使用牛磺酸或亚牛磺酸产生去核红系细胞的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年11月4日提交的美国临时专利申请序列62/930,528的优先权；其全部内容以引用的方式并入本文。

技术领域

本发明整体涉及产生去核红系细胞的方法。

背景技术

红细胞被输注给已经经历失血的患者。此外，工程化去核红系细胞(包括红细胞)正在开发作为治疗剂，其携带或呈递外源蛋白质给有需要的患者。

发明内容

本发明基于以下发现：在成熟期间在含有牛磺酸和/或亚牛磺酸的培养基中培养红系祖细胞导致细胞增殖增加，去核速率增加，因此导致去核红系细胞数量的增加(例如，与在成熟期间不包括使用含有牛磺酸、牛磺酸前体或牛磺酸分解产物(例如，约1.0g/L至约37.5g/L或约8mM至约300mM牛磺酸、牛磺酸前体或牛磺酸分解产物)或亚牛磺酸、亚牛磺酸前体或亚牛磺酸分解产物(例如，约1.0g/L至约37.5g/L或约9mM至约345mM亚牛磺酸、亚牛磺酸前体或亚牛磺酸分解产物)的培养基的方法相比)，和/或增加了红系祖细胞可以继续生长和/或去核的时间长度。

鉴于这一发现，本文提供了产生去核红系细胞群的方法，所述方法包括：(a)将一定体积的红系祖细胞的第一细胞培养物放置到包含在器皿内的第二培养基中以提供第二细胞培养物；(b)将所述第二细胞培养物培养(例如，灌注、分批或补料分批培养)约2天至约15天；(c)将一定体积的步骤(b)的所述第二细胞培养物放置到包含在器皿内的第三培养基中以提供第三细胞培养物，其中所述第三培养基包含约1.0g/L至约37.5g/L或约8mM至约300mM牛磺酸(或牛磺酸前体或牛磺酸分解产物)和/或约1.0g/L至约37.5g/L或约9mM至约345mM亚牛磺酸(或亚牛磺酸前体或亚牛磺酸分解产物)；(d)将步骤(c)的所述第三细胞培养物培养(例如，灌注、分批或补料分批培养)约5天至约20天，其中在步骤(d)之后，所述第三培养基包含去核红系细胞群体。在一些实施方案中，步骤(a)中的初始细胞密度为约0.1x10

在本文所述的产生去核红系细胞群体的任何方法的一些实施方案中，步骤(a)中的器皿是灌注生物反应器，步骤(b)中的培养是灌注培养，步骤(c)中的器皿是灌注生物反应器，并且步骤(d)中的培养是灌注培养。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(a)之前：(i)将多个红系祖细胞放置到包含在器皿内的第一培养基中，以提供初始细胞密度为约0.1x10

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含约1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。在一些实施方案中，第一培养基包含约8μg/mL至约12μg/mL胰岛素。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含约1mM至约10mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。在一些实施方案中，第一培养基包含约5mM至约7mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含脂质(例如，脂质混合物)。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含约50μg/mL至约400μg/mL运铁蛋白。在一些实施方案中，第一培养基包含约150μg/mL至约250μg/mL运铁蛋白。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含约160μg/mL至约240μg/mL运铁蛋白。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含约180μg/mL至约220μg/mL运铁蛋白。

在一些实施方案中，步骤(ii)中的分批或补料分批培养进行约5天至约12天。在一些实施方案中，步骤(ii)中的分批或补料分批培养进行约5天至约9天。在一些实施方案中，步骤(i)中的初始细胞密度为约0.1x10

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包含约1mM至约10mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。在一些实施方案中，第二培养基包含约5mM至约7mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包含脂质(例如，脂质混合物)。

在一些实施方案中，步骤(b)的灌注培养进行约4天至约10天。在一些实施方案中，步骤(b)的灌注培养进行约5天至约8天。在一些实施方案中，步骤(a)中的初始细胞密度为约0.1x10

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包含约1mM至约8mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。在一些实施方案中，第三培养基包含约3mM至约5mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包含约0.5％v/v至约10％v/v血清。在一些实施方案中，第三培养基包含约4％v/v至约6％v/v血清。

在一些实施方案中，第三培养基进一步包含约0.5g/L至约54.0g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第三培养基包含约1.0g/L至约25.0g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第三培养基包含约1.0g/L至约5.0g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第三培养基包含约1.0g/L至约2.5g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第四培养基包含约1.0g/L至约20.0g/L牛磺酸和/或约1.0g/L至约20.0g/L亚牛磺酸。在一些实施方案中，第四培养基包含约1.0g/L至约4.0g/L牛磺酸和/或约1.0g/L至约4.0g/L亚牛磺酸。在一些实施方案中，第四培养基包含约1.0g/L至约2.5g/L牛磺酸和/或约1.0g/L至约2.5g/L亚牛磺酸。在一些实施方案中，第四培养基进一步包含下列中的一种或多种：运铁蛋白、胰岛素和EPO。在一些实施方案中，第四培养基包含下列中的两种或更多种：运铁蛋白、胰岛素和EPO。在一些实施方案中，第四培养基包含下列中的每一种：运铁蛋白、胰岛素和EPO。在一些实施方案中，第四培养基进一步包含约100μg/mL运铁蛋白至约2mg/mL运铁蛋白。在一些实施方案中，第四培养基包含约100μg/mL运铁蛋白至约1.5mg/mL运铁蛋白。在一些实施方案中，第四培养基进一步包含约1ng/mL至约500ng/mL EPO。在一些实施方案中，第四培养基包含约1ng/mL至约200ng/mL EPO。在一些实施方案中，第四培养基包含约1ng/mL至约100mg/mL EPO。在一些实施方案中，第四培养基进一步包含约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素。在一些实施方案中，第四培养基包含约0.1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第四培养基包含约1mM至约8mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。在一些实施方案中，第四培养基包含约3mM至约5mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第四培养基包含约0.5％v/v至约10％v/v血清。在一些实施方案中，第四培养基包含约4％v/v至约6％v/v血清。

在一些实施方案中，第四培养基进一步包含约0.5g/L至约54.0g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第四培养基包含约1.0g/L至约25.0g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第四培养基包含约1.0g/L至约5.0g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第四培养基包含约1.0g/L至约2.5g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，步骤(d)的灌注培养进行约8天至约15天。在一些实施方案中，步骤(d)的灌注培养进行约9天至约13天。在一些实施方案中，步骤(c)中的初始细胞密度为约2.0x10

在本文所述的产生去核红系细胞群体的任何方法的一些实施方案中，步骤(b)中的培养是分批或补料分批培养，步骤(c)中的器皿是灌注生物反应器，并且步骤(d)中的培养是灌注培养。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(a)之前：(i)将多个红系祖细胞放置到包含在器皿内的第一培养基中，以提供初始细胞密度为约0.1x10

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含约1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。在一些实施方案中，第一培养基包含约8μg/mL至约12μg/mL胰岛素。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含约1mM至约10mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。在一些实施方案中，第一培养基包含约5mM至约7mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含脂质(例如，脂质混合物)。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含约50μg/mL至约400μg/mL运铁蛋白。在一些实施方案中，第一培养基包含约150μg/mL至约250μg/mL运铁蛋白。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含约160μg/mL至约240μg/mL运铁蛋白。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含约180μg/mL至约220μg/mL运铁蛋白。

在一些实施方案中，步骤(ii)中的分批或补料分批培养进行约5天至约12天。在一些实施方案中，步骤(ii)中的分批或补料分批培养进行约5天至约9天。在一些实施方案中，步骤(i)中的初始细胞密度为约0.1x10

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包含约1mM至约10mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。在一些实施方案中，第二培养基包含约5mM至约7mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包含脂质(例如，脂质混合物)。

在一些实施方案中，步骤(b)的分批或补料分批培养进行约4天至约10天。在一些实施方案中，步骤(b)的分批或补料分批培养进行约5天至约8天。在一些实施方案中，步骤(a)中的初始细胞密度为约0.1x10

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包含约1mM至约8mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。在一些实施方案中，第三培养基包含约3mM至约5mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包含约0.5％v/v至约10％v/v血清。在一些实施方案中，第三培养基包含约4％v/v至约6％v/v血清。

在一些实施方案中，第三培养基进一步包含约0.5g/L至约54.0g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第三培养基包含约1.0g/L至约1.0g/L至约25.0g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第三培养基包含约1.0g/L至约5.0g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第三培养基包含约1.0g/L至约2.5g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第四培养基包含约1.0g/L至约20.0g/L牛磺酸和/或约1.0g/L至约20.0g/L亚牛磺酸。在一些实施方案中，第四培养基包含约1.0g/L至约4.0g/L牛磺酸和/或约1.0g/L至约4.0g/L亚牛磺酸。在一些实施方案中，第四培养基包含约1.0g/L至约2.5g/L牛磺酸和/或约1.0g/L至约2.5g/L亚牛磺酸。在一些实施方案中，第四培养基进一步包含下列中的一种或多种：运铁蛋白、胰岛素和EPO。在一些实施方案中，第四培养基包含下列中的两种或更多种：运铁蛋白、胰岛素和EPO。在一些实施方案中，第四培养基包含下列中的每一种：运铁蛋白、胰岛素和EPO。在一些实施方案中，第四培养基进一步包含约100μg/mL运铁蛋白至约2mg/mL运铁蛋白。在一些实施方案中，第四培养基包含约100μg/mL运铁蛋白至约1.5mg/mL运铁蛋白。在一些实施方案中，第四培养基进一步包含约1ng/mL至约500ng/mL EPO。在一些实施方案中，第四培养基包含约1ng/mL至约200ng/mLEPO。在一些实施方案中，第四培养基包含约1ng/mL至约100mg/mL EPO。在一些实施方案中，第四培养基进一步包含约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素。在一些实施方案中，第四培养基包含约0.1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第四培养基包含约1mM至约8mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。在一些实施方案中，第四培养基包含约3mM至约5mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第四培养基包含约0.5％v/v至约10％v/v血清。在一些实施方案中，第四培养基包含约4％v/v至约6％v/v血清。

在一些实施方案中，第四培养基进一步包含约0.5g/L至约54.0g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第四培养基包含约1.0g/L至约1.0g/L至约25.0g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第四培养基包含约1.0g/L至约5.0g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第四培养基包含约1.0g/L至约2.5g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，步骤(d)的灌注培养进行约8天至约15天。在一些实施方案中，步骤(d)的灌注培养进行约9天至约13天。在一些实施方案中，步骤(c)中的初始细胞密度为约2.0x10

在本文所述的产生去核红系细胞群体的任何方法的一些实施方案中，步骤(a)中的器皿是灌注生物反应器，步骤(b)中的培养是灌注培养，并且步骤(d)中的培养是分批或补料分批培养。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(a)之前：(i)将多个红系祖细胞放置到包含在器皿内的第一培养基中，以提供初始细胞密度为约0.1x10

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含约1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。在一些实施方案中，第一培养基包含约8μg/mL至约12μg/mL胰岛素。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含约1mM至约10mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。在一些实施方案中，第一培养基包含约5mM至约7mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含脂质(例如，脂质混合物)。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含约50μg/mL至约400μg/mL运铁蛋白。在一些实施方案中，第一培养基包含约150μg/mL至约250μg/mL运铁蛋白。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含约160μg/mL至约240μg/mL运铁蛋白。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含约180μg/mL至约220μg/mL运铁蛋白。

