为了清楚起见，这些电化学实验被设计为用于显示通过激光激发AgNPs而增强的等离子体场的传输。没有分析物存在或产生光谱。

表面增强拉曼光谱

为评价AgNPs吸附的不同分析物的检测灵敏度，在5x100毫米的石英NMR管(0.5毫米石英厚度)中测量SERS信号。样品通过添加亚硫酸盐或硫酸盐以及实验中提出的任何其它添加剂而聚集。值得注意的是，二氧化硅涂覆的AgNPs在加入亚硫酸盐或硫酸盐使其凝聚之前，需要将pH值调整到～4。用固体Nd-YAG激光(785nm，线宽<3.2厘米

使用连续稀释进行仔细的样品制备，从而完成包含极低浓度分析物(pNTP)样品的准确和精确测量。用新鲜制备的王水浸泡所有预清洗的玻璃容器(例如100毫升容量瓶和石英试管)2小时，然后用纳米纯水冲洗直至中性，然后用无水乙醇冲洗。准备样品的分析人员通过使用分析天平称量微量移液器输送的特定体积(20μL)水的质量来测试微量移液器的准确性和精密度。所得数值为20.00±0.09μL(n＝10)。通过一系列对初始母液(该母液用大于100.0毫克pNTP制备，以获得4个有效数字的测量值)的5000倍的连续稀释(20μL变为100mL中)精心制备工作母液；即：将102.7mg的pNTP溶解在50毫升无水乙醇中以制备初始母液(13.22mM)，通过涡旋混合和超声确保pNTP颗粒完全溶解。稀释步骤的数量被最小化，以减少最终获得的浓度的误差传播。通过将60.5μL的初始母液稀释到100ml A级容量瓶(100.00±0.08mL，在25摄氏度)中，制成系列稀释液中的第一个(8μM)。倒置容量瓶多次让液体充分混匀。这个过程重复三次，每次将上一次制成的溶液的20μL注入到一个新的100mL容量瓶中，从而制成标称浓度(nominal concentration)为1.6nM、320fM和64aM的溶液。通过在使用前分别将37.5μL或7.5μL的64aM溶液在新的15ml离心管中稀释，制备出浓度为160zM和32zM的母液。

制备两种浓度的两批样品(每批100份)，使得每份样品中包含一个分析物分子的估计概率分别为60％或12％。在25μL中包含统计概率平均值为0.60和0.12个分子的所需的分析物浓度分别为40zM和8zM。通过将10μL的pNTP母液(160zM或32zM)、10μL的7nMAgNP溶液和20μL的纳米纯水加入600μL的微量离心管中制备样品。为进行快速筛选，每个40μL的样本都加入Na

采用类似的样品制备程序制备其他分析物，包括pATP和4个不同浓度的多聚体寡DNA序列，以及不同浓度的pNTP。然而，尽管以上的pNTP样品通过5000倍连续稀释制备，本段中定义的样品用通过100倍连续稀释制备。之后，检测物(例如pATP)与AgNP溶液混合获得目标分析物浓度；例如，各75μL的pATP和AgNP溶液与150μL的纳米纯水混合。每种浓度在3个独立的重复中制备，以获得标准差。对于每种溶液(例如pATP+AgNP溶液)(300μL)，加入10mg的Na

考虑到分析天平的±0.1毫克误差，并假设50毫升试管体积的±0.1毫升误差，pNTP初始母液的浓度存在潜在的0.22％的最大误差。对于每一次稀释，浓度的相对标准偏差由移液的相对标准偏差(0.47％)和容量瓶的相对标准偏差(0.08％)的均方根(root sumsquare)决定，为～0.48％。该误差在初始和三个连续稀释步骤中加剧，且被视为独立事件，即偏差是随机的，不是系统的，从而导致浓度误差为～1.9％。在此之后，还有一个额外的稀释步骤来形成160zM和32zM的工作母液用于分析。假设在15mL的试管中存在±0.1mL误差，且与移液的相对偏差相同，这会产生额外的0.81％误差。纳米颗粒吸附步骤包括三个移液事件，这些都会给分析物溶液的最终浓度带来误差。假设相同的误差在10μL和20μL加入中发生，额外的～0.43％浓度误差也会产生。每个稀释步骤都是一个独立的事件，因此浓度的总体相对误差预计为～2.1％。因此分析物溶液中的浓度应该为40±0.85zM或8±0.17zM，其分别对应25μL样本中的为58.7％–61.3％或11.7％–12.3％的检测概率。

