一种SESN2基因SNP标记检测藏鸡经济性状的方法及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种SESN2基因SNP标记检测藏鸡经济性状的方法及其应用。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指基因组DNA序列由于单个核苷酸的变化而引起的多态性，主要包括碱基的转换、颠换、插入和缺失等。SNP属于第三代分子标记，具有高密度、和易于检测等优点，已广泛应用于生物遗传多样性及分子遗传育种研究。

分子育种，分子标记辅助选择(molecularmark-assistselection，MAS)，是借助DNA分子标记对育种材料进行选择，进而实现对畜禽性状的品种改良。在畜禽育种中，如果选出与经济性状密切相关的DNA标记，则有望提高选种准确性，提高选育效率和效果。

SESN2(Hi95)是进化保守的应激诱导基因SESN家族的主要成员之一。SESN2参与动物代谢、衰老、肌肉和神经退行性病变、应对遗传毒性的压力、癌症发生等生物学过程；在对抗动物氧化应激反应、阻止肌肉萎缩和维持肌肉完整性中也具有重要作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种SESN2基因SNP标记检测藏鸡经济性状的方法及其应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种影响藏鸡性状的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于藏鸡SESN2基因对参考序列Genbank Accession No.NC_052554的第8644位点的碱基处，突变碱基为C或T。

优选的，所述SNP分子标记的基因型为CC、CT或TT中的任意一种。

相应的，所述SNP分子标记在检测藏鸡经济性状或藏鸡选育中的应用。

相应的，包含所述SNP分子标记的试剂盒或检测试纸或检测试剂。

优选的，所述试剂盒或检测试纸或检测试剂中至少包括用于扩增所述SNP分子标记的特异性引物对。

优选的，所述引物对包括：

上游引物如SEQ ID NO：1所示；下游引物：如SEQ ID NO：2所示。

相应的，所述试剂盒或检测试纸或检测试剂在检测藏鸡性状中的应用。

优选的，所述应用包括如下步骤：

(1)获取待检测藏鸡的血液；

(2)从血液中提取基因组DNA；

(3)将基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

(4)将PCR扩增产物进行酶切、电泳、分析，确定待测藏鸡的所述SNP分子标记的基因型。

优选的，所述PCR扩增的反应体系包括：2×Buffer、扩增所述SNP分子标记的特异性引物对、Taq DNA聚合酶、DNA模板。

优选的，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性3min；再进行36个如下循环：94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后，再72℃延伸5min。

本发明具有以下有益效果：本发明首次发现，藏鸡SESN2基因第8644位处，如果发生C-T突变，会直接关系到是否出现RsaI酶切位点；且CT基因型的个体，各方面的经济性状均有明显提升。因此，利用该突变位点可简单、快速、准确、高效地检测藏鸡的经济性状，并可直接应用到藏鸡选育中，以提升藏鸡的经济性能。

附图说明

图1为藏鸡三个品系样本的SESN2基因第8644位点测序峰图，框内为突变位点；

图2为藏鸡SESN2基因酶切电泳结果示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种藏鸡SESN2基因SNP标记检测经济性状的方法。所述SESN2基因的SNP与藏鸡的经济性状显著相关，该SNP所在位点具有CC、CT和TT三种基因型，不同基因型的藏鸡在体斜长、龙骨长、胸深、胫长、活体重、屠体重、半净膛重、全净膛重、胸肌重、腿肌重存在显著差异。本发明提供的检测方法主要依赖于第8644位C到T的颠换突变进行。PCR扩增藏鸡SESN2基因内含子区，该处如果没有发生对应突变，则没有RsaI酶切位点；当由C突变成T时，形成RsaI酶切位点，则可被RsaI酶切。从而可简单、快速、准确、高效地检测藏鸡个体的SNP，并应用到藏鸡的分子育种上。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例一：藏鸡SESN2基因部分DNA序列的克隆和SNP筛查

1、本发明以藏鸡三个品系的种群作为检测对象，样本采集情况如表1所示。每个样本单独进行检测，例如阿藏1系的60个样本，每个样品都单独检测。

表1样本采集情况对照表

2、参考文献Sambrock et al(2002)方法提取藏鸡血液样本基因组DNA。以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的鸡SESN2基因序列(Genbank AccessionNo.NC_052554)为参考序列，利用Primer 5.0设计PCR引物对P，引物序列具体如下：