在一些实施方案中，步骤(ii)中的分批或补料分批培养进行约5天至约12天。在一些实施方案中，步骤(ii)中的分批或补料分批培养进行约5天至约9天。在一些实施方案中，步骤(i)中的初始细胞密度为约0.1x10

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包含约1mM至约10mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。在一些实施方案中，第二培养基包含约5mM至约7mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包含脂质(例如，脂质混合物)。

在一些实施方案中，步骤(b)的灌注培养进行约4天至约10天。在一些实施方案中，步骤(b)的灌注培养进行约5天至约8天。在一些实施方案中，步骤(a)中的初始细胞密度为约0.1x10

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包含约1mM至约8mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。在一些实施方案中，第三培养基包含约3mM至约5mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包含约0.5％v/v至约10％v/v血清。在一些实施方案中，第三培养基包含约4％v/v至约6％v/v血清。

在一些实施方案中，第三培养基进一步包含约0.5g/L至约54.0g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第三培养基包含约1.0g/L至约1.0g/L至约25.0g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第三培养基包含约1.0g/L至约5.0g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第三培养基包含约1.0g/L至约2.5g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第四培养基包含约1.0g/L至约20.0g/L牛磺酸和/或约1.0g/L至约20.0g/L亚牛磺酸。在一些实施方案中，第四培养基包含约1.0g/L至约4.0g/L牛磺酸和/或约1.0g/L至约4.0g/L亚牛磺酸。在一些实施方案中，第四培养基包含约1.0g/L至约2.5g/L牛磺酸和/或约1.0g/L至约2.5g/L亚牛磺酸。在一些实施方案中，第四培养基进一步包含下列中的一种或多种：运铁蛋白、胰岛素和EPO。在一些实施方案中，第四培养基包含下列中的两种或更多种：运铁蛋白、胰岛素和EPO。在一些实施方案中，第四培养基包含下列中的每一种：运铁蛋白、胰岛素和EPO。在一些实施方案中，第四培养基进一步包含约100μg/mL运铁蛋白至约2mg/mL运铁蛋白。在一些实施方案中，第四培养基包含约100μg/mL运铁蛋白至约1.5mg/mL运铁蛋白。在一些实施方案中，第四培养基进一步包含约1ng/mL至约500ng/mL EPO。在一些实施方案中，第四培养基包含约1ng/mL至约200ng/mLEPO。在一些实施方案中，第四培养基包含约1ng/mL至约100mg/mL EPO。在一些实施方案中，第四培养基进一步包含约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素。在一些实施方案中，第四培养基包含约0.1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第四培养基包含约1mM至约8mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。在一些实施方案中，第四培养基包含约3mM至约5mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第四培养基包含约0.5％v/v至约10％v/v血清。在一些实施方案中，第四培养基包含约4％v/v至约6％v/v血清。

在一些实施方案中，第四培养基进一步包含约0.5g/L至约54.0g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第四培养基包含约1.0g/L至约1.0g/L至约25.0g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第四培养基包含约1.0g/L至约5.0g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第四培养基包含约1.0g/L至约2.5g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，步骤(d)的分批或补料分批培养进行约8天至约15天。在一些实施方案中，步骤(d)的分批或补料分批培养进行约9天至约13天。在一些实施方案中，步骤(c)中的初始细胞密度为约2.0x10

在本文所述的产生去核红系细胞群体的任何方法的一些实施方案中，步骤(b)中的培养是分批或补料分批培养，步骤(d)中的培养是分批或补料分批培养。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(a)之前：(i)将多个红系祖细胞放置到包含在器皿内的第一培养基中，以提供初始细胞密度为约0.1x10

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含约1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。在一些实施方案中，第一培养基包含约8μg/mL至约12μg/mL胰岛素。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含约1mM至约10mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。在一些实施方案中，第一培养基包含约5mM至约7mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含脂质(例如，脂质混合物)。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含约50μg/mL至约400μg/mL运铁蛋白。在一些实施方案中，第一培养基包含约150μg/mL至约250μg/mL运铁蛋白。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含约160μg/mL至约240μg/mL运铁蛋白。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含约180μg/mL至约220μg/mL运铁蛋白。

在一些实施方案中，步骤(ii)中的分批或补料分批培养进行约5天至约12天。在一些实施方案中，步骤(ii)中的分批或补料分批培养进行约5天至约9天。在一些实施方案中，步骤(i)中的初始细胞密度为约0.1x10

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包含约1mM至约10mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。在一些实施方案中，第二培养基包含约5mM至约7mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包含脂质(例如，脂质混合物)。

在一些实施方案中，步骤(b)的分批或补料分批培养进行约4天至约10天。在一些实施方案中，步骤(b)的分批或补料分批培养进行约5天至约8天。在一些实施方案中，步骤(a)中的初始细胞密度为约0.1x10

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包含约1mM至约8mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。在一些实施方案中，第三培养基包含约3mM至约5mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包含约0.5％v/v至约10％v/v血清。在一些实施方案中，第三培养基包含约4％v/v至约6％v/v血清。

在一些实施方案中，第三培养基进一步包含约0.5g/L至约54.0g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第三培养基包含约1.0g/L至约1.0g/L至约25.0g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第三培养基包含约1.0g/L至约5.0g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第三培养基包含约1.0g/L至约2.5g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第四培养基包含约1.0g/L至约20.0g/L牛磺酸和/或约1.0g/L至约20.0g/L亚牛磺酸。在一些实施方案中，第四培养基包含约1.0g/L至约4.0g/L牛磺酸和/或约1.0g/L至约4.0g/L亚牛磺酸。在一些实施方案中，第四培养基包含约1.0g/L至约2.5g/L牛磺酸和/或约1.0g/L至约2.5g/L亚牛磺酸。在一些实施方案中，第四培养基进一步包含下列中的一种或多种：运铁蛋白、胰岛素和EPO。在一些实施方案中，第四培养基包含下列中的两种或更多种：运铁蛋白、胰岛素和EPO。在一些实施方案中，第四培养基包含下列中的每一种：运铁蛋白、胰岛素和EPO。在一些实施方案中，第四培养基进一步包含约100μg/mL运铁蛋白至约2mg/mL运铁蛋白。在一些实施方案中，第四培养基包含约100μg/mL运铁蛋白至约1.5mg/mL运铁蛋白。在一些实施方案中，第四培养基进一步包含约1ng/mL至约500ng/mL EPO。在一些实施方案中，第四培养基包含约1ng/mL至约200ng/mLEPO。在一些实施方案中，第四培养基包含约1ng/mL至约100mg/mL EPO。在一些实施方案中，第四培养基进一步包含约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素。在一些实施方案中，第四培养基包含约0.1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第四培养基包含约1mM至约8mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。在一些实施方案中，第四培养基包含约3mM至约5mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第四培养基包含约0.5％v/v至约10％v/v血清。在一些实施方案中，第四培养基包含约4％v/v至约6％v/v血清。

在一些实施方案中，第四培养基进一步包含约0.5g/L至约54.0g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第四培养基包含约1.0g/L至约1.0g/L至约25.0g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第四培养基包含约1.0g/L至约5.0g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，第四培养基包含约1.0g/L至约2.5g/L肌-肌醇。在一些实施方案中，步骤(d)的分批或补料分批培养进行约8天至约15天。在一些实施方案中，步骤(d)的分批或补料分批培养进行约9天至约13天。在一些实施方案中，步骤(c)中的初始细胞密度为约2.0x10

在本文所述的产生去核红系细胞群体的任何方法的一些实施方案中，所述红系祖细胞是人红系祖细胞。在一些实施方案中，红系祖细胞获自O阴性人供体。在一些实施方案中，红系祖细胞获自O阴性和Kell阴性人供体。

在本文所述的产生去核红系细胞群体的任何方法的一些实施方案中，所述去核红系细胞群体是去核人红系细胞群体。在本文所述的产生去核红系细胞群体的任何方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括：(e)从步骤(d)的第三细胞培养物中分离去核红系细胞群体。在一些实施方案中，所述方法进一步包括：(f)配制步骤(e)中分离的去核红系细胞群体。在一些实施方案中，所述方法进一步包括：(g)将步骤(f)中的配制的去核红系细胞群体施用于有需要的受试者。

在本文所述的产生去核红系细胞群体的任何方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括，在步骤(a)期间和/或之前，将核酸引入第一细胞培养物中的红系祖细胞，并且所述方法导致产生工程化去核红系细胞群体。在一些实施方案中，工程化去核红系细胞群体是工程化去核人红系细胞。在一些实施方案中，核酸编码一种或多种外源多肽。在一些实施方案中，工程化人去核红系细胞包含一种或多种外源蛋白质。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将一种或多种外源蛋白质点击缀合至细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括低渗加载细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过物理操纵来加载细胞。在一些实施方案中，一种或多种外源蛋白质中的一种外源蛋白质存在于工程化人去核红系细胞的胞质溶胶中。在一些实施方案中，一种或多种外源蛋白质中的一种外源蛋白质是存在于工程化人去核红系细胞的膜上的蛋白质。在一些实施方案中，一种或多种外源蛋白质中的一种外源蛋白质包含苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)，其中外源蛋白质存在于工程化人去核红系细胞的胞质溶胶中，其中与不接触含有亚牛磺酸或牛磺酸的液体培养基的工程化人去核红系细胞相比，工程化人去核红系细胞表现出增强的苯丙氨酸降解活性。在一些实施方案中，与不接触含有亚牛磺酸或牛磺酸的液体培养基的工程化人去核红系细胞相比，工程化人去核红系细胞显示出苯丙氨酸降解活性至少提高10％。在一些实施方案中，与不接触含有亚牛磺酸或牛磺酸的液体培养基的工程化人去核红系细胞相比，工程化人去核红系细胞显示出苯丙氨酸降解活性至少提高20％。在一些实施方案中，一种或多种外源蛋白质包含免疫调节分子。在一些实施方案中，一种或多种外源蛋白质包含抗原呈递分子。在一些实施方案中，所述方法进一步包括：(e)从步骤(d)的第三细胞培养物中分离工程化去核红系细胞群体。在一些实施方案中，所述方法进一步包括：(f)配制步骤(e)中分离的工程化去核红系细胞群体。在一些实施方案中，所述方法进一步包括：(g)将步骤(f)中的经配制的工程化去核红系细胞群体施用于有需要的受试者。

本文还提供了通过本文所述的产生去核红系细胞群体的任何方法产生的去核红系细胞群体。本文还提供了通过本文所述的产生去核红系细胞群体的任何方法产生的制剂，所述方法进一步包括：(f)配制步骤(e)中分离的去核红系细胞群体。本文还提供了通过本文所述的产生去核红系细胞群体的任何方法产生的去核红系细胞群体，所述方法进一步包括在步骤(a)之前，将核酸引入第一细胞培养物中的红系祖细胞，其中所述方法导致产生工程化去核红系细胞群体。本文还提供了通过本文所述的产生去核红系细胞群体的任何方法产生的制剂，所述方法进一步包括在步骤(a)之前，将核酸引入第一细胞培养物中的红系祖细胞，其中所述方法导致产生工程化去核红系细胞群体，其中所述方法进一步包括：(e)从步骤(d)中的第三细胞培养物中分离工程化去核红系细胞群体，并且其中所述方法进一步包括：(f)配制步骤(e)中分离的工程化去核红系细胞群体。

