一种与番木瓜果实宽度性状相关的SNP分子标记及其扩增引物、检测试剂盒和应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种与番木瓜果实宽度性状相关的SNP分子标记及其扩增引物、检测试剂盒和应用。

背景技术

番木瓜是一种热带常绿果树，为番木瓜科番木瓜属多年生肉质草本植物，又名乳瓜、石瓜、万寿果、番瓜、木冬瓜、木瓜、莲生果。其原产于墨西哥和中美洲，广泛栽培与全世界的热带和亚热带地区，自17世纪传入我国，主产于广东、海南、广西、云南、台湾、福建、四川西昌和江西赣州也有种植。番木瓜鲜果外形美观、皮薄肉厚、汁多味甜、气味香甜、营养丰富。成熟番木瓜果肉呈黄色或红色，胡罗卜素、番茄红素含量丰富，具有卓越的保健效果和重要的食用价值和工业价值。发展番木瓜生产将极大刺激食品加工、医药卫生、美容保健和养殖业等相关产业的发展，具有重要的意义。

水果果实的形状是影响其产量的重要因素，另外，果实的宽度是影响果实单果重乃至水果总产量的重要因素，因此，育种人员往往追求选育获得番木瓜果实宽度较大的品种。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。相比早期RAPD、AFLP、SSR等分子标记，SNP分子标记具有在个体基因组上分布广泛、数量较多，易于基因分型（SNP的二态性）、适于快速、规模化筛查等优势。然而目前，还未有关于与番木瓜果实宽度性状相关的分子标记的报道，这无疑不利于番木瓜优良品种的选育。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种与番木瓜果实宽度性状极显著相关的SNP分子标记，可用于检测或预测番木瓜果实宽度，为选育番木瓜优良高产品种提供了基础。

本发明提供了一种与番木瓜果实宽度性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记为在核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示序列的基础上第197位存在A/G多态性位点。

本发明提供了一种基于所述SNP分子标记检测番木瓜果实宽度的引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反向引物。

本发明提供了一种检测番木瓜果实宽度的试剂盒，包括所述引物和检测试剂。

优选的，所述检测试剂包括扩增缓冲液和标准品;

所述标准品为核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA分子。

本发明提供了所述SNP分子标记、所述引物或所述试剂盒在检测或预测番木瓜果实宽度或番木瓜育种中的应用。

优选的，所述番木瓜果实的基因型为GG型，表明番木瓜果实具有较宽的性状；

选择基因型为GG型的番木瓜材料作为后续育种材料。

本发明提供了一种基于所述SNP分子标记、所述引物或所述试剂盒在辅助选育宽果形番木瓜品种的方法，包括以下步骤：

1）提取待选育材料的基因组DNA；

2）以步骤1）中获得的基因组DNA为模板，以所述引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

3）将步骤2）中所述PCR扩增产物进行测序，确定测序序列的第197位碱基的基因型，当基因型为GG时，说明待选育材料的番木瓜果实具有宽果形的性状，作为育种材料用于后续杂交育种。

优选的，步骤2）中所述PCR扩增的反应体系：

2× Rapid Taq Master Mix 12.5μl

10μM 正向引物 1μl

10μM 反向引物 1μl

DNA模板 1μl

ddH

优选的，步骤2）中所述PCR扩增的反应程序为95℃ 5min；95℃ 30s、54℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 5min。

优选的，步骤2）中所述PCR扩增产物经纯化后，收集497bp长度的扩增片段进行测序。

本发明提供的与番木瓜果实宽度相关的SNP分子标记，SNP分子标记位于SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列上，自该序列5'端起第197位碱基为SNP位点；该SNP位点为Chr03染色体第26693188碱基处。基于GWAS分析方法筛选获得所述SNP分子标记与番木瓜果实宽度相关的Cpa03g017160基因极显著相关（P< 0.01），具有A/G多态性，并且经过实验验证，G等位基因与番木瓜果实宽度极显著相关。

