一种色氨酸微生态制剂的制备质检方法以及该微生态制剂的应用

技术领域

本发明属于畜牧业饲料添加剂技术领域，涉及一种色氨酸微生态制剂的制备方法，以及该微生态制剂用于肉羊生产性能和肉品质提升的应用。

背景技术

反刍动物的瘤胃内栖居大量的微生物，包括细菌、真菌和原虫，这些微生物可以利用瘤胃发酵生成的挥发性脂肪酸作为碳架，同时利用瘤胃发酵所释放出的能量，将饲料蛋白质降解所产生的寡肽、氨基酸和氨，连同内源性分泌的氨一起合成微生物蛋白。

色氨酸是宿主微生物串扰中的关键氨基酸。瘤胃内的色氨酸一部分被瘤胃微生物利用合成微生物蛋白，还有一部分在脱氨基酶的作用下转化为氨，氨又被微生物利用合成微生物蛋白质或通过瘤胃壁被吸收。色氨酸在动物采食调控、免疫调节、泌乳、抗氧化和抗应激等方面发挥着重要的调节作用，色氨酸的缺乏会损害肠道免疫力并改变肠道微生物群落，因此色氨酸代谢对消化道道菌群有重要的调节作用。动物消化道菌群对色氨酸代谢产生重要影响，表明消化道菌群与色氨酸代谢之间的相互作用会影响宿主的全身稳态。

微生态制剂是利用正常微生物或促进微生物生长的物质制得的，可以促进正常微生物群生长繁殖以及抑制有害菌生长繁殖。微生态制剂通常分为单一菌制剂和复合菌制剂。单一菌制剂只由某一种微生物构成，如乳酸菌制剂、酵母菌制剂、芽抱杆菌制剂和光合细菌制剂等。复合菌制剂是由两种或两种以上的微生物构成的制剂，如芽抱杆菌与乳酸菌复合菌制剂等。目前微生态制剂生产中存在的问题主要是产品质量不稳定，活菌含量低，水分含量高，不耐抗生素，对胃酸和高浓度的胆盐不稳定等，很大程度上限制了微生态制剂作用的发挥。另外在微生态制剂的使用过程中，还受到多种因素的影响，如养殖场饲养管理条件的好坏，微生态制剂使用的时机、饲喂方式以及保存方法等等。因此有必要结合动物理想蛋白质氨基酸营养模式研制新的微生态制剂，以进一步平衡日粮氨基酸、提高畜禽生产性能和饲料利用率，降低养殖成本，增强动物免疫力，降低死亡率，减少粪便对畜禽的污染，改善养殖生态环境。色氨酸微生态制剂是未来饲料添加剂的研究方向之一，目前的色氨酸制剂仅以复合L-色氨酸为主，使用功能较为单一。

发明内容

本发明目的是为了丰富色氨酸微生态制剂的使用功能，提出一种色氨酸微生态制剂的制备质检方法以及该微生态制剂的应用，将有益菌种与色氨酸结合形成微生态制剂，并将该制剂充分应用到反刍动物饲料中，调节瘤胃微生物菌群结构，提高反刍动物生产性能，有利于增加其副产品的价值。

本发明的技术方案：一种色氨酸微生态制剂的制备质检方法，其特征在于，所述方法如下：

(1)菌种筛选、保存和鉴定

从瘤胃液中培养后挑选菌落进行生化鉴定和革兰氏染色鉴定后，再进行重复分析培养，分离得到纯菌株进行菌株系统性鉴定；

(2)菌种分离、培养、纯化与保藏；

将步骤(1)所筛选出的菌种进行分离培养得到纯菌株，并进行纯菌株的形态及生理生化鉴定，将菌株保存并培养，在固定时间内收集菌液进行指标的测定；

(3)菌种微生态制剂的制备

将筛选出的特定菌种大量培养后制作微生态制剂，具体包埋方法为：将聚乙烯醇和卡拉胶加入水中，并加热搅拌溶解后，再加入埃洛石和生物炭，搅拌混合均匀，得到混合液，再与菌液进行搅拌混合，在进行固定从而固定化微生物，并获得完整的包埋技术规程与产品，进行微生态制剂性质鉴定，在瘤胃液中模拟定植等特性；