术语“群体”是指给定物品中的两个或更多个(例如，本文所述的任何示例性去核红系细胞)。

术语“工程化去核红系细胞”是指包含一种或多种(例如，两种、三种、四种、五种或六种)外源蛋白质(例如，本文所述或本领域已知的示例性外源蛋白质的任何组合)的去核红系细胞(例如，人去核红系细胞)。例如，工程化红细胞可以具有存在于其胞质溶胶中的一种或多种外源蛋白质。在一些实施方案中，工程化红细胞可以具有存在于其质膜上的一种或多种外源蛋白质。在一些实施方案中，工程化红细胞可具有(i)存在于其胞质溶胶中的一种或多种外源蛋白质以及(ii)存在于其质膜上的一种或多种外源蛋白质。工程化去核红系细胞的非限制性实施方案包括点击缀合的去核红系细胞、已低渗加载的去核红系细胞和已经通过物理操纵(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性类型的物理操纵)加载的去核红系细胞。本文描述了工程化去核红系细胞的其他非限制性方面。

术语“点击缀合的去核红系细胞”指工程化去核红系细胞，其具有至少一种通过化学反应缀合到存在于工程化去核红系细胞的质膜上的另一种蛋白(例如，去核红细胞的内源蛋白质或不同的外源蛋白质)的外源蛋白质。

术语“低渗加载的去核红系细胞”指工程化去核红系细胞，其至少部分是通过将去核红系细胞或红系祖细胞暴露于包含一种或多种外源蛋白质的低离子强度缓冲液(例如，本文所述的任何示例性低离子强度缓冲液)而产生。本文描述了可用于产生低渗加载的去核红系细胞的方法的非限制性实例。用于产生低渗加载的去核红系细胞的其他方法是本领域已知的。

术语“通过物理操纵加载的去核红系细胞”指至少部分通过以导致一种或多种外源蛋白质(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性外源蛋白质)和/或编码一种或多种外源蛋白质(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性外源蛋白质)的核酸引入红系祖细胞的方式物理操纵红系细胞而产生的去核红系细胞。可用于将编码一种或多种外源蛋白质的核酸引入红系祖细胞的物理操纵的非限制性实例包括电穿孔和颗粒介导的转染。可用于将编码一种或多种外源蛋白质的核酸引入红系祖细胞的物理操纵的其他实例是本领域已知的。

术语“外源蛋白质”是指被引入细胞中或细胞上的蛋白质，或通过将编码该蛋白质的外源核酸引入细胞或细胞祖细胞而使其表达的蛋白质。在一些实施方案中，外源蛋白质是由引入细胞或细胞祖细胞的外源核酸编码的蛋白质，所述核酸任选地不被细胞保留。在一些实施方案中，外源蛋白质是通过化学或酶促手段缀合至细胞表面的蛋白质。外源性蛋白的非限制性种类包括酶、白介素、细胞因子受体、Fc结合分子、T细胞活化配体、T细胞受体、免疫抑制分子、MHC分子、APC结合分子、自身抗原、变应原、毒素、靶向剂、受体配体(例如受体激动剂或受体拮抗剂)和抗体或抗体片段。本文描述了可存在于工程化去核红系细胞中的外源蛋白质的其他实施方案(参见，例如，表A-D)。可存在于工程化去核红系细胞中的外源蛋白质的其他实施方案是本领域已知的。

术语“存在于膜上的蛋白质”指(1)物理附着于或至少部分嵌入去核红系细胞膜的蛋白质(例如跨膜蛋白质、外周膜蛋白质、脂质锚定蛋白质(例如GPI锚、N-肉豆蔻酰化蛋白质或S-棕榈酰化蛋白质))或(2)稳定结合其关联受体的蛋白质，其中关联受体物理附着于去核红系细胞膜(例如结合其关联受体的配体，其中关联受体物理附着于去核红系细胞膜)。用于确定哺乳动物细胞膜上蛋白质存在的非限制性方法包括荧光激活细胞分选(FACS)、免疫组织化学、细胞分级测定和蛋白质印迹。

术语“红系祖细胞”是指能够最终分化/发育成去核红系细胞的哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述红系祖细胞是脐带血干细胞、CD34

术语“受试者”是指任何哺乳动物。在一些实施方案中，受试者或"需要治疗的受试者"可以是灵长类动物(例如，人、猿(例如，猴(例如，狨或狒狒)或猿(例如，大猩猩、黑猩猩、猩猩或长臂猿))、啮齿动物(例如，小鼠、豚鼠、仓鼠或大鼠)、兔、狗、猫、马、绵羊、牛、猪或山羊。在一些实施方案中，受试者或"适于治疗的受试者"可以是非人哺乳动物，尤其是常规用作在人中显示治疗功效的模型的哺乳动物(例如，小鼠、猪、大鼠或非人灵长类动物)。在一些实施方案中，受试者可被预先诊断或鉴定为需要医学专业人员(例如，实验室技术人员、医师助理、医师实验室或临床实验室技术人员)治疗。

如本文所用，“治疗”是指减少受试者(例如，本文所述的任何示例性受试者)的医学疾病或病症的一种或多种症状的数量、严重性、频率和/或持续时间。

术语“摇瓶”是指可以容纳一定体积的液体培养基的器皿(例如，无菌器皿)，其具有至少一个气体可渗透表面(例如，具有气体可渗透元件(例如，膜，其也可以充当无菌屏障)的但不)；和/或至少一个通气帽，并且其形状的至少一部分是近似截头圆锥形的。例如，摇瓶可以是细胞培养瓶，如T形瓶、锥形瓶或其任何本领域公认的改进形式。

术语“摇管”是指可保持液体培养基的器皿(例如，无菌器皿)，其具有至少一个气体可渗透表面(例如，具有气体可渗透元件(例如，膜，其也可以充当无菌屏障)的端部)；和/或至少一个通气盖，并且能够在搅动(例如，旋转搅动)时将液体培养基保持在器皿内，并且其形状的至少一部分是近似圆柱形的。例如，摇管可以是Eppendorf

术语“补料分批培养”是指包括向初始细胞培养物中递增或连续地添加第二液体培养基而不从细胞培养物中大量或显著去除第一液体培养基的培养方法。在一些情况下，第二液体培养基包含与第一液体培养基基本上相同浓度的相同组分。在其他情况下，第二液体培养基是浓缩形式的第一液体培养基和/或作为干粉添加。

术语“灌注培养”是指包括向细胞培养物中添加(递增或连续)液体培养基并从细胞培养物中去除液体培养基的培养方法。可以同时或顺序地进行去除和添加，或者两者的组合。此外，可以连续地进行去除和添加。在一些情况下，在整个或部分培养期内，去除的液体培养基的体积和添加的液体培养基的体积可以在每个24小时期间(或可选地，约1小时至约24小时的递增的时间段或大于24小时的递增的时间段)保持大致相同。如本领域已知的，去除液体培养基的体积的速率(体积/单位时间)和添加液体培养基的体积的速率(体积/单位时间)可以变化。去除液体培养基的体积的速率(体积/时间单位)和添加液体培养基的体积的速率(体积/时间单位)可以大致相同或可以不同。

可选地，在培养期间，在每个24小时期间(或可选地，1小时至约24小时之间的递增时间段或大于24小时的递增时间段)，去除和添加的体积可以变化(例如，逐渐增加)。例如，在培养期内的每个24小时期间(或可选地，约1小时至24小时以上的递增时间段或大于24小时的递增时间段)内去除的液体培养基的体积和添加的液体培养基的体积可以在培养期内增加(例如，逐渐地或通过交错递增)。

可以例如通过可以从器皿(例如，生物反应器)去除一定体积的液体培养基的机械系统、通过允许细胞沉降并且使用移液去除一定体积的液体培养基、或者通过可以至少部分地包括使用离心力的方法来去除一定体积的液体培养基。可选地或另外地，可通过使一定体积的液体培养基渗过或重力流过无菌膜而去除一定体积的液体培养基，无菌膜的分子量截留部分不包括红系祖细胞和去核红系细胞。

可以以自动化方式，例如通过蠕动泵或灌注泵将一定体积的液体培养基添加到器皿(例如生物反应器)。

术语“无动物组分的液体培养基”是指不含任何来自哺乳动物的组分(例如，蛋白质或血清)的液体培养基。

术语“无血清液体培养基”是指不含哺乳动物血清的液体培养基。

术语“化学成分确定的液体培养基”是指其中所有化学成分都是已知的液体培养基。例如，化学成分确定的液体培养基不含胎儿血清、血清白蛋白或血清白蛋白，因为这些制剂通常含有白蛋白和脂质的复杂混合物。

术语“搅动”是指细胞培养物(例如，包括本文所述的任何示例性细胞的细胞培养物)在器皿中的移动。搅动可以使用任何本领域已知的方法进行，例如，以圆形或椭圆形运动移动含有细胞培养物的器皿的仪器，如旋转振荡器。可选地或另外地，可通过倾斜容器或滚动含有细胞培养物的器皿来进行搅动。在一些实施方案中，细胞培养物的搅动可以通过在含有细胞培养物的生物反应器中使用叶轮来进行。

术语“牛磺酸分解产物”、“亚牛磺酸分解产物”和“牛磺酸或亚牛磺酸分解产物”是指哺乳动物细胞中分解代谢牛磺酸或亚牛磺酸(如所示)产生的分子(如产物或中间体)。牛磺酸或亚牛磺酸分解产物的非限制性实例是5-谷氨酰-牛磺酸、牛磺胆酸盐和脒基牛磺酸。

术语“牛磺酸前体”、“亚牛磺酸前体”或“牛磺酸和亚牛磺酸前体”是指哺乳动物细胞中牛磺酸或亚牛磺酸(如所示)生物合成途径中的分子(如底物或中间体)。牛磺酸或亚牛磺酸前体的非限制性实例包括L-半胱氨酸、L-磷酸半胱氨酸、半胱胺和半胱氨酸亚磺酸(也称为3-亚磺酰-L-丙氨酸)。在某些实施方案中，术语“牛磺酸前体”、“亚牛磺酸前体”和“牛磺酸和亚牛磺酸前体”不包括L-半胱氨酸。