概率分析的结果及意义

通过在标准熔点毛细管中加入Na

远距离检测

为了测试本发明中探针的功效，及为了确定等离子体纳米颗粒聚集体内部和之间的等离子体偶联程度，设计了两个实验。这些实验试图通过将分析物分子吸附在银镜表面上，将其从入射光源和检测器的视场中分离出来，并通过大量的漂洗彻底去除任何未吸附或松散结合在银镜表面的分析物(这些实验与图18-20相关，它们的结果在下面会被论述)。用一根10cm长的石英NMR管或两端分别与一根短段石英NMR管相连的1m长的一根PEEK毛细管来实现这个实验。

首先，为了在管末端制备银镜面，由0.1M AgNO

之后，加入100nM的分析物(例如pATP)以覆盖银镜表面，然后用EtOH和纳米纯水各冲洗30次NMR管和PEEK管，以便从银镜表面除去任何未结合的分析物(PEEK管的冲洗从与银镜相反的一端注入液体，以防止分析物进入管内)。为检测吸附在玻璃NMR管或PEEK管远端(第二端)的分析物，用AgNP溶液填充该彻底冲洗后的装置，该AgNP溶液在加入过量的Na

通过纳米颗粒聚集体进行远距离盲测

制备使用本发明的探针进行远距离检测的样品以用于盲测。样品的母液为50％体积的乙醇(400μL)中含有0或2μM的pNTP和3.5nM的AgNPs。将溶液超声处理30分钟，以确保pNTP和AgNPs混合良好，让pNTP吸附到AgNP表面。为去除任何残留的未吸附的pNTP(这些pNTP可能通过溶液扩散)，将样品以12,700转/分的速度离心30分钟来沉淀NPs；除了20μL的溶液外，其余都被移除(以免干扰沉淀的NPs)。将样本用乙醇稀释至1500μL，并再超声处理30min。在最后离心之前，重复这一过程总共洗涤两次(将最大可能的游离pNTP降低到～356pM)，溶剂去除(到20μL)和在50wt％乙醇中重新悬浮，最终最大可能的游离pNTP浓度约为18pM。样品制备人员将20μL样品随机分配到20个微量离心管中，然后用20μL水稀释(如果pNTP没有被吸附，则最终最大游离pNTP浓度为～9pM，预估阳性对照AgNP吸附浓度1μM)，做好记录(并不告诉分析者)。盲测中，阳性和阴性对照的数量和身份对分析者是未知的，该分析者在测量前通过添加Na

计算建模的理论解释

为了了解Ag

E场用标量和矢量势表示，分别为Φ(电标量势)和A(磁矢量势)。

应用边界条件后，两种介质界面(s)的电位移(D)，1和2被建议为(n

空间卷积采用紧致矩阵表示法。无氧或氧化层系统的电位移将是每个AgNP的每个界面上的电位移之和，得出：

等式中，Ag表示AgNPs，Ag

当介质中存在分子氧(O

技术人员将理解，在文献中可以找到BEM方法及其在NP表面等离激元中的应用的详细阐述。AgNPs、Ag

图7中值得注意的是，在无氧化银和有氧化银涂覆的银纳米颗粒两种情况下，电磁场传输分别终止于17和9.8nm处。

结果和讨论

制备的样品的表面增强拉曼光谱及单分子检测概率分析的结果与讨论

针对第一系列测量，采用上述方法在有和没有溶解氧的情况下制备不同浓度的对氨基苯硫酚溶液和对硝基硫酚溶液。AgNPs用作等离子体材料(SERS基底)，亚硫酸钠用作氧清除剂。

在图8中，标记为“空白”(Blank)的光谱是包含Na

在图9中，使用与图8相同的测量参数，但对氨基硫酚的分析物浓度不同。图9的其它测量参数与图8相同。图9A-C中的光谱为含溶解氧(10mg硫酸钠)的样品，而用10mg亚硫酸钠进行了除氧的样本的光谱在图9D-F中。请注意，图9B和9E仅分别表示图9A和9D的独立光谱。