本发明提供的基于所述SNP分子标记辅助选育宽果形番木瓜品种的方法，以含有所述SNP分子标记的核苷酸序列为模板，设计引物对，以番木瓜基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得497bp长度的扩增产物，通过测序，得到待选育材料的基因型为GG时，说明该材料具有宽果形性状。本发明提供的方法有助于快速检测高果实宽度番木瓜育种材料，辅助杂交育种，缩短新品种培育周期，且检测成本较低、不受环境限制、检测结果准确性高、易重复。

附图说明

图1为本发明中与番木瓜果实宽度极显著相关的SNP标记的曼哈顿图；

图2为本发明中与番木瓜果实宽度极显著相关的SNP标记所在Chr03染色体局部区间的曼哈顿图和连锁不平衡单倍型块图，其中区间内的加深标记为本发明筛选的分子标记；

图3为本发明中与番木瓜果实宽度极显著相关的SNP标记不同基因型间的果实宽度差异比较，G等位基因与高果实宽度显著相关。

具体实施方式

本发明提供了一种与番木瓜果实宽度性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记为在核苷酸序列如SEQ ID NO:1（TGCTACTTCAG

AAACATTAGAAAAAGAAGATCATACACATTAGAGGAGAATTTGTTTCTCTTTTTTGACAGTTTATATTTTCGGTTTGTTCTTTTGTTTTTTTTTACTTCATTTTGCTCTCACAATTACTATCAGATACTGGAATGTCGACTTGTGGGAAAATCTCTTCACAAAGCTGCTTAACAGTAGCCATGGAR（A/G）ATGATGACACAAAATTGCTGCGGAGTTTGAG

GGAGTCCTTTCAGTGGTACATCCATGATAACCCTGAGCTCTTAAAGAAACTAAAGCAATTATTGGCAAAGCAAAGGGCGTCTTTGTGTTCTTCTTAGTGTATATTATATCATTTCTTCAGAATCCACCCTAAAAGTGAATATAAATAATTTTAGGAAGTAAATATTTTTTTTTTGAAATCAGTCTGTTGTCCAAAAGGAACTTTGTGCGCACTAGTCATTCTGGCAATGTATTTACTTAATGTCTCCTTAGATAAAGAAAGATGTCTCC）所示序列的基础上第197位存在A/G多态性位点。

本发明提供了一种基于所述SNP分子标记检测番木瓜果实宽度的引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO：2（TGCTACTTCAGAAACAT

TAG）所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3（GGAGACATC

TTTCTTTATCTA）所示的反向引物。本发明对所述引物的来源没有特殊限制采用本领域所熟知的引物来源即可。在本发明实施例中，所述引物委托北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

本发明提供了一种检测番木瓜果实宽度的试剂盒，包括所述引物和检测试剂。

在本发明中，所述检测试剂优选包括扩增缓冲液和标准品。所述扩增缓冲液优选为PCR扩增MIX液。本发明对所述扩增缓冲液的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的扩增缓冲液即可。在本发明实施例中，所述扩增缓冲液购自诺唯赞生物科技股份有限公司。所述标准品为核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA分子。所述标准品作为Marker用于指示目标扩增条带。

基于所述SNP分子标记与番木瓜果实宽度极显著相关，因此，本发明提供了所述SNP分子标记、所述引物或所述试剂盒在检测或预测番木瓜果实宽度或番木瓜育种中的应用。所述番木瓜果实的基因型为GG型，表明番木瓜果实具有较宽的性状。选择基因型为GG型的番木瓜材料作为后续育种材料。

本发明提供了一种基于所述SNP分子标记、所述引物或所述试剂盒在辅助选育宽果形番木瓜品种的方法，包括以下步骤：

1）提取待选育材料的基因组DNA；

2）以步骤1）中获得的基因组DNA为模板，以所述引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

3）将步骤2）中所述PCR扩增产物进行测序，确定测序序列的第197位碱基的基因型，当基因型为GG时，说明待选育材料的番木瓜果实具有宽果形的性状，作为育种材料用于后续杂交育种。