术语“肌-肌醇分解产物”是指哺乳动物细胞中肌-肌醇分解代谢产生的分子(例如产物或中间体)。肌-肌醇分解产物的非限制性实例是葡糖醛酸和磷脂酰-1D-肌-肌醇。

术语“肌-肌醇前体”是指哺乳动物细胞中肌-肌醇生物合成途径中的分子(例如底物或中间体)。肌-肌醇前体的非限制性实例包括1D-肌-肌醇3-磷酸和1D-肌-肌醇1-磷酸。肌-肌醇前体的其他非限制性实例包括1-磷脂酰-1D-肌-肌醇-3,5-二磷酸、1-磷脂酰-1D-肌-肌醇-5-磷酸、1-磷脂酰-1D-肌-肌醇-3,4,5-三磷酸、1-磷脂酰-1D-肌-肌醇-3-磷酸、1-磷脂酰-1D-肌-肌醇-3,4-二磷酸、1-磷脂酰-1D-肌-肌醇-4,5-二磷酸、1-磷脂酰-1D-肌-肌醇-4-磷酸、磷脂酰-1D-肌-肌醇、肌-肌醇-1,3-二磷酸、1D-肌-肌醇-4-磷酸、1D-肌-肌醇-1,4-二磷酸、1D-肌-肌醇-1,4,5-三磷酸、1D-肌-肌醇-1,3,4,5-四磷酸、1D-肌-肌醇-1,3,4-三磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸和1D-肌-肌醇-3,4-二磷酸。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，细胞培养不包括在本文所述的任何方法的至少一部分中搅动细胞培养物。

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；也可使用本领域已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和实施例仅是说明性的，而不是限制性的。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献均以引用的方式全文并入本文。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。

本发明的其他特征和优点将从下面的详细描述和附图以及权利要求中显而易见。

附图说明

图1示出当使用包含亚牛磺酸、包含亚牛磺酸和肌-肌醇的培养基以及不含亚牛磺酸或肌-肌醇的培养基(对照)时，红系祖细胞培养物中随时间推移的总细胞密度(“总密度”)。

图2示出当使用包含亚牛磺酸、包含亚牛磺酸和肌-肌醇的培养基和不含亚牛磺酸或肌-肌醇的培养基时，红系祖细胞培养物中随时间推移的去核红系细胞密度(“去核细胞密度”)。

具体实施方案

本文提供了产生去核红系细胞群体的方法，所述方法包括：(a)将一定体积的红系祖细胞的第一细胞培养物放置到包含在器皿内的第二培养基中以提供第二细胞培养物；(b)将所述第二细胞培养物培养(例如，灌注、分批或补料分批培养)约2天至约15天；(c)将一定体积的步骤(b)的所述第二细胞培养物放置到包含在器皿内的第三培养基中以提供第三细胞培养物，其中所述第三培养基包含约1.0g/L至约37.5g/L或约8mM至约300mM牛磺酸(或牛磺酸前体或牛磺酸分解产物)和/或约1.0g/L至约37.5g/L或约9mM至约345mM亚牛磺酸(或亚牛磺酸前体或亚牛磺酸分解产物)；(d)将步骤(c)的所述第三细胞培养物培养(例如，灌注、分批或补料分批培养)约5天至约20天，其中在步骤(d)之后，所述第三培养基包含去核红系细胞群体。

在一些实施方案中，本文所述的方法在本文所述的任何方法结束时提供去核速率或去核细胞百分比的增加(例如，至少1％至约300％的增加(例如，约1％至约280％的增加、约1％至约260％的增加、约1％至约240％的增加、约1％至约220％的增加、约1％至约200％的增加、约1％至约180％的增加、约1％至约160％的增加、约1％的增加至约140％的增加、约1％至约120％的增加、约1％的增加至约100％的增加、约1％的增加至约80％的增加、约1％的增加至约60％的增加、约1％的增加至约40％的增加、约1％的增加至约20％的增加、约1％的增加至约10％的增加、约1％的增加至约5％的增加、约5％的增加至约300％的增加、约5％至约280％的增加、约5％至约260％的增加、约5％至约240％的增加、约5％至约220％的增加、约5％至约200％的增加、约5％至约180％的增加、约5％至约160％的增加、约5％的增加至约140％的增加、约5％至约120％的增加、约5％的增加至约100％的增加、约5％的增加至约80％的增加、约5％的增加至约60％的增加、约5％的增加至约40％的增加、约5％的增加至约20％的增加、约5％的增加至约10％的增加、约10％的增加至约300％的增加、约10％至约280％的增加、约10％至约260％的增加、约10％至约240％的增加、约10％至约220％的增加、约10％至约200％的增加、约10％至约180％的增加、约10％至约160％的增加、约10％的增加至约140％的增加、约10％至约120％的增加、约10％的增加至约100％的增加、约10％的增加至约80％的增加、约10％的增加至约60％的增加、约10％的增加至约40％的增加、约10％的增加至约20％的增加、约20％的增加至约300％的增加、约20％至约280％的增加、约20％至约260％的增加、约20％至约240％的增加、约20％至约220％的增加、约20％至约200％的增加、约20％至约180％的增加、约20％至约160％的增加、约20％的增加至约140％的增加、约20％至约120％的增加、约20％的增加至约100％的增加、约20％的增加至约80％的增加、约20％的增加至约60％的增加、约20％的增加至约40％的增加、约40％的增加至约300％的增加、约40％至约280％的增加、约40％至约260％的增加、约40％至约240％的增加、约40％至约220％的增加、约40％至约200％的增加、约40％至约180％的增加、约40％至约160％的增加、约40％的增加至约140％的增加、约40％至约120％的增加、约40％的增加至约100％的增加、约40％的增加至约80％的增加、约40％的增加至约60％的增加、约60％的增加至约300％的增加、约60％至约280％的增加、约60％至约260％的增加、约60％至约240％的增加、约60％至约220％的增加、约60％至约200％的增加、约60％至约180％的增加、约60％至约160％的增加、约60％的增加至约140％的增加、约60％至约120％的增加、约60％的增加至约100％的增加、约60％的增加至约80％的增加、约80％的增加至约300％的增加、约80％至约280％的增加、约80％至约260％的增加、约80％至约240％的增加、约80％至约220％的增加、约80％至约200％的增加、约80％至约180％的增加、约80％至约160％的增加、约80％的增加至约140％的增加、约80％至约120％的增加、约80％的增加至约100％的增加、约100％的增加至约300％的增加、约100％至约280％的增加、约100％至约260％的增加、约100％至约240％的增加、约100％至约220％的增加、约100％至约200％的增加、约100％至约180％的增加、约100％至约160％的增加、约100％的增加至约140％的增加、约100％至约120％的增加、约120％的增加至约300％的增加、约120％至约280％的增加、约120％至约260％的增加、约120％至约240％的增加、约120％至约220％的增加、约120％至约200％的增加、约120％至约180％的增加、约120％至约160％的增加、约120％的增加至约140％的增加、约140％的增加至约300％的增加、约140％至约280％的增加、约140％至约260％的增加、约140％至约240％的增加、约140％至约220％的增加、约140％至约200％的增加、约140％至约180％的增加、约140％至约160％的增加、约160％的增加至约300％的增加、约160％至约280％的增加、约160％至约260％的增加、约160％至约240％的增加、约160％至约220％的增加、约160％至约200％的增加、约160％至约180％的增加、约180％的增加至约300％的增加、约180％至约280％的增加、约180％至约260％的增加、约180％至约240％的增加、约180％至约220％的增加、约180％至约200％的增加、约200％的增加至约300％的增加、约200％至约280％的增加、约200％至约260％的增加、约200％至约240％的增加、约200％至约220％的增加、约220％的增加至约300％的增加、约220％至约280％的增加、约220％至约260％的增加、约220％至约240％的增加、约240％的增加至约300％的增加、约240％至约280％的增加、约240％至约260％的增加、约260％的增加至约300％的增加、约260％至约280％的增加或约280％的增加至约300％的增加))，这是例如与在成熟期间不包括使用如下培养基的类似方法相比，所述培养基包含牛磺酸(或牛磺酸前体或牛磺酸分解产物)或亚牛磺酸(或亚牛磺酸前体或亚牛磺酸分解产物)的培养基，或包含约1.0g/L至约37.5g/L或约8mM或约300mM牛磺酸(或牛磺酸前体或牛磺酸分解产物)或约1.0g/L至约37.5g/L或约9mM至约345mM亚牛磺酸(或亚牛磺酸前体或亚牛磺酸分解产物)。

在一些实施方案中，本文所述的方法在本文所述的任何方法结束时，提供了去核红系细胞(如本文所述的任何去核红系细胞)的浓度、数量或产量的约1％至约300％的增加(或本文所述的该范围的任何子范围)，这是例如与在成熟期间不包括使用如下培养基的类似方法相比，所述培养基包含牛磺酸(或牛磺酸前体或牛磺酸分解产物)或亚牛磺酸(或亚牛磺酸前体或亚牛磺酸分解产物)或含有约1.0g/L至约37.5g/L或约8mM至约300mM(或牛磺酸前体或牛磺酸分解产物)或约1.0g/L至约37.5g/L或约9mM至约345mM亚牛磺酸(或亚牛磺酸前体或亚牛磺酸分解产物)。

在一些实施方案中，本文所述的方法在本文所述的任何方法期间，提供了每个红系祖细胞的平均细胞分裂次数的约1％至约300％的增加(或本文所述的该范围的任何子范围)，这是例如与在分化或成熟期间不包括使用如下培养基的类似方法相比，所述培养基包含牛磺酸(或牛磺酸前体或牛磺酸分解产物)或亚牛磺酸(或亚牛磺酸前体或亚牛磺酸分解产物)或含有约1.0g/L至约37.5g/L或约8mM至约300mM(或牛磺酸前体或牛磺酸分解产物)或约1.0g/L至约37.5g/L或约9mM至约345mM亚牛磺酸(或亚牛磺酸前体或亚牛磺酸分解产物)。