通过使用噻吩醇(即对氨基硫酚(pATP)和对硝基硫酚(pNTP))作为主要分析物，并使用棱锥形AgNPs作为等离子体物质(SERS基底)进行原理验证研究，观察到用亚硫酸钠(Na

如前所述，除非另有说明，所有实验均采用三角形棱锥形AgNPs。在所有进行了的实验中，除非另有提及，亚硫酸钠作为DO清除剂，其通过筛选柠檬酸盐被覆剂(cappingagent)的表面电荷，同时凝聚AgNPs(将硫酸钠Na

如前所述，图4示出了沉积在铜网格上的AgNPs的透射电镜显微照片；图4a)和b)是在凝聚之前的照片，c)和d)是在用10mg亚硫酸钠凝聚和充分漂洗以除去盐晶体之后的照片。

图10A)通过动态光散射显示AgNP大小分布，而图10B-D显示了B)AgNPs、C)对氨基苯硫酚和D)对硝基硫酚的拉曼光谱。具体地，图10B是制备的AgNPs的空白光谱，其中大峰与柠檬酸盐被覆剂有关。图10C和D是高浓度(100mM)的pATP和pNTP的拉曼光谱，以显示哪些峰可用于检测(应该注意的是，1000厘米

基于C-H弯曲(1135–1142cm

其它分析物也观察到类似的SERS增强因子(EF)增加。所述的其它分析物即使用上述方法制备的4个多聚体寡核苷酸序列(见图11A和B，在上文详细描述)。具体地，图11A和B示出了使用与图8中使用的相同测量参数的含氧样品(10pm分析物)和不含氧样品(8zm分析物)的寡核苷酸的SERS光谱。

当使用球形而非棱锥形的AgNPs时也观察到了类似的结果。无论是使用化学除氧(例如亚硫酸钠、肼或抗坏血酸盐)还是用惰性气体物理去除(例如采用N

在图13A和B中，使用与图8相同的测量参数，但使用各种对硝基苯硫酚的分析物浓度，并使用不同的氧清除剂，获得了各种SERS光谱。具体地，图13A示出了使用10mg的抗坏血酸进行pNTP除氧的SERS光谱，而图13B示出了肼(50mM)除氧的pNTP的SERS光谱。

在图14A和B中，使用与图8所使用的相同的测量参数获得SERS光谱(分析物pATP浓度为100fM)，区别在于在电化学系统中进行测量以监测氧浓度，且加入不同量的氧清除剂(Na

类似地，在图14C和D中，使用与图8所使用的相同的测量参数获得SERS光谱(分析物pATP浓度为100fM)，区别在于在电化学系统中进行测量以监测氧浓度，用氩气注入样品代替加入氧清除剂。为了测试不同的DO浓度，氩气注入时间逐渐增加。

从图13中可以看出，与Na

研究AgNP表面氧化对SERS增强的影响(图15，上文详细描述)，因为与有氧(即非除氧)样品相比，去除DO也减少了AgNP表面Ag

同样，图16A显示了金纳米棒(AuNRs)的紫外-可见光谱，而图16B显示了AuNRs上去除和不去除氧的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的SERS光谱和较高浓度的CTAB(100mM)的拉曼光谱。为清楚可见，标记为“Na

如所述，图17A示出了二氧化硅涂覆的AgNPs的透射电子显微镜图TEM，而图17B示出了除氧凝聚的二氧化硅涂覆的AgNPs(在pH4)上pATP的SERS光谱，图17C显示了除氧凝聚的二氧化硅涂覆的AgNPs(ph4)上pATP(50aM)和pNTP(50aM)的SERS光谱。

基于这些结果，显示介电氧化层的形成(在这种情况下，介电氧化层指的是Ag

这一发现挑战了对SERS的传统理解。基于传统理解，分析物必须被激发光照射，且同时存在于检测器视场内。由于激光束相当狭小(准直时光径为2.5μm)，假设分析物均匀分布在液体样品中，基于激光照射的体积与样品体积之比，分析物被照射的概率为5.4×10

