一种滇鸡血藤的组培育苗方法

技术领域

本发明属于中药材及组织培养领域，特别涉及滇鸡血藤的组培育苗方法。

背景技术

《中国药典》2020版收录的滇鸡血藤植物源为木兰科南五味子属南五味子（Kadsura interior A.C.Smith），以干燥藤茎入药，生长于海拔1000米以下的山坡、林中，主要分布于云南、江苏、安徽、浙江、江西、福建、湖北、湖南、广东、广西、四川。滇鸡血藤主要有活血补血，调经止痛，舒筋通络的功效，主要用于月经不调，痛经，麻木瘫痪，风湿痹痛，气血虚弱等症。滇鸡血藤内含木质素类化合物以及萜类化合物，其中以异型南五味子丁素为代表的联苯环辛烯型类木脂素是其最具标志性成分，而异型南五味子丁素含量亦是滇鸡血藤药材质量检测的最核心指标。现代医药研究表明，滇鸡血藤具有抗氧化作用、抗衰老作用、抑菌作用、镇静安眠作用、保肝作用、抗癌作用以及抗病毒作用等。

近年来，由于野生资源蕴藏量的减少以及政府对野生环境的保护力度加大，在云南临沧部分地区开始进行滇鸡血藤的人工引种驯化栽培，其主要方式是采用采挖野生的植株人工驯化栽培后，通过种子及扦插繁殖获得种苗，但由于滇鸡血藤为雌雄异株，野生居群雌株极少，使得居群结实率极低，同时其种子亦存在发芽率低的情况，而扦插繁殖繁殖周期长、繁殖率低等缺点。

值得注意的是，滇鸡血藤药材和鸡血藤药材字面上部分人会认为是相同或者相近物种，但其实，鸡血藤的植物源为豆科植物密花豆属植物密花豆Spatholobus suberectusDunn ，与本发明所述的滇鸡血藤不为同科，更不为同属植物，组培时可能对各植物生长调节剂以及培养成分的敏感程度大相径庭。

针对现有技术的不足，本团队通过利用现代生物组培技术，特发明了一种滇鸡血藤的组培育苗方法。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种滇鸡血藤的组培育苗方法，以解决滇鸡血藤种质资源紧缺的问题。

为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：

一种滇鸡血藤的组培育苗方法，选取滇鸡血藤幼嫩枝条为外植体，消毒后接种至初代丛生芽诱导培养基中诱导出丛生芽，后转接至继代增殖培养基中获得更多的丛生芽，丛生芽最后接种于生根培养基中形成生根苗。

外植体的消毒方法为75%酒精消毒15~20s，饱和漂白粉溶液消毒10~15min，0.1%升汞溶液消毒3~4min，0.05%升汞溶液消毒10~11min。

初代丛生芽诱导培养基为WPM+NAA 0.02~0.05mg/L+6-BA 2.0~3.0mg/L+PVP（聚乙烯吡咯烷酮）0.6~0.8g/L+活性炭1.0g/L。

丛生芽继代增殖培养基为改良WPM+NAA 0.1~0.2mg/L+IAA 0.02~0.05mg/L+TDZ2.0~2.5mg/L+BR 0.1~0.2mg/L+活性炭0.4g/L。

丛生芽生根培养基为1/2WPM+NAA 0.5~0.6mg/L+IBA 1.0~1.5mg/L+椰汁 50~70ml/L+活性炭0.7g/L。

所述的改良WPM培养基为在原WPM培养基的基础上，将硝酸铵改为800mg/L，磷酸二氢钾改为210mg/L，硫酸镁改为370mg/L，硫酸钾改为800mg/L，四水氯化钙改为400mg/L，其余元素不变。

本发明的有益效果在于：

1、本发明是利用组培技术进行滇鸡血藤种苗的生产，属于现代生物技术，是在人工可控环境下进行的工厂育苗，不受气候、季节的限制，可在短期内大量提供相关品质稳定的种苗。

2、滇鸡血藤药材以异型南五味子丁素含量为其检测的核心指标，且其含量愈高，价格亦愈高，而滇鸡血藤各产区其含量参差不齐，即使同一产区甚至同一居群，其含量亦存在较大差异。本发明是利用滇鸡血藤茎段为外植体进行组培快繁，属于无性繁殖范畴，其能最大程度的保证母本性状的稳定遗传，可以异型南五味子丁素含量高的优质种质为母本，生产出遗传性状稳定的优质种苗。

3、本发明在消毒时采用了75%酒精、饱和漂白粉溶液与高浓度升汞溶液短时消毒和低浓度升汞溶液长时消毒的消毒方法，能最大程度的降低消毒污染率和消毒死亡率，是目前滇鸡血藤组培最适宜的消毒技术。

4、滇鸡血藤在初代丛生芽诱导时，由于消毒剂的影响，极易产生褐化现象，本发明在初代诱导时添加了一定浓度的PVP，可将褐化抑制在不影响生长的范围内，同时，此浓度的添加，亦不影响滇鸡血藤的初代丛生芽诱导率。