这些方法的非限制性方面描述如下。本领域技术人员可以理解，下面列出的示例性方面可以以任何组合使用，并且可以与本领域已知的其他方面组合。

摇瓶

本文所述方法的一些方面包括使用摇瓶。在一些实施方案中，摇瓶的体积可为约2mL至约5L、约2mL至约4.5L、约2mL至约4L、约2mL至约3.5L、约2mL至约3L、约2mL至约2.5L、约2mL至约2L、约2mL至约1.5L、约2mL至约1.0L、约2mL至约950mL、约2mL至约900mL、约2mL至约850mL、约2mL至约800mL、约2mL至约750mL、约2mL至约700mL、约2mL至约650mL、约2mL至约600mL、约2mL至约550mL、约2mL至约500mL、约2mL至约450mL、约2mL至约400mL、约2mL至约350mL、约2mL至约300mL、约2mL至约250mL、约2mL至约200mL、约2mL至约180mL、约2mL至约160mL、约2mL至约140mL、约2mL至约120mL、约2mL至约100mL、约2mL至约80mL、约2mL至约60mL、约2mL至约40mL、约2mL至约20mL、约2mL至约10mL、约2mL至约5mL、约5mL至约5L、约5mL至约4.5L、约5mL至约4L、约5mL至约3.5L、约5mL至约3L、约5mL至约2.5L、约5mL至约2L、约5mL至约1.5L、约5mL至约1.0L、约5mL至约950mL、约5mL至约900mL、约5mL至约850mL、约5mL至约800mL、约5mL至约750mL、约5mL至约700mL、约5mL至约650mL、约5mL至约600mL、约5mL至约550mL、约5mL至约500mL、约5mL至约450mL、约5mL至约400mL、约5mL至约350mL、约5mL至约300mL、约5mL至约250mL、约5mL至约200mL、约5mL至约180mL、约5mL至约160mL、约5mL至约140mL、约5mL至约120mL、约5mL至约100mL、约5mL至约80mL、约5mL至约60mL、约5mL至约40mL、约5mL至约20mL、约5mL至约10mL、约10mL至约5L、约10mL至约4.5L、约10mL至约4L、约10mL至约3.5L、约10mL至约3L、约10mL至约2.5L、约10mL至约2L、约10mL至约1.5L、约10mL至约1.0L、约10mL至约950mL、约10mL至约900mL、约10mL至约850mL、约10mL至约800mL、约10mL至约750mL、约10mL至约700mL、约10mL至约650mL、约10mL至约600mL、约10mL至约550mL、约10mL至约500mL、约10mL至约450mL、约10mL至约400mL、约10mL至约350mL、约10mL至约300mL、约10mL至约250mL、约10mL至约200mL、约10mL至约180mL、约10mL至约160mL、约10mL至约140mL、约10mL至约120mL、约10mL至约100mL、约10mL至约80mL、约10mL至约60mL、约10mL至约40mL、约10mL至约20mL、约20mL至约5L、约20mL至约4.5L、约20mL至约4L、约20mL至约3.5L、约20mL至约3L、约20mL至约2.5L、约20mL至约2L、约20mL至约1.5L、约20mL至约1.0L、约20mL至约950mL、约20mL至约900mL、约20mL至约850mL、约20mL至约800mL、约20mL至约750mL、约20mL至约700mL、约20mL至约650mL、约20mL至约600mL、约20mL至约550mL、约20mL至约500mL、约20mL至约450mL、约20mL至约400mL、约20mL至约350mL、约20mL至约300mL、约20mL至约250mL、约20mL至约200mL、约20mL至约180mL、约20mL至约160mL、约20mL至约140mL、约20mL至约120mL、约20mL至约100mL、约20mL至约80mL、约20mL至约60mL、约20mL至约40mL、约40mL至约5L、约40mL至约4.5L、约40mL至约4L、约40mL至约3.5L、约40mL至约3L、约40mL至约2.5L、约40mL至约2L、约40mL至约1.5L、约40mL至约1.0L、约40mL至约950mL、约40mL至约900mL、约40mL至约850mL、约40mL至约800mL、约40mL至约750mL、约40mL至约700mL、约40mL至约650mL、约40mL至约600mL、约40mL至约550mL、约40mL至约500mL、约40mL至约450mL、约40mL至约400mL、约40mL至约350mL、约40mL至约300mL、约40mL至约250mL、约40mL至约200mL、约40mL至约180mL、约40mL至约160mL、约40mL至约140mL、约40mL至约120mL、约40mL至约100mL、约40mL至约80mL、约40mL至约60mL、约60mL至约5L、约60mL至约4.5L、约60mL至约4L、约60mL至约3.5L、约60mL至约3L、约60mL至约2.5L、约60mL至约2L、约60mL至约1.5L、约60mL至约1.0L、约60mL至约950mL、约60mL至约900mL、约60mL至约850mL、约60mL至约800mL、约60mL至约750mL、约60mL至约700mL、约60mL至约650mL、约60mL至约600mL、约60mL至约550mL、约60mL至约500mL、约60mL至约450mL、约60mL至约400mL、约60mL至约350mL、约60mL至约300mL、约60mL至约250mL、约60mL至约200mL、约60mL至约180mL、约60mL至约160mL、约60mL至约140mL、约60mL至约120mL、约60mL至约100mL、约60mL至约80mL、约80mL至约5L、约80mL至约4.5L、约80mL至约4L、约80mL至约3.5L、约80mL至约3L、约80mL至约2.5L、约80mL至约2L、约80mL至约1.5L、约80mL至约1.0L、约80mL至约950mL、约80mL至约900mL、约80mL至约850mL、约80mL至约800mL、约80mL至约750mL、约80mL至约700mL、约80mL至约650mL、约80mL至约600mL、约80mL至约550mL、约80mL至约500mL、约80mL至约450mL、约80mL至约400mL、约80mL至约350mL、约80mL至约300mL、约80mL至约250mL、约80mL至约200mL、约80mL至约180mL、约80mL至约160mL、约80mL至约140mL、约80mL至约120mL、约80mL至约100mL、约100mL至约5L、约100mL至约4.5L、约100mL至约4L、约100mL至约3.5L、约100mL至约3L、约100mL至约2.5L、约100mL至约2L、约100mL至约1.5L、约100mL至约1.0L、约100mL至约950mL、约100mL至约900mL、约100mL至约850mL、约100mL至约800mL、约100mL至约750mL、约100mL至约700mL、约100mL至约650mL、约100mL至约600mL、约100mL至约550mL、约100mL至约500mL、约100mL至约450mL、约100mL至约400mL、约100mL至约350mL、约100mL至约300mL、约100mL至约250mL、约100mL至约200mL、约100mL至约180mL、约100mL至约160mL、约100mL至约140mL、约100mL至约120mL、约120mL至约5L、约120mL至约4.5L、约120mL至约4L、约120mL至约3.5L、约120mL至约3L、约120mL至约2.5L、约120mL至约2L、约120mL至约1.5L、约120mL至约1.0L、约120mL至约950mL、约120mL至约900mL、约120mL至约850mL、约120mL至约800mL、约120mL至约750mL、约120mL至约700mL、约120mL至约650mL、约120mL至约600mL、约120mL至约550mL、约120mL至约500mL、约120mL至约450mL、约120mL至约400mL、约120mL至约350mL、约120mL至约300mL、约120mL至约250mL、约120mL至约200mL、约120mL至约180mL、约120mL至约160mL、约120mL至约140mL、约140mL至约5L、约140mL至约4.5L、约140mL至约4L、约140mL至约3.5L、约140mL至约3L、约140mL至约2.5L、约140mL至约2L、约140mL至约1.5L、约140mL至约1.0L、约140mL至约950mL、约140mL至约900mL、约140mL至约850mL、约140mL至约800mL、约140mL至约750mL、约140mL至约700mL、约140mL至约650mL、约140mL至约600mL、约140mL至约550mL、约140mL至约500mL、约140mL至约450mL、约140mL至约400mL、约140mL至约350mL、约140mL至约300mL、约140mL至约250mL、约140mL至约200mL、约140mL至约180mL、约140mL至约160mL、约160mL至约5L、约160mL至约4.5L、约160mL至约4L、约160mL至约3.5L、约160mL至约3L、约160mL至约2.5L、约160mL至约2L、约160mL至约1.5L、约160mL至约1.0L、约160mL至约950mL、约160mL至约900mL、约160mL至约850mL、约160mL至约800mL、约160mL至约750mL、约160mL至约700mL、约160mL至约650mL、约160mL至约600mL、约160mL至约550mL、约160mL至约500mL、约160mL至约450mL、约160mL至约400mL、约160mL至约350mL、约160mL至约300mL、约160mL至约250mL、约160mL至约200mL、约160mL至约180mL、约180mL至约5L、约180mL至约4.5L、约180mL至约4L、约180mL至约3.5L、约180mL至约3L、约180mL至约2.5L、约180mL至约2L、约180mL至约1.5L、约180mL至约1.0L、约180mL至约950mL、约180mL至约900mL、约180mL至约850mL、约180mL至约800mL、约180mL至约750mL、约180mL至约700mL、约180mL至约650mL、约180mL至约600mL、约180mL至约550mL、约180mL至约500mL、约180mL至约450mL、约180mL至约400mL、约180mL至约350mL、约180mL至约300mL、约180mL至约250mL、约180mL至约200mL、约200mL至约5L、约200mL至约4.5L、约200mL至约4L、约200mL至约3.5L、约200mL至约3L、约200mL至约2.5L、约200mL至约2L、约200mL至约1.5L、约200mL至约1.0L、约200mL至约950mL、约200mL至约900mL、约200mL至约850mL、约200mL至约800mL、约200mL至约750mL、约200mL至约700mL、约200mL至约650mL、约200mL至约600mL、约200mL至约550mL、约200mL至约500mL、约200mL至约450mL、约200mL至约400mL、约200mL至约350mL、约200mL至约300mL、约200mL至约250mL、约250mL至约5L、约250mL至约4.5L、约250mL至约4L、约250mL至约3.5L、约25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在一些实施方案中，摇瓶可在约0.1xg至约50xg的搅动下温育(例如，约0.1xg至约40xg、约0.1xg至约30xg、约0.1xg至约20xg、约0.1xg至约15xg、约0.1xg至约10xg、约0.1xg至约9.5xg、约0.1xg至约9.0xg、约0.1xg至约8.5xg、约0.1xg至约8.0xg、约0.1xg至约7.5xg、约0.1xg至约7.0xg、约0.1xg至约6.5xg、约0.1xg至约6.0xg、约0.1xg至约5.5xg、约0.1xg至约5.0xg、约0.1xg至约4.5xg、约0.1xg至约4.1xg、约0.1xg至约4.0xg、约0.1xg至约3.5xg、约0.1xg至约3.0xg、约0.1xg至约2.5xg、约0.1xg至约2.0xg、约0.1xg至约1.78xg、约0.1xg至约1.6xg、约0.1xg至约1.4xg、约0.1xg至约1.2xg、约0.1xg至约1.0xg、约0.1xg至约0.8xg、约0.1xg至约0.6xg、约0.1xg至约0.4xg、约0.1xg至约0.23xg、约0.23xg至约50xg、约0.23xg至约40xg、约0.23xg至约30xg、约0.23xg至约20xg、约0.23xg至约15xg、约0.23xg至约10xg、约0.23xg至约9.5xg、约0.23xg至约9.0xg、约0.23xg至约8.5xg、约0.23xg至约8.0xg、约0.23xg至约7.5xg、约0.23xg至约7.0xg、约0.23xg至约6.5xg、约0.23xg至约6.0xg、约0.23xg至约5.5xg、约0.23xg至约5.0xg、约0.23xg至约4.5xg、约0.23xg至约4.1xg、约0.23xg至约4.0xg、约0.23xg至约3.5xg、约0.23xg至约3.0xg、约0.23xg至约2.5xg、约0.23xg至约2.0xg、约0.23xg至约1.78xg、约0.23xg至约1.6xg、约0.23xg至约1.4xg、约0.23xg至约1.2xg、约0.23xg至约1.0xg、约0.23xg至约0.8xg、约0.23xg至约0.6xg、约0.23xg至约0.4xg、约0.4xg至约50xg、约0.4xg至约40xg、约0.4xg至约30xg、约0.4xg至约20xg、约0.4xg至约15xg、约0.4xg至约10xg、约0.4xg至约9.5xg、约0.4xg至约9.0xg、约0.4xg至约8.5xg、约0.4xg至约8.0xg、约0.4xg至约7.5xg、约0.4xg至约7