(4)微生态制剂的质量检测

(4-1)活菌数

无菌操作称取试样，加入灭菌生理盐水，按时长均质，按比例制成初始悬浮液；将初始悬浮液与灭菌生理盐水，经充分混匀后制成1:100的稀释液；根据样品含菌量，做进一步的十倍系列递增稀释；选择2～3个适宜的稀释度，水浴维持10min，用无菌移液管分别吸取后接种到两个营养琼脂平板上；使用涂布棒涂布接种液于琼脂表面；涂布好的平皿盖好，置室温中放置使接种物完全被琼脂吸收；翻转上述平皿置培养箱中培养；培养后，选取菌落数在30～300个之间的平板计数；若平板中有较大片状菌落生长时，则不宜采用；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数，从中选出5个特征菌落进行确证试验；

(4-2)流动性

通过测试散状物料堆积角的大小来反应此微生态制剂的流动性能，设置同一形状的颗粒，在相同的粒径分布下，改变物料的含水率，测出散状物料颗粒的速度变化，对比散状物料在不同含水率情况下的速度变化，从而得到含水率的大小影响散状物料流动性能的规律；

(4-3)容重

色氨酸微生态制剂在电机的振动下流入电子秤中央的烧杯中，将电子秤去皮测量出烧杯中制剂的重量，重量与体积比值即为容重。

步骤(2)中所述纯菌株的形态及生理生化鉴定包括菌株形态鉴定、革兰氏染色鉴定、吲哚试验、脲酶试验和DNA鉴定。

步骤(4-1)中所述灭菌生理盐水的浓度为0.85％。

步骤(4-1)中所述均质时长为1～2min，试样与灭菌生理盐水的比例为1:10。

步骤(4-1)中所述水浴温度为80℃±1℃。

步骤(4-1)中所述培养箱培养温度为37℃±1℃，培养时间为48h±2h。

一种色氨酸微生态制剂的应用，其特征在于：所述应用如下：

(1)活菌中药发酵制剂中芽孢杆菌、酵母菌能够消耗大量的氧气，为乳酸菌的繁殖创造条件，为瘤胃微生物的发酵提供厌氧的环境，同时微生态制剂代谢产生大量的维生素、氨基酸、核苷酸等，能够促进纤维素分解菌和乳酸菌的生长，能够稳定瘤胃pH值，提高纤维素的消化利用率和蛋白、脂肪的合成，从而提高动物的生产性能；

(2)过瘤胃的乳酸菌在到达肠道后能够直接补充肠道有益菌，维护肠道健康，提高肠道消化吸收功能，从而提高饲料的消化吸收率；

(3)代谢产生大量的维生素、氨基酸和核苷酸等营养物质，并且能够调节消化道菌群平衡，促进机体对营养物质的消化吸收，从而提高肉质品质。

本发明的有益效果为：本发明提出的一种色氨酸微生态制剂的制备质检方法以及该微生态制剂的应用，制备质检方法包括菌种筛选、保存和鉴定；菌种分离、培养、纯化与保藏；菌种微生态制剂的制备以及微生态制剂的质量检测。通过在饲料中添加色氨酸微生态制剂，从而可维持反刍动物瘤胃内微生物稳态；活菌中药发酵制剂中芽孢杆菌、酵母菌能够消耗大量的氧气，为乳酸菌的繁殖创造条件，为瘤胃微生物的发酵提供厌氧的环境，同时微生态制剂代谢产生大量的维生素、氨基酸、核苷酸等，能够促进纤维素分解菌和乳酸菌的生长，能够稳定瘤胃pH值，提高纤维素的消化利用率和蛋白、脂肪的合成，过瘤胃的乳酸菌在到达肠道后能够直接补充肠道有益菌，提高肠道了消化吸收功能，从而提高饲料的消化吸收率。从而提高了肉质品质，改善了反刍动物副产品价值，获得了更高的生产效益。

附图说明

图1为本发明中制备流程图。

图2为本发明效果对照图。

具体实施方式

下面结合附表和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解这些实施方式仅用于说明本发明专利而不用于限制本发明专利的范围，在阅读了本发明专利之后，本领域技术人员对本发明专利的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1

一种色氨酸微生态制剂的制备质检方法，方法如下：

(1)菌种筛选、保存和鉴定

从瘤胃液中培养后挑选菌落进行生化鉴定和革兰氏染色鉴定后，再进行重复分析培养，最终分离得到纯菌株进行菌株系统性鉴定。

(2)菌种分离、培养、纯化与保藏

将所筛选出的菌种进行分离培养得到纯菌株，并进行纯菌株的形态及生理生化鉴定(菌株形态鉴定、革兰氏染色鉴定、吲哚试验、脲酶试验以及DNA鉴定)，之后将菌株保存并培养，在固定时间内收集菌液进行指标的测定。