本发明提取待选育材料的基因组DNA。

本发明在SNP分子标记筛选时是以从墨西哥、南非、中国广西、中国海南等地收集到的340份番木瓜为研究材料，经过GWAS分析筛选获得。可见本发明是以世界上存在的众多的番木瓜品种为基础筛选获得的SNP分子标记。因此，本发明提供的方法适用于所有番木瓜品种。

本发明对提取待选育材料的基因组DNA没有特殊限制，采用本领域所熟知的提取植物DNA的方法即可，例如试剂盒法或CTAB法。在本发明实施例中，采用试剂盒法提取待选育材料的基因组DNA。所述试剂盒为天根植物基因组DNA提取试剂盒，购自天根公司。提取基因组DNA后，利用超微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳分别检测DNA的含量以及完整性。经过验证表明，电泳条带清晰、胶孔内无明显蛋白质残留，OD

检测合格后，本发明以所述基因组DNA为模板，以所述引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

在本发明中，所述PCR扩增的反应体系为：

2× Rapid Taq Master Mix 12.5μl

10μM 正向引物 1μl

10μM 反向引物 1μl

DNA模板 1μl

ddH

所述PCR扩增的反应程序为95℃ 5min；95℃ 30s、54℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃5min。本发明对所述PCR扩增所用仪器没有特殊限制，采用本领域所熟知的PCR仪即可。PCR扩增结束后，优选将获得的PCR扩增产物经纯化后，收集497bp长度的扩增片段进行测序。

获得纯化后的PCR扩增产物后，本发明将所述PCR扩增产物进行测序，确定测序序列的第197位碱基的基因型，当基因型为GG时，说明待选育材料的番木瓜果实具有宽果形的性状，作为育种材料用于后续杂交育种。

在本发明中，所述测序委托华大基因公司完成。所述测序优选为双向测序。得到测序结果后经过拼接获得扩增产物的序列。当序列的197位碱基仅为G时，说明待选育材料为GG基因型，GG基因型表示与较宽的番木瓜果实性状连锁。当待选育材料为AA基因型时，AA基因型表示与较窄的番木瓜果实性状连锁。其中所述较窄的番木瓜果实的宽度优选为67.7~75.6mm。

本发明提供了一种与番木瓜果实宽度相关的SNP分子标记Cpa03g017160:6929，有助于快速检测高果实宽度番木瓜育种材料，辅助杂交育种。

下面结合实施例对本发明提供的一种与番木瓜果实宽度性状相关的SNP分子标记及其扩增引物、检测试剂盒和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

番木瓜全基因组SNP标记开发

对从墨西哥、南非、中国广西、中国海南等地收集到的340份番木瓜，播种于中国热带农业科学院文昌基地，土壤肥力中等、无病虫害，多年多点种植并收集表型性状数据，表型性状数据经Excel2016整理后用于后续分析。

从番木瓜植株上取新鲜幼嫩叶片1~2g，液氮研磨后按照选用天根植物基因组DNA提取试剂盒（DP305）提取番木瓜材料DNA。利用超微量分光光度计及1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品质量和浓度，选择电泳条带清晰、胶孔内无明显蛋白质残留，OD