.0xg、约0.4xg至约6.5xg、约0.4xg至约6.0xg、约0.4xg至约5.5xg、约0.4xg至约5.0xg、约0.4xg至约4.5xg、约0.4xg至约4.1xg、约0.4xg至约4.0xg、约0.4xg至约3.5xg、约0.4xg至约3.0xg、约0.4xg至约2.5xg、约0.4xg至约2.0xg、约0.4xg至约1.78xg、约0.4xg至约1.6xg、约0.4xg至约1.4xg、约0.4xg至约1.2xg、约0.4xg至约1.0xg、约0.4xg至约0.8xg、约0.4xg至约0.6xg、约0.6xg至约50xg、约0.6xg至约40xg、约0.6xg至约30xg、约0.6xg至约20xg、约0.6xg至约15xg、约0.6xg至约10xg、约0.6xg至约9.5xg、约0.6xg至约9.0xg、约0.6xg至约8.5xg、约0.6xg至约8.0xg、约0.6xg至约7.5xg、约0.6xg至约7.0xg、约0.6xg至约6.5xg、约0.6xg至约6.0xg、约0.6xg至约5.5xg、约0.6xg至约5.0xg、约0.6xg至约4.5xg、约0.6xg至约4.1xg、约0.6xg至约4.0xg、约0.6xg至约3.5xg、约0.6xg至约3.0xg、约0.6xg至约2.5xg、约0.6xg至约2.0xg、约0.6xg至约1.78xg、约0.6xg至约1.6xg、约0.6xg至约1.4xg、约0.6xg至约1.2xg、约0.6xg至约1.0xg、约0.6xg至约0.8xg、约0.8xg至约50xg、约0.8xg至约40xg、约0.8xg至约30xg、约0.8xg至约20xg、约0.8xg至约15xg、约0.8xg至约10xg、约0.8xg至约9.5xg、约0.8xg至约9.0xg、约0.8xg至约8.5xg、约0.8xg至约8.0xg、约0.8xg至约7.5xg、约0.8xg至约7.0xg、约0.8xg至约6.5xg、约0.8xg至约6.0xg、约0.8xg至约5.5xg、约0.8xg至约5.0xg、约0.8xg至约4.5xg、约0.8xg至约4.1xg、约0.8xg至约4.0xg、约0.8xg至约3.5xg、约0.8xg至约3.0xg、约0.8xg至约2.5xg、约0.8xg至约2.0xg、约0.8xg至约1.78xg、约0.8xg至约1.6xg、约0.8xg至约1.4xg、约0.8xg至约1.2xg、约0.8xg至约1.0xg、约1.0xg至约50xg、约1.0xg至约40xg、约1.0xg至约30xg、约1.0xg至约20xg、约1.0xg至约15xg、约1.0xg至约10xg、约1.0xg至约9.5xg、约1.0xg至约9.0xg、约1.0xg至约8.5xg、约1.0xg至约8.0xg、约1.0xg至约7.5xg、约1.0xg至约7.0xg、约1.0xg至约6.5xg、约1.0xg至约6.0xg、约1.0xg至约5.5xg、约1.0xg至约5.0xg、约1.0xg至约4.5xg、约1.0xg至约4.1xg、约1.0xg至约4.0xg、约1.0xg至约3.5xg、约1.0xg至约3.0xg、约1.0xg至约2.5xg、约1.0xg至约2.0xg、约1.0xg至约1.78xg、约1.0xg至约1.6xg、约1.0xg至约1.4xg、约1.0xg至约1.2xg、约1.2xg至约50xg、约1.2xg至约40xg、约1.2xg至约30xg、约1.2xg至约20xg、约1.2xg至约15xg、约1.2xg至约10xg、约1.2xg至约9.5xg、约1.2xg至约9.0xg、约1.2xg至约8.5xg、约1.2xg至约8.0xg、约1.2xg至约7.5xg、约1.2xg至约7.0xg、约1.2xg至约6.5xg、约1.2xg至约6.0xg、约1.2xg至约5.5xg、约1.2xg至约5.0xg、约1.2xg至约4.5xg、约1.2xg至约4.1xg、约1.2xg至约4.0xg、约1.2xg至约3.5xg、约1.2xg至约3.0xg、约1.2xg至约2.5xg、约1.2xg至约2.0xg、约1.2xg至约1.78xg、约1.2xg至约1.6xg、约1.2xg至约1.4xg、约1.4xg至约50xg、约1.4xg至约40xg、约1.4xg至约30xg、约1.4xg至约20xg、约1.4xg至约15xg、约1.4xg至约10xg、约1.4xg至约9.5xg、约1.4xg至约9.0xg、约1.4xg至约8.5xg、约1.4xg至约8.0xg、约1.4xg至约7.5xg、约1.4xg至约7.0xg、约1.4xg至约6.5xg、约1.4xg至约6.0xg、约1.4xg至约5.5xg、约1.4xg至约5.0xg、约1.4xg至约4.5xg、约1.4xg至约4.1xg、约1.4xg至约4.0xg、约1.4xg至约3.5xg、约1.4xg至约3.0xg、约1.4xg至约2.5xg、约1.4xg至约2.0xg、约1.4xg至约1.78xg、约1.4xg至约1.6xg、约1.6xg至约50xg、约1.6xg至约40xg、约1.6xg至约30xg、约1.6xg至约20xg、约1.6xg至约15xg、约1.6xg至约10xg、约1.6xg至约9.5xg、约1.6xg至约9.0xg、约1.6xg至约8.5xg、约1.6xg至约8.0xg、约1.6xg至约7.5xg、约1.6xg至约7.0xg、约1.6xg至约6.5xg、约1.6xg至约6.0xg、约1.6xg至约5.5xg、约1.6xg至约5.0xg、约1.6xg至约4.5xg、约1.6xg至约4.1xg、约1.6xg至约4.0xg、约1.6xg至约3.5xg、约1.6xg至约3.0xg、约1.6xg至约2.5xg、约1.6xg至约2.0xg、约1.6xg至约1.78xg、约1.78xg至约50xg、约1.78xg至约40xg、约1.78xg至约30xg、约1.78xg至约20xg、约1.78xg至约15xg、约1.78xg至约10xg、约1.78xg至约9.5xg、约1.78xg至约9.0xg、约1.78xg至约8.5xg、约1.78xg至约8.0xg、约1.78xg至约7.5xg、约1.78xg至约7.0xg、约1.78xg至约6.5xg、约1.78xg至约6.0xg、约1.78xg至约5.5xg、约1.78xg至约5.0xg、约1.78xg至约4.5xg、约1.78xg至约4.1xg、约1.78xg至约4.0xg、约1.78xg至约3.5xg、约1.78xg至约3.0xg、约1.78xg至约2.5xg、约1.78xg至约2.0xg、约2.0xg至约50xg、约2.0xg至约40xg、约2.0xg至约30xg、约2.0xg至约20xg、约2.0xg至约15xg、约2.0xg至约10xg、约2.0xg至约9.5xg、约2.0xg至约9.0xg、约2.0xg至约8.5xg、约2.0xg至约8.0xg、约2.0xg至约7.5xg、约2.0xg至约7.0xg、约2.0xg至约6.5xg、约2.0xg至约6.0xg、约2.0xg至约5.5xg、约2.0xg至约5.0xg、约2.0xg至约4.5xg、约2.0xg至约4.1xg、约2.0xg至约4.0xg、约2.0xg至约3.5xg、约2.0xg至约3.0xg、约2.0xg至约2.5xg、约2.5xg至约50xg、约2.5xg至约40xg、约2.5xg至约30xg、约2.5xg至约20xg、约2.5xg至约15xg、约2.5xg至约10xg、约2.5xg至约9.5xg、约2.5xg至约9.0xg、约2.5xg至约8.5xg、约2.5xg至约8.0xg、约2.5xg至约7.5xg、约2.5xg至约7.0xg、约2.5xg至约6.5xg、约2.5xg至约6.0xg、约2.5xg至约5.5xg、约2.5xg至约5.0xg、约2.5xg至约4.5xg、约2.5xg至约4.1xg、约2.5xg至约4.0xg、约2.5xg至约3.5xg、约2.5xg至约3.0xg、约3.0xg至约50xg、约3.0xg至约40xg、约3.0xg至约30xg、约3.0xg至约20xg、约3.0xg至约15xg、约3.0xg至约10xg、约3.0xg至约9.5xg、约3.0xg至约9.0xg、约3.0xg至约8.5xg、约3.0xg至约8.0xg、约3.0xg至约7.5xg、约3.0xg至约7.0xg、约3.0xg至约6.5xg、约3.0xg至约6.0xg、约3.0xg至约5.5xg、约3.0xg至约5.0xg、约3.0xg至约4.5xg、约3.0xg至约4.1xg、约3.0xg至约4.0xg、约3.0xg至约3.5xg、约3.5xg至约50xg、约3.5xg至约40xg、约3.5xg至约30xg、约3.5xg至约20xg、约3.5xg至约15xg、约3.5xg至约10xg、约3.5xg至约9.5xg、约3.5xg至约9.0xg、约3.5xg至约8.5xg、约3.5xg至约8.0xg、约3.5xg至约7.5xg、约3.5xg至约7.0xg、约3.5xg至约6.5xg、约3.5xg至约6.0xg、约3.5xg至约5.5xg、约3.5xg至约5.0xg、约3.5xg至约4.5xg、约3.5xg至约4.1xg、约3.5xg至约4.0xg、约4.0xg至约50xg、约4.0xg至约40xg、约4.0xg至约30xg、约4.0xg至约20xg、约4.0xg至约15xg、约4.0xg至约10xg、约4.0xg至约9.5xg、约4.0xg至约9.0xg、约4.0xg至约8.5xg、约4.0xg至约8.0xg、约4.0xg至约7.5xg、约4.0xg至约7.0xg、约4.0xg至约6.5xg、约4.0xg至约6.0xg、约4.0xg至约5.5xg、约4.0xg至约5.0xg、约4.0xg至约4.5xg、约4.0xg至约4.1xg、约4.1xg至约50xg、约4.1xg至约40xg、约4.1xg至约30xg、约4.1xg至约20xg、约4.1xg至约15xg、约4.1xg至约10xg、约4.1xg至约9.5xg、约4.1xg至约9.0xg、约4.1xg至约8.5xg、约4.1xg至约8.0xg、约4.1xg至约7.5xg、约4.1xg至约7.0xg、约4.1xg至约6.5xg、约4.1xg至约6.0xg、约4.1xg至约5.5xg、约4.1xg至约5.0xg、约4.1xg至约4.5xg、约4.5xg至约50xg、约4.5xg至约40xg、约4.5xg至约30xg、约4.5xg至约20xg、约4.5xg至约15xg、约4.5xg至约10xg、约4.5xg至约9.5xg、约4.5xg至约9.0xg、约4.5xg至约8.5xg、约4.5xg至约8.0xg、约4.5xg至约7.5xg、约4.5xg至约7.0xg、约4.5xg至约6.5xg、约4.5xg至约6.0xg、约4.5xg至约5.5xg、约4.5xg至约5.0xg、约5.0xg至约50xg、约5.0xg至约40xg、约5.0xg至约30xg、约5.0xg至约20xg、约5.0xg至约15xg、约5.0xg至约10xg、约5.0xg至约9.5xg、约5.0xg至约9.0xg、约5.0xg至约8.5xg、约5.0xg至约8.0xg、约5.0xg至约7.5xg、约5.0xg至约7.0xg、约5.0xg至约6.5xg、约5.0xg至约6.0xg、约5.0xg至约5.5xg、约5.5xg至约50xg、约5.5xg至约40xg、约5.5xg至约30xg、约5.5xg至约20xg、约5.5xg至约15xg、约5.5xg至约10xg、约5.5xg至约9.5xg、约5.5xg至约9.0xg、约5.5xg至约8.5xg、约5.5xg至约8.0xg、约5.5xg至约7.5xg、约5.5xg至约7.0xg、约5.5xg至约6.5xg、约5.5xg至约6.0xg、约6.0xg至约50xg、约6.0xg至约40xg、约6.0xg至约30xg、约6.0xg至约20xg、约6.0xg至约15xg、约6.0xg至约10xg、约6.0xg至约9.5xg、约6.0xg至约9.0xg、约6.0xg至约8.5xg、约6.0xg至约8.0xg、约6.0xg至约7.5xg、约6.0xg至约7.0xg、约6.0xg至约6.5xg、约6.5xg至约50xg、约6.5xg至约40xg、约6.5xg至约30xg、约6.5xg至约20xg、约6.5xg至约15xg、约6.5xg至约10xg、约6.5xg至约9.5xg、约6.5xg至约9.0xg、约6.5xg至约8.5xg、约6.5xg至约8.0xg、约6.5xg至约7.5xg、约6.5xg至约7.0xg、约7.0xg至约50xg、约7.0xg至约40xg、约7.0xg至约30xg、约7.0xg至约20xg、约7.0xg至约15xg、约7.0xg至约10xg、约7.0xg至约9.5xg、约7.0xg至约9.0xg、约7.0xg至约8.5xg、约7.0xg至约8.0xg、约7.0xg至约7.5xg、约7.5xg至约50xg、约7.5xg至约40xg、约7.5xg至约30xg、约7.5xg至约20xg、约7.5xg至约15xg、约7.5xg至约10xg、约7.5xg至约9.5xg、约7.5xg至约9.0xg、约7.5xg至约8.5xg、约7.5xg至约8.0xg、约8.0xg至约50xg、约8.0xg至约40xg、约8.0xg至约30xg、约8.0xg至约20xg、约8.0xg至约15xg、约8.0xg至约10xg、约8.0xg至约9.5xg、约8.0xg至约9.0xg、约8.0xg至约8.5xg、约8.5xg至约50xg、约8.5xg至约40xg、约8.5xg至约30xg、约8.5xg至约20xg、约8.5xg至约15xg、约8.5xg至约10xg、约8.5xg至约9.5xg、约8.5xg至约9.0xg、约9.0xg至约50xg、约9.0xg至约40xg、约9.0xg至约30xg、约9.0xg至约20xg、约9.0xg至约15xg、约9.0xg至约10xg、约9.0xg至约9.5xg、约9.5xg至约50xg、约9.5xg至约40xg、约9.5xg至约30xg、约9.5xg至约20xg、约9.5xg至约15xg、约9.5xg至约10xg、约10xg至约50xg、约10xg至约40xg、约10xg至约30xg、约10xg至约20xg、约10xg至约15xg、约15xg至约50xg、约15xg至约40xg、约15xg至约30xg、约15xg至约20xg、约20xg至约50xg、约20xg至约40xg、约20xg至约30xg、约30xg至约50xg、约30xg至约40xg、或约40xg至约50xg)。