基于这些观察，去除样品DO导致SERS场的有效耦合，这种等离子体耦合使电磁(EM)场能够在整个液体样品体积中传播而没有明显的信号能量损失。AgNPs被光激发产生的等离子体场在整个样品中传播，到达吸附了分析物的AgNP，并将分析物的拉曼散射信号返回检测器。如果不去除DO，氧的高电子亲和力就会捕获电子，并阻止AgNPs及其聚集体之间SERS场的有效产生、耦合、传播和整合，这是通过实验和计算模拟验证到的。然而，DO去除使等离子体物质(在这种情况下，AgNP聚集体)产生的等离子体耦合和SERS场运输成为可能。

对一个AgNP聚集体产生的等离子体场的计算结果显示了纳米颗粒之间预期的等离子体偶联，以及等离子场在纳米间隙中增强(见图6和7，在上文详细描述)。悬浮在纳米间隙中或吸附在AgNP表面上的分子氧导致电荷再分布和等离子体偶联的淬灭。当模拟氧化银包覆的AgNPs时，等离子体场有所减少，但DO的引入明显抑制了EM场，阻止了偶联。DO猝灭效应独立于纳米间隙的代表性参数，包括纳米间隙的距离、纳米聚集体(2、3和4个AgNPs)中纳米颗粒的数量，以及纳米颗粒的特性(大小、形状、位置、朝向和表面化学)。这个模型表明，DO猝灭了SERS场，而除去DO则允许EM场以等离子体偶联的方式通过邻近的AgNPs和聚集体在整个样品中传播。

还对SERS信号通过液体样品(例如水溶液)的传播进行了电化学研究。DO去除显著增强了由激光照射那些悬浮AgNPs(即没有物理性附着到金电极表面的)诱导产生的光电流(见图5，上文详细描述)。如方法论部分所述，图5A示出了使用的实验装置示意图，其中，通过光照射AgNP溶液(而非电极)，在蜂窝状金电极上测量分别由Na

远距离检测和远距离盲测的结果与讨论

支持在液体样品(如水溶液)中长距离SERS场传播的额外的证据来自使用本发明的探针通过无氧SERS远距离检测分析物。

首先，当距离银镜(银镜位于一根充满除氧的AgNPs(AgNPs表面无涂层)溶液的NMR管的远端)10厘米处进行测量时，银镜吸附的分析物分子中与Ag表面接近和垂直的C-S键的拉伸谱带(1070–1080cm

为清楚起见，在图18中，使用与图8相同的测量参数记录光谱。然而，分析物被吸附在NMR管底部的银镜上，而不是在液体样品中分散。加入AgNPs溶液于NMR管，并加入Na

如前所述，为了制备导管末端的银镜面，首先由0.1M的AgNO

如图18所示，利用上述设置和参数，得到如下SERS光谱:

图18A：在距离银镜0和10厘米处测量吸附的对氨基苯硫酚。

图18B：在距离银镜10厘米处测量吸附的对硝基硫酚和空白。

图18C：距银镜不同距离测量吸附在银镜上的对氨基苯硫酚的光谱。

同样地，图18D示出了对氨基硫酚的C-S拉伸谱带信号强度与银镜距离的函数关系。

如图18所示，通过二氧化硅涂覆的AgNPs的传播效率较低。值得注意的是，在图18中，所有实验的空白显示没有超出噪声水平的显著信号。图中光谱图是三次单独测量光谱的平均值，D)中的误差棒(表示标准差)小于数据标记的大小。

其次，远距离SERS用于96孔板的高通量检测，在96孔板中分析物被预吸附在AgNPs中，然后去除DO并用亚硫酸钠凝聚(见图19，上文详细描述)。图19中使用的测量参数与图18中的相似，然而，在微量滴定板的孔中，分析物被预吸附在除氧并凝聚的AgNPs上。将预先充满除氧并凝聚的AgNPs的毛细熔点管浸入孔中。通过远离板孔6cm的毛细管远端测量SERS光谱。这些光谱呈现为对氨基苯硫酚(图19A)和对硝基硫酚(图19B)积分时间的函数。

为清楚起见，将除氧的崭新AgNP聚合体的水溶液充满6厘米玻璃毛细管，该毛细管垂直放置在每个孔中，以向上传输SERS信号，其中入射光垂直于毛细管照射(平行于微量滴定板)。这通过上文描述的盲测法来验证，其中20个孔随机充满分析物或空白，盲测结果获得100％准确度。应该提到的是，在图19中，所有实验的空白显示无(超出噪声水平的)显著信号。