5、滇鸡血藤在丛生芽继代增殖时，存在生长速度慢、丛生芽率低、丛生芽节间短、长时间培养易导致枯稍等情况，本发明在丛生芽继代增殖培养时，采用了一定浓度的NAA、IAA、TDZ以及BR的组合，可使短期内产生大量丛生芽，提高了增殖系数，亦能使丛生芽节间增长，更加利于实际生产操作，简介提高了生产增殖系数，同时，改良WPM基本培养基，更加利于滇鸡血藤的生长，几乎杜绝了枯稍情况的发生，具体枯稍情况，如图1和图2所示。

6、滇鸡血藤采用NAA、IBA、IAA、2,4-D各个类别以及各个浓度的生长素组合时，其生根率均表现较低，后经过壮苗培养时，能提高一定的生根率，但仍存在生根率不高的情况，本发明采用了一定浓度的IAA和NAA组合，同时添加50~70ml/L的椰汁，可减少壮苗培养环节，同时使生根率提高至95%左右。

附图说明

图1实施例1技术方案下使用改良WPM培养基后的滇鸡血藤丛生芽增殖情况图；

图2实施例1技术方案下使用WPM培养基后的滇鸡血藤丛生芽增殖情况图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明进行进一步的说明。

实施例1

1、外植体的选择与清洁：选择滇鸡血藤顶端幼嫩未木质化的茎段为外植体，去叶后剪成长约2~3cm的具芽小段，用饱和肥皂溶液涮洗10min，自来水洗净表面残留肥皂液后，滴加3滴吐温-80，震摇5min，自来水冲淋50min。

2、外植体的消毒：将洗净的外植体转移至超净工作台，用75%酒精溶液消毒15s，无菌水涮洗2次，又用饱和漂白粉溶液消毒10min，无菌水涮洗3次，再用0.1%升汞溶液消毒3min，无菌水涮洗3次，最后用0.05%升汞溶液消毒10min，无菌水涮洗8次，消毒污染率为21.7%，消毒死亡率为28.7%。

3、初代丛生芽诱导：将消毒完成的外植体，用无菌纸吸去表面水分，剪去两端伤口，并将其剪成1~2cm具芽小段，按极性接种于WPM+NAA 0.04mg/L+6-BA 2.0mg/L+PVP0.6g/L+活性炭1.0g/L的初代丛生芽诱导培养基中，在温度25±2℃下暗培养7天，后温度不变，每日照光12h，光强2000～3000lx的光暗交替下培养50天，褐化率为34.1%，但褐化未影响丛生芽的诱导及生长，丛生芽诱导率为67.4%。

4、丛生芽继代增殖培养：将诱导出的丛生芽，剪成单芽，按极性接种于改良WPM+NAA 0.1mg/L+IAA 0.02mg/L+TDZ 2.0mg/L+BR 0.1mg/L+活性炭0.4g/L的丛生芽继代增殖培养基中，在温度25±2℃下，每日照光12h，光强2000～3000lx的光暗交替下培养40天，增殖系数为4.6，培养过程中无枯稍现象发生，改良WPM培养基为在原WPM培养基的基础上，将硝酸铵改为800mg/L，磷酸二氢钾改为210mg/L，硫酸镁改为370mg/L，硫酸钾改为800mg/L，四水氯化钙改为400mg/L，其余元素不变。

5、丛生芽生根培养：将继代增殖的丛生芽，剪成具2个及以上芽的小段，按极性接种于1/2WPM+NAA 0.5mg/L+IBA 1.2mg/L+椰汁 50ml/L+活性炭0.7g/L的生根培养基中，在温度25±2℃下，每日照光12h，光强2000~3000lx的光暗交替下培养30天，生根率为89.3%。

实施例2

1、外植体的选择与清洁：选择滇鸡血藤顶端幼嫩未木质化的茎段为外植体，去叶后剪成长约2~3cm的具芽小段，用饱和肥皂溶液涮洗13min，自来水洗净表面残留肥皂液后，滴加3滴吐温-80，震摇8min，自来水冲淋55min。

2、外植体的消毒：将洗净的外植体转移至超净工作台，用75%酒精溶液消毒20s，无菌水涮洗3次，又用饱和漂白粉溶液消毒13min，无菌水涮洗4次，再用0.1%升汞溶液消毒4min，无菌水涮洗4次，最后用0.05%升汞溶液消毒10min，无菌水涮洗8次，消毒污染率为20.6%，消毒死亡率为30.2%。

3、初代丛生芽诱导：将消毒完成的外植体，用无菌纸吸去表面水分，剪去两端伤口，并将其剪成1~2cm具芽小段，按极性接种于WPM+NAA 0.05mg/L+6-BA 2.5mg/L+PVP0.7g/L+活性炭1.0g/L的初代丛生芽诱导培养基中，在温度25±2℃下暗培养7天，后温度不变，每日照光12h，光强2000~3000lx的光暗交替下培养60天，褐化率为38.7%，但褐化未影响丛生芽的诱导及生长，丛生芽诱导率为69.3%。