各种摇瓶是可商购的。摇瓶的其他非限制性方面是本领域已知的。

摇管

本文所述方法的一些方面包括摇管的使用。在一些实施方案中，摇管的体积可为约1mL至约500mL、约1mL至约450mL、约1mL至约400mL、约1mL至约350mL、约1mL至约300mL、约1mL至约250mL、约1mL至约200mL、约1mL至约180mL、约1mL至约160mL、约1mL至约140mL、约1mL至约120mL、约1mL至约100mL、约1mL至约80mL、约1mL至约60mL、约1mL至约40mL、约1mL至约20mL、约1mL至约10mL、约1mL至约5mL、约1mL至约2mL、约2mL至约500mL、约2mL至约450mL、约2mL至约400mL、约2mL至约350mL、约2mL至约300mL、约2mL至约250mL、约2mL至约200mL、约2mL至约180mL、约2mL至约160mL、约2mL至约140mL、约2mL至约120mL、约2mL至约100mL、约2mL至约80mL、约2mL至约60mL、约2mL至约40mL、约2mL至约20mL、约2mL至约10mL、约2mL至约5mL、约5mL至约500mL、约5mL至约450mL、约5mL至约400mL、约5mL至约350mL、约5mL至约300mL、约5mL至约250mL、约5mL至约200mL、约5mL至约180mL、约5mL至约160mL、约5mL至约140mL、约5mL至约120mL、约5mL至约100mL、约5mL至约80mL、约5mL至约60mL、约5mL至约40mL、约5mL至约20mL、约5mL至约10mL、约10mL至约500mL、约10mL至约450mL、约10mL至约400mL、约10mL至约350mL、约10mL至约300mL、约10mL至约250mL、约10mL至约200mL、约10mL至约180mL、约10mL至约160mL、约10mL至约140mL、约10mL至约120mL、约10mL至约100mL、约10mL至约80mL、约10mL至约60mL、约10mL至约40mL、约10mL至约20mL、约20mL至约500mL、约20mL至约450mL、约20mL至约400mL、约20mL至约350mL、约20mL至约300mL、约20mL至约250mL、约20mL至约200mL、约20mL至约180mL、约20mL至约160mL、约20mL至约140mL、约20mL至约120mL、约20mL至约100mL、约20mL至约80mL、约20mL至约60mL、约20mL至约40mL、约40mL至约500mL、约40mL至约450mL、约40mL至约400mL、约40mL至约350mL、约40mL至约300mL、约40mL至约250mL、约40mL至约200mL、约40mL至约180mL、约40mL至约160mL、约40mL至约140mL、约40mL至约120mL、约40mL至约100mL、约40mL至约80mL、约40mL至约60mL、约60mL至约500mL、约60mL至约450mL、约60mL至约400mL、约60mL至约350mL、约60mL至约300mL、约60mL至约250mL、约60mL至约200mL、约60mL至约180mL、约60mL至约160mL、约60mL至约140mL、约60mL至约120mL、约60mL至约100mL、约60mL至约80mL、约80mL至约500mL、约80mL至约450mL、约80mL至约400mL、约80mL至约350mL、约80mL至约300mL、约80mL至约250mL、约80mL至约200mL、约80mL至约180mL、约80mL至约160mL、约80mL至约140mL、约80mL至约120mL、约80mL至约100mL、约100mL至约500mL、约100mL至约450mL、约100mL至约400mL、约100mL至约350mL、约100mL至约300mL、约100mL至约250mL、约100mL至约200mL、约100mL至约180mL、约100mL至约160mL、约100mL至约140mL、约100mL至约120mL、约120mL至约500mL、约120mL至约450mL、约120mL至约400mL、约120mL至约350mL、约120mL至约300mL、约120mL至约250mL、约120mL至约200mL、约120mL至约180mL、约120mL至约160mL、约120mL至约140mL、约140mL至约500mL、约140mL至约450mL、约140mL至约400mL、约140mL至约350mL、约140mL至约300mL、约140mL至约250mL、约140mL至约200mL、约140mL至约180mL、约140mL至约160mL、约160mL至约500mL、约160mL至约450mL、约160mL至约400mL、约160mL至约350mL、约160mL至约300mL、约160mL至约250mL、约160mL至约200mL、约160mL至约180mL、约180mL至约500mL、约180mL至约450mL、约180mL至约400mL、约180mL至约350mL、约180mL至约300mL、约180mL至约250mL、约180mL至约200mL、约200mL至约500mL、约200mL至约450mL、约200mL至约400mL、约200mL至约350mL、约200mL至约300mL、约200mL至约250mL、约250mL至约500mL、约250mL至约450mL、约250mL至约400mL、约250mL至约350mL、约250mL至约300mL、约300mL至约500mL、约300mL至约450mL、约300mL至约400mL、约300mL至约350mL、约350mL至约500mL、约350mL至约450mL、约350mL至约400mL、约400mL至约500mL、约400mL至约450mL、或约450mL至约500mL。