上游引物：5'-CGTGACCTCCACCCACTGAT-3'(SEQ ID NO：1)；

下游引物：5'-CTATACCGAAACCGTGCCCCC-3'(SEQ ID NO：2)。

所述引物序列扩增了藏鸡SESN2基因第1内含子区域。

再进行PCR扩增。采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，计算得出各种反应组分的总量，加入1.5mL离心管中，充分混匀后离心，再分装到每个PCR管中，然后加入模板DNA，再离心后进行PCR扩增，PCR反应体系如表2所示。所述DNA模板为表1中各藏鸡个体样品的基因组DNA。

表2PCR反应体系

PCR反应程序为：95℃预变性3min。进行36个如下循环：94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s。循环结束后，再72℃延伸5min。

将获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行切胶回收和测序。把上述藏鸡三个品系样本PCR扩增产物混合后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。对测序峰图进行分析发现如图1中的CT双峰，从而筛查到藏鸡SESN2基因的1个SNP位点，位于藏鸡SESN2基因对参考序列(Genbank Accession No.NC_052554)的第8644位。

实施例二：藏鸡SESN2基因多态性的PCR-RFLP检测

1、PCR反应。PCR产物扩增体系和反应条件参照实施例一进行，PCR扩增产物的1.5％琼脂糖凝胶电泳图谱(图2)可以清晰看到491bp的条带。图2中，泳道2、4和5为CC基因型，表现为137bp和354bp，泳道1为CT基因型，表现为137bp、354bp和491bp；泳道3为TT基因型，表现为491bp；泳道6为MarkerⅠ，表现为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp和600bp。

2、PCR-RFLP检测。将步骤1获得的PCR扩增产物利用限制性内切酶RsaI在37℃水浴中酶切1～2小时，然后进行2.5％琼脂糖凝胶电泳。电泳条件为：点样后120V电压电泳30min，待不同大小的DNA片段清晰分离后，在Bio-RAD凝胶成像分析系统拍照分析，并记录每个样本的基因型。

结果如图2所示，根据条带的带型能够将三种基因型(CC、CT、TT)明显区分，CC基因型为137bp和354bp两条条带，CT基因型为137bp、354bp和491bp三条条带，TT基因型为491bp一条条带。

实施例三：藏鸡SESN2基因SNP位点效应的关联分析

1、群体中多态性检测。参照实施例一的SNP检测方法对表1中180只藏鸡分别判定基因型。

随后进行SNP位点的频率统计分析。基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率：P

表3藏鸡群体中SESN2基因多态位点的基因型和等位基因频率

2、基因效应的关联分析。对藏鸡各品系不同基因型的个体与其经济性状的相关性进行了显著性检验。测定的经济性状主要包括：体斜长、龙骨长、胸深、活体重、屠体重、半净膛重、全净膛重、胸肌重、腿肌重等性状。关联分析的一般线性模型：SPSS 26.0软件中的一般线性模型GLM(General linear models procedure)对各基因型对经济性状的影响进行显著性检验。统计模型为：Y

表4藏鸡SESN2基因第8644位SNP与其经济性状的关联分析

从表4中可以看出：藏鸡SESN2基因第8644位的SNP位点与其经济性状显著相关，3种基因型在体斜长、胸深、活体重、屠体重、半净膛重、全净膛重、胸肌重、腿肌重上存在显著差异。并且在三个品系中，CT基因型对藏鸡的体斜长、龙骨长、胸深、胫长、活体重、屠体重、半净膛重、全净膛重、胸肌重、腿肌重具有显著地提高，说明第8644位的SNP突变可以作为一个提高藏鸡经济性状的候选分子标记。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 西南民族大学

阿坝藏族羌族自治州畜牧科学技术研究所

<120> 一种SESN2基因SNP标记检测藏鸡经济性状的方法及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 上游引物(SESN2)

<400> 1

cgtgacctcc acccactgat 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 下游引物(SESN2)

<400> 2

ctataccgaa accgtgcccc c 21