最后，通过使用远端有一个银镜镀层的1m长的PEEK毛细管来验证远距离SERS技术(见图20，上文详细描述)。图20中使用的测量参数与图18中的相似。然而，银镜生长在1m长的PEEK毛细管的一端。另一端与一段NMR管相连(图20A)，并用溶剂冲洗系统。先进行空白测量，此时导管充满除氧并凝聚的AgNPs，银镜上没有吸附分析物。然后，将分析物吸附到银镜上，反复冲洗探针后，让导管充满除氧并凝聚的AgNPs，再进行SERS检测。图20A示出了上述探针设置的示意图，而图20B示出了使用对氨基苯硫酚作为分析物的SERS光谱，包括除氧和未除氧的，图20C示出了使用对硝基硫酚作为分析物的SERS光谱，其中样品用10mg亚硫酸钠除氧。为清楚起见，在图20B中，用10mg亚硫酸钠对标记为“Na

应该注意的是，在图20B和C中，在空白或没有除氧的样品中没有检测到分析物信号。

上述实验证明了液体样品(例如水溶液)中的表面等离子体场的长程传递，虽然信号传输的长度取决于等离子体纳米颗本身的性质，即，崭新的AgNPs可以传播SERS信号至少1m，而二氧化硅涂覆的AgNPs在～6厘米后减少。这与计算模拟的结果一致(图6)，使用二氧化硅涂覆的AgNPs而产生的强度较弱的SERS场和较差的传播能力导致其检测限LOD(50aM)比使用崭新的AgNPs(10zM)高10

对SERS的传统理解是基于单个纳米结构产生的信号放大或相邻的等离子体纳米颗粒(即纳米间隙)之间的等离子体场耦合。“热点(hot spot)”学说足以解释所有实验观察，其中SERS信号放大是基于局部表面等离子体共振原理，其为围绕单个或小簇的等离子体纳米颗粒的离散的EM场。然而，在目前的实验中已经证明，在DO去除后，远距离大规模的等离子体场耦合(或整合的表面等离子体共振)是可能的。这个整合的等离子体场使得单个分子的SERS信号能够有效的传输，即使该单个分子吸附在样品中任何一个等离子体纳米颗粒上。因此，每个等离子体纳米粒子都变得具有SERS活性，要么充当吸附分析物的“热点”，要么传输SERS信号，从而实现样品中真正的单分子检测。该实验结果也表明这种等离子体场在除氧水溶液中也可以长距离传输。崭新的无涂层的AgNP聚集体在无氧SERS中仍然是首选，使用它对等离子体场传输有优势(参见图7A-F，在上文更详细描述，其中可以观察到，对于崭新无氧化银涂覆和有氧化银涂覆的银纳米颗粒，电磁场传输分别在17nm和9.8nm处终止)。在SHINERS实验中，发现只有当添加亚硫酸钠并降低溶液的pH值使二氧化硅涂覆的AgNPs凝聚时，才能实现更高的SERS的灵敏度(50aM)，其中单独使用亚硫酸钠足以去除DO，但不能凝聚二氧化硅涂覆的AgNPs。

目前无氧(即除氧)的SERS测量的一个显著优点是检测时间不由分析物扩散进入检测器视场中的时间来决定(尤其考虑到分析物结合到不动的银镜或缓慢扩散的纳米颗粒聚集体的表面上)，而是通过等离子体场的传播速度来确定。在使用本发明的探针的1m远距离SERS检测中，分析物固定在PEEK管一端的银镜上，无法迁移，在导管的另一端开启激光光源照射检测室后立即获得SERS信号。这种超快响应除了具有高灵敏度外，还产生了高时间分辨率，可以监测快速化学事件，例如，研究化学反应或在单分子水平上检测存在时间很短的不稳定中间态物质(short-lived species)。这项技术也具有成本效益，只需要普通的拉曼光谱仪，而不需要昂贵的SERS检测器。这大大减少了进行SERS实验的开支，并将在全球(但特别是在发展中国家和资源有限的地区)促进单分子研究。相信前所未有的检测灵敏度，快速的响应时间，以及远距离检测能力可能在医学诊断、环境监测与国家安全中产生许多应用。

权利要求书的范围不应受示例中阐述的优选实施例的限制，而应给予与整个描述一致的最广泛的解释。

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