4、丛生芽继代增殖培养：将诱导出的丛生芽，剪成单芽，按极性接种于改良WPM+NAA 0.2mg/L+IAA 0.04mg/L+TDZ 2.3mg/L+BR 0.2mg/L+活性炭0.4g/L的丛生芽继代增殖培养基中，在温度25±2℃下，每日照光12h，光强2000~3000lx的光暗交替下培养45天，增殖系数为4.8，改良WPM培养基的配置方法同实施例1。

5、丛生芽生根培养：将继代增殖的丛生芽，剪成具2个及以上芽的小段，按极性接种于1/2WPM+NAA 0.6mg/L+IBA 1.5mg/L+椰汁 60ml/L+活性炭0.7g/L的生根培养基中，在温度25±2℃下，每日照光12h，光强2000~3000lx的光暗交替下培养35天，生根率为93.2%。

实施例3

1、外植体的选择与清洁：选择滇鸡血藤顶端幼嫩未木质化的茎段为外植体，去叶后剪成长约2~3cm的具芽小段，用饱和肥皂溶液涮洗15min，自来水洗净表面残留肥皂液后，滴加3滴吐温-80，震摇10min，自来水冲淋60min。

2、外植体的消毒：将洗净的外植体转移至超净工作台，用75%酒精溶液消毒20s，无菌水涮洗3次，又用饱和漂白粉溶液消毒15min，无菌水涮洗4次，再用0.1%升汞溶液消毒4min，无菌水涮洗4次，最后用0.05%升汞溶液消毒11min，无菌水涮洗8次，消毒污染率为19.8%，消毒死亡率为29.3%。

3、初代丛生芽诱导：将消毒完成的外植体，用无菌纸吸去表面水分，剪去两端伤口，并将其剪成1~2cm具芽小段，按极性接种于WPM+NAA 0.02mg/L+6-BA 3.0mg/L+PVP0.8g/L+活性炭1.0g/L的初代丛生芽诱导培养基中，在温度25±2℃下暗培养7~10天，后温度不变，每日照光12h，光强2000~3000lx的光暗交替下培养60天，褐化率为36.6%，但褐化未影响丛生芽的诱导及生长，丛生芽诱导率为67.0%。

4、丛生芽继代增殖培养：将诱导出的丛生芽，剪成单芽，按极性接种于改良WPM+NAA 0.2mg/L+IAA 0.05mg/L+TDZ 2.5mg/L+BR 0.2mg/L+活性炭0.4g/L的丛生芽继代增殖培养基中，在温度25±2℃下，每日照光12h，光强2000～3000lx的光暗交替下培养50天，增殖系数为5.2，改良WPM培养基的配置方法同实施例1

5、丛生芽生根培养：将继代增殖的丛生芽，剪成具2个及以上芽的小段，按极性接种于1/2WPM+NAA 0.6mg/L+IBA 1.0mg/L+椰汁 70ml/L+活性炭0.7g/L的生根培养基中，在温度25±2℃下，每日照光12h，光强2000～3000lx的光暗交替下培养40天，生根率为91.9%。

滇鸡血藤部分实验记录

1、消毒处理对消毒污染率、消毒死亡率及褐化率的影响

进行以下消毒处理后接种于WPM+NAA 0.04mg/L+6-BA 2.5mg/L+PVP0.7g/L+活性炭1.0g/L中，统计消毒污染率、消毒死亡率以及褐化率。

2、培养基添加剂对褐化的影响

按75%酒精15s+饱和漂白粉溶液15min0.1%升汞3min+0.05%升汞10min消毒后接种到添加一定浓度褐化抑制剂的WPM+NAA 0.02~0.05mg/L+6-BA 2.0~3.0mg/L培养基中，

前期进行了Vc、硝酸银等褐化抑制剂的筛选，发现Vc对滇鸡血藤褐化无明显改观，后采用硝酸银进行试验，发现较低浓度对滇鸡血藤褐化无明显抑制，而高浓度硝酸银对滇鸡血藤褐化有一定的抑制作用，但其对滇鸡血藤有毒害作用。最后筛选出适宜浓度的PVP+活性炭对滇鸡血藤褐化有明显抑制作用，且不影响生长。

3、各激素对增殖系数的影响

单纯采用NAA或IBA与6-BA、KT等常规植物生长调节剂进行使用时，可使丛生芽有缓慢的生长，但短期内几乎没有增殖，后发现滇鸡血藤对TDZ以及BR极其敏感，适宜浓度单独与NAA搭配时均可有一定的增长及增殖，后NAA再与两者进行组合发现，其增殖和增长明显速度加快，而添加一定浓度的IAA后，可使增殖系数达到最佳。