采用超声波破碎（或酶切）的方法，将DNA随机打断成300bp左右的片段，DNA片段经末端修复、3'端加A、加测序接头偶、纯化、PCR扩增完成测序文库的构建。文库经质检合格后通过illumina 平台进行测序。测序数据下机后需要按一定的标准对原始数据（Raw reads）进行质控，过滤标准如下：（1）去除带接头（adapter）的序列，（2）去除单端序列含氮量>10%的一对序列，（3）去除低质量碱基数超过50%的一对序列。去除低质量序列、接头序列、不准确序列后的Clean reads进行下一步序列比对。参考基因组选择本课题组最新组装的番木瓜果用材料“kamiya”基因组，使用BWA-mem软件将Clean reads与参考基因组序列比对，使用samtools软件对比对结果排序，GATK4.0软件去除PCR重复序列后进行变异检测，以QD >2.0，QUAL> 30.0，FS < 60.0，MQ > 40.0的硬标准过滤变异合集，保留具有统计学意义的变异位点数据集。按MAF(次等位基因频率)>= 0.05，miss(缺失率)<=0.2为标准再次过滤变异位点，获得高质量的变异位点合集。

GWAS分析番木瓜果实宽度相关SNP位点

利用基因组DNA区间特征描述文件对变异位点进行注释，分别统计落于基因编码区、非编码区、基因间区、非同义突变等变异位点的数量。通过群体结构分析获得群体亲缘关系矩阵后，结合表型性状数据进行全基因组关联分析，如图1和图2所示在Chr03染色体检测到与番木瓜果实宽度显著相关（-log10（

筛选候选标记

基于GWAS分析中关联到的区域内的SNP标记，比较等位基因频率、性状差异、基因表达量差异，结果见表1。在Cpa03g017160基因CDs区域筛选到与番木瓜果实宽度显著相关的SNP位点（Cpa03g017160:6929（A/G））。

表1 群体中分子标记不同基因型个体数和果实宽度平均值（mm）

实施例2

以包含实施例1筛选获得的番木瓜果实宽度显著相关的SNP位点（Cpa03g017160:6929（A/G））的序列为模板，利用Primer 5.0软件设计一对引物，引物序列如下：

正向引物：TGCTACTTCA GAAACATTAG（SEQ ID NO：2）；

反向引物：GGAGACATCTTTCTTTATCTA（SEQ ID NO:3）。

利用上述引物对对待筛选的材料的基因组DNA进行普通PCR扩增，扩增体系如下：2× Rapid Taq Master Mix 12.5μl、10μM 正向引物 1μl、10μM 反向引物 1μl、DNA模板 1μl、ddH

实施例3

为验证本发明中所述SNP标记实用性，从中国热带农业科学院生物技术所文昌基地番木瓜种植区随机挑选50株番木瓜（不包括用于SNP标记开发的340份番木瓜），经测序后基因分型和番木瓜果实宽度性状调查。

表2 50株番木瓜在Cpa03g017160:6929不同基因型和果实宽度

表3 50株番木瓜在Cpa03g017160:6929不同基因型和果实宽度统计

由表3可知，Cpa03g017160:6929位点G等位基因与番木瓜果实宽度极显著相关。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国热带农业科学院三亚研究院

<120> 一种与番木瓜果实宽度性状相关的SNP分子标记及其扩增引物、检测试剂盒和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 497

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgctacttca gaaacattag aaaaagaaga tcatacacat tagaggagaa tttgtttctc 60

ttttttgaca gtttatattt tcggtttgtt cttttgtttt tttttacttc attttgctct 120

cacaattact atcagatact ggaatgtcga cttgtgggaa aatctcttca caaagctgct 180

taacagtagc catggaratg atgacacaaa attgctgcgg agtttgaggg agtcctttca 240

gtggtacatc catgataacc ctgagctctt aaagaaacta aagcaattat tggcaaagca 300

aagggcgtct ttgtgttctt cttagtgtat attatatcat ttcttcagaa tccaccctaa 360

aagtgaatat aaataatttt aggaagtaaa tatttttttt ttgaaatcag tctgttgtcc 420

aaaaggaact ttgtgcgcac tagtcattct ggcaatgtat ttacttaatg tctccttaga 480

taaagaaaga tgtctcc 497

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgctacttca gaaacattag 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggagacatct ttctttatct a 21