(3)菌种微生态制剂的制备

将筛选出的特定菌种大量培养后制作微生态制剂，具体包埋方法为：将聚乙烯醇和卡拉胶加入水中，并加热搅拌溶解后，再加入埃洛石和生物炭，搅拌混合均匀，得到混合液，再与菌液进行搅拌混合，在进行固定从而固定化微生物，并获得完整的包埋技术规程与产品，进行微生态制剂性质鉴定，在瘤胃液中模拟定植等特性。

(4)微生态制剂的质量检测

(4-1)活菌数

以无菌操作称取试样25g，加入225mL0.85％灭菌生理盐水，均质1min，制成1∶10的初始悬浮液。吸取1∶10的初始悬浮液1mL，加入9mL 0.85％灭菌生理盐水，经充分混匀后制成1:100的稀释液。根据样品含菌量，做进一步的十倍系列递增稀释。选择2个适宜的稀释度，水浴80℃维持10min，用无菌移液管分别吸取0.1mL，接种到两个营养琼脂平板上。使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面，涂布棒不得接触平皿边缘。每个平皿用一支无菌涂布棒。涂布好的平皿盖好，置室温中放置15min使接种物完全被琼脂吸收。翻转上述平皿置37℃培养箱中培养50h。培养后，选取菌落数在30～300个之间的平板计数。若平板中有较大片状菌落生长时，则不宜采用；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数。然后从中选出5个特征菌落进行确证试验。

(4-2)流动性

通过测试散状物料堆积角的大小来反应此微生态制剂的流动性能。设置同一形状的颗粒，在相同的粒径分布下，改变物料的含水率，测出散状物料颗粒的速度变化，对比散状物料在不同含水率情况下的速度变化，从而得到含水率的大小影响散状物料流动性能的规律。

(4-3)容重

色氨酸微生态制剂在电机的振动下流入电子秤中央的烧杯中，烧杯容积为695ml，将电子秤去皮测量出烧杯中制剂的重量，重量与体积比值即为容重。

实施例2

与上述实施例1不同的是，一种色氨酸微生态制剂的制备质检方法，以无菌操作称取试样30g，加入270mL 0.85％灭菌生理盐水，均质2min，制成1∶10的初始悬浮液。吸取1∶10的初始悬浮液1.5mL，加入13.5mL 0.85％灭菌生理盐水，经充分混匀后制成1:100的稀释液。根据样品含菌量，做进一步的十倍系列递增稀释。选择3个适宜的稀释度，水浴81℃维持10min，用无菌移液管分别吸取0.1mL，接种到两个营养琼脂平板上。使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面，涂布棒不得接触平皿边缘。每个平皿用一支无菌涂布棒。涂布好的平皿盖好，置室温中放置15min使接种物完全被琼脂吸收。翻转上述平皿置38℃培养箱中培养48h。培养后，选取菌落数在30～300个之间的平板计数。若平板中有较大片状菌落生长时，则不宜采用；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数。然后从中选出5个特征菌落进行确证试验。

一种色氨酸微生态制剂的应用，应用如下：

色氨酸制剂对肉羊生产性能和肉品质的影响：饲料经过瘤胃微生物的充分发酵后，大约有70％～85％的干物和50％的粗纤维在瘤胃内被消化。活菌中药发酵制剂中芽孢杆菌、酵母菌能够消耗大量的氧气，为乳酸菌的繁殖创造条件，为瘤胃微生物的发酵提供厌氧的环境，同时微生态制剂代谢产生大量的维生素、氨基酸、核苷酸等，能够促进纤维素分解菌和乳酸菌的生长，能够稳定瘤胃pH值，提高纤维素的消化利用率和蛋白、脂肪的合成，从而提高动物的生产性能。过瘤胃的乳酸菌在到达肠道后能够直接补充肠道有益菌，维护肠道健康，提高肠道消化吸收功能，从而提高饲料的消化吸收率。

表1色氨酸制剂对肉羊生产性能的影响

通过表1数据可知添加色氨酸制剂对育肥羊增重效果显著，显著提高肉羊日采食量和日增重，显著降低料肉比，因此添加色氨酸制剂能提高肉羊生产性能。

表2色氨酸制剂对肉羊肉品质的影响

通过表2数据可知色氨酸制剂组的肉色、大理石纹、熟肉率均显著的优于对照组，失水率显著低于对照组，微生态制剂组肉色鲜嫩、保水性好、肉质好。本色氨酸制剂能够代谢产生大量的维生素、氨基酸和核苷酸等营养物质，并且能够调节消化道菌群平衡，促进机体对营养物质的消化吸收，从而提高肉质品质。