在一些实施方案中，摇管可在约0.1xg至约50xg(或本文所述的该范围的任何子范围)的搅动下温育。

各种摇管是可商购的。摇管的其他非限制性方面是本领域已知的。

培养袋

本文所述方法的一些方面包括培养袋的使用。在一些实施方案中，培养袋的体积可为约50mL至约500L、约50mL至约400L、约50mL至约300L、约50mL至约200L、约50mL至约100L、约50mL至约50L、50mL至约25L、约50mL至约20L、约50mL至约15L、约50mL至约10L、约50mL至约8L、约50mL至约6L、约50mL至约5L、约50mL至约4L、约50mL至约3L、约50mL至约2.5L、约50mL至约2.0L、约50mL至约1.8L、约50mL至约1.6L、约50mL至约1.4L、约50mL至约1.2L、约50mL至约1.0L、约50mL至约900mL、约50mL至约800mL、约50mL至约700mL、约50mL至约600mL、约50mL至约500mL、约50mL至约450mL、约50mL至约400mL、约50mL至约350mL、约50mL至约300mL、约50mL至约250mL、约50mL至约200mL、约50mL至约150mL、约50mL至约100mL、约50mL至约75mL、约75mL至约500L、约75mL至约400L、约75mL至约300L、约75mL至约200L、约75mL至约100L、约75mL至约50L、75mL至约25L、约75mL至约20L、约75mL至约15L、约75mL至约10L、约75mL至约8L、约75mL至约6L、约75mL至约5L、约75mL至约4L、约75mL至约3L、约75mL至约2.5L、约75mL至约2.0L、约75mL至约1.8L、约75mL至约1.6L、约75mL至约1.4L、约75mL至约1.2L、约75mL至约1.0L、约75mL至约900mL、约75mL至约800mL、约75mL至约700mL、约75mL至约600mL、约75mL至约500mL、约75mL至约450mL、约75mL至约400mL、约75mL至约350mL、约75mL至约300mL、约75mL至约250mL、约75mL至约200mL、约75mL至约150mL、约75mL至约100mL、约100mL至约500L、约100mL至约400L、约100mL至约300L、约100mL至约200L、约100mL至约100L、约100mL至约50L、100mL至约25L、约100mL至约20L、约100mL至约15L、约100mL至约10L、约100mL至约8L、约100mL至约6L、约100mL至约5L、约100mL至约4L、约100mL至约3L、约100mL至约2.5L、约100mL至约2.0L、约100mL至约1.8L、约100mL至约1.6L、约100mL至约1.4L、约100mL至约1.2L、约100mL至约1.0L、约100mL至约900mL、约100mL至约800mL、约100mL至约700mL、约100mL至约600mL、约100mL至约500mL、约100mL至约450mL、约100mL至约400mL、约100mL至约350mL、约100mL至约300mL、约100mL至约250mL、约100mL至约200mL、约100mL至约150mL、约150mL至约500L、约150mL至约400L、约150mL至约300L、约150mL至约200L、约150mL至约100L、约150mL至约50L、150mL至约25L、约150mL至约20L、约150mL至约15L、约150mL至约10L、约150mL至约8L、约150mL至约6L、约150mL至约5L、约150mL至约4L、约150mL至约3L、约150mL至约2.5L、约150mL至约2.0L、约150mL至约1.8L、约150mL至约1.6L、约150mL至约1.4L、约150mL至约1.2L、约150mL至约1.0L、约150mL至约900mL、约150mL至约800mL、约150mL至约700mL、约150mL至约600mL、约150mL至约500mL、约150mL至约450mL、约150mL至约400mL、约150mL至约350mL、约150mL至约300mL、约150mL至约250mL、约150mL至约200mL、约200mL至约500L、约200mL至约400L、约200mL至约300L、约200mL至约200L、约200mL至约100L、约200mL至约50L、200mL至约25L、约200mL至约20L、约200mL至约15L、约200mL至约10L、约200mL至约8L、约200mL至约6L、约200mL至约5L、约200mL至约4L、约200mL至约3L、约200mL至约2.5L、约200mL至约2.0L、约200mL至约1.8L、约200mL至约1.6L、约200mL至约1.4L、约200mL至约1.2L、约200mL至约1.0L、约200mL至约900mL、约200mL至约800mL、约200mL至约700mL、约200mL至约600mL、约200mL至约500mL、约200mL至约450mL、约200mL至约400mL、约200mL至约350mL、约200mL至约300mL、约200mL至约250mL、约250mL至约500L、约250mL至约400L、约250mL至约300L、约250mL至约200L、约250mL至约100L、约250mL至约50L、250mL至约25L、约250mL至约20L、约250mL至约15L、约250mL至约10L、约250mL至约8L、约250mL至约6L、约250mL至约5L、约250mL至约4L、约250mL至约3L、约250mL至约2.5L、约250mL至约2.0L、约250mL至约1.8L、约250mL至约1.6L、约250mL至约1.4L、约250mL至约1.2L、约250mL至约1.0L、约250mL至约900mL、约250mL至约800mL、约250mL至约700mL、约250mL至约600mL、约250mL至约500mL、约250mL至约450mL、约250mL至约400mL、约250mL至约350mL、约250mL至约300mL、约300mL至约500L、约300mL至约400L、约300mL至约300L、约300mL至约200L、约300mL至约100L、约300mL至约50L、300mL至约25L、约300mL至约20L、约300mL至约15L、约300mL至约10L、约300mL至约8L、约300mL至约6L、约300mL至约5L、约300mL至约4L、约300mL至约3L、约300mL至约2.5L、约300mL至约2.0L、约300mL至约1.8L、约300mL至约1.6L、约300mL至约1.4L、约300mL至约1.2L、约300mL至约1.0L、约300mL至约900mL、约300mL至约800mL、约300mL至约700mL、约300mL至约600mL、约300mL至约500mL、约300mL至约450mL、约300mL至约400mL、约300mL至约350mL、约350mL至约500L、约350mL至约400L、约350mL至约300L、约350mL至约200L、约350mL至约100L、约350mL至约50L、350mL至约25L、约350mL至约20L、约350mL至约15L、约350mL至约10L、约350mL至约8L、约350mL至约6L、约350mL至约5L、约350mL至约4L、约350mL至约3L、约350mL至约2.5L、约350mL至约2.0L、约350mL至约1.8L、约350mL至约1.6L、约350mL至约1.4L、约350mL至约1.2L、约350mL至约1.0L、约350mL至约900mL、约350mL至约800mL、约350mL至约700mL、约350mL至约600mL、约350mL至约500mL、约350mL至约450mL、约350mL至约400mL、约400mL至约500L、约400mL至约400L、约400mL至约300L、约400mL至约200L、约400mL至约100L、约400mL至约50L、400mL至约25L、约400mL至约20L、约400mL至约15L、约400mL至约10L、约400mL至约8L、约400mL至约6L、约400mL至约5L、约400mL至约4L、约400mL至约3L、约400mL至约2.5L、约400mL至约2.0L、约400mL至约1.8L、约400mL至约1.6L、约400mL至约1.4L、约400mL至约1.2L、约400mL至约1.0L、约400mL至约900mL、约400mL至约800mL、约400mL至约700mL、约400mL至约600mL、约400mL至约500mL、约400mL至约450mL、约450mL至约500L、约450mL至约400L、约450mL至约300L、约450mL至约200L、约450mL至约100L、约450mL至约50L、450mL至约25L、约450mL至约20L、约450mL至约15L、约450mL至约10L、约450mL至约8L、约450mL至约6L、约450mL至约5L、约450mL至约4L、约450mL至约3L、约450mL至约2.5L、约450mL至约2.0L、约450mL至约1.8L、约450mL至约1.6L、约450mL至约1.4L、约450mL至约1.2L、约450mL至约1.0L、约450mL至约900mL、约450mL至约800mL、约450mL至约700mL、约450mL至约600mL、约450mL至约500mL、约500mL至约500L、约500mL至约400L、约500mL至约300L、约500mL至约200L、约500mL至约100L、约500mL至约50L、500mL至约25L、约500mL至约20L、约500mL至约15L、约500mL至约10L、约500mL至约8L、约500mL至约6L、约500mL至约5L、约500mL至约4L、约500mL至约3L、约500mL至约2.5L、约500mL至约2.0L、约500mL至约1.8L、约500mL至约1.6L、约500mL至约1.4L、约500mL至约1.2L、约500mL至约1.0L、约500mL至约900mL、约500mL至约800mL、约500mL至约700mL、约500mL至约600mL、约600mL至约500L、约600mL至约400L、约600mL至约300L、约600mL至约200L、约600mL至约100L、约600mL至约50L、600mL至约25L、约600mL至约20L、约600mL至约15L、约600mL至约10L、约600mL至约8L、约600mL至约6L、约600mL至约5L、约600mL至约4L、约600mL至约3L、约600mL至约2.5L、约600mL至约2.0L、约600mL至约1.8L、约600mL至约1.6L、约600mL至约1.4L、约600mL至约1.2L、约600mL至约1.0L、约600mL至约900mL、约600mL至约800mL、约600mL至约700mL、约700mL至约500L、约700mL至约400L、约700mL至约300L、约700mL至约200L、约700mL至约100L、约700mL至约50L、700mL至约25L、约700mL至约20L、约700mL至约15L、约700mL至约10L、约700mL至约8L、约700mL至约6L、约700mL至约5L、约700mL至约4L、约700mL至约3L、约700mL至约2.5L、约700mL至约2.0L、约700mL至约1.8L、约700mL至约1.6L、约700mL至约1.4L、约700mL至约1.2L、约700mL至约1.0L、约700mL至约900mL、约700mL至约800mL、约800mL至约500L、约800mL至约400L、约800mL至约300L、约800mL至约200L、约800mL至约100L、约800mL至约50L、800mL至约25L、约800mL至约20L、约800mL至约15L、约800mL至约10L、约800mL至约8L、约800mL至约6L、约800mL至约5L、约800mL至约4L、约800mL至约3L、约800mL至约2.5L、约800mL至约2.0L、约800mL至约1.8L、约800mL至约1.6L、约800mL至约1.4L、约800mL至约1.2L、约800mL至约1.0L、约800mL至约900mL、约900mL至约500L、约900mL至约400L、约900mL至约300L、约900mL至约200L、约900mL至约100L、约900mL至约50L、900mL至约25L、约900mL至约20L、约900mL至约15L、约900mL至约10L、约900mL至约8L、约900mL至约6L、约900mL至约5L、约900mL至约4L、约900mL至约3L、约900mL至约2.5L、约900mL至约2.0L、约900mL至约1.8L、约900mL至约1.6L、约900mL至约1.4L、约900mL至约1.2L、约900mL至约1.0L、约1.0L至约500L、约1.0L至约400L、约1.0L至约300L、约1.0L至约200L、约1.0L至约100L、约1.0L至约50L、1.0L至约25L、约1.0L至约20L、约1.0L至约15L、约1.0L至约10L、约1.0L至约8L、约1.0L至约6L、约1.0L至约5L、约1.0L至约4L、约1.0L至约3L、约1.0L至约2.5L、约1.0L至约2.0L、约1.0L至约1.8L、约1.0L至约1.6L、约1.0L至约1.4L、约1.0L至约1.2L、约1.2L至约500L、约1.2L至约400L、约1.2L至约300L、约1.2L至约200L、约1.2L至约100L、约1.2L至约50L、1.2L至约25L、约1.2L至约20L、约1.2L至约15L、约1.2L至约10L、约1.2L至约8L、约1.2L至约6L、约1.2L至约5L、约1.2L至约4L、约1.2L至约3L、约1.2L至约2.5L、约1.2L至约2.0L、约1.2L至约1.8L、约1.2L至约1.6L、约1.2L至约1.4L、约1.4L至约500L、约1.4L至约400L、约1.4L至约300L、约1.4L至约200L、约1.4L至约100L、约1.4L至约50L、1.4L至约25L、约1.4L至约20L、约1.4L至约15L、约1.4L至约10L、约1.4L至约8L、约1.4L至约6L、约1.4L至约5L、约1.4L至约4L、约1.4L至约3L、约1.4L至约2.5L、约1.4L至约2.0L、约1.4L至约1.8L、约1.4L至约1.6L、约1.6L至约500L、约1.6L至约400L、约1.6L至约300L、约1.6L至约200L、约1.6L至约100L、约1.6L至约50L、1.6L至约25L、约1.6L至约20L、约1.6L至约15L、约1.6L至约10L、约1.6L至约8L、约1.6L至约6L、约1.6L至约5L、约1.6L至约4L、约1.6L至约3L、约1.6L至约2.5L、约1.6L至约2.0L、约1.6L至约1.8L、约1.8L至约500L、约1.8L至约400L、约1.8L至约300L、约1.8L至约200L、约1.8L至约100L、约1.8L至约50L、1.8L至约25L、约1.8L至约20L、约1.8L至约15L、约1.8L至约10L、约1.8L至约8L、约1.8L至约6L、约1.8L至约5L、约1.8L至约4L、约1.8L至约3L、约1.8L至约2.5L、约1.8L至约2.0L、约2.0L至约500L、约2.0L至约400L、约2.0L至约300L、约2.0L至约200L、约2.0L至约100L、约2.0L至约50L、2.0L至约25L、约2.0L至约20L、约2.0L至约15L、约2.0L至约10L、约2.0L至约8L、约2.0L至约6L、约2.0L至约5L、约2.0L至约4L、约2.0L至约3L、约2.0L至约2.5L、约2.5L至约500L、约2.5L至约400L、约2.5L至约300L、约2.5L至约200L、约2.5L至约100L、约2.5L至约50L、2.5L至约25L、约2.5L至约20L、约2.5L至约15L、约2.5L至约10L、约2.5L至约8L、约2.5L至约6L、约2.5L至约5L、约2.5L至约4L、约2.5L至约3L、约3L至约500L、约3L至约400L、约3L至约300L、约3L至约200L、约3L至约100L、约3L至约50L、3L至约25L、约3L至约20L、约3L至约15L、约3L至约10L、约3L至约8L、约3L至约6L、约3L至约5L、约3L至约4L、约4L至约500L、约4L至约400L、约4L至约300L、约4L至约200L、约4L至约100L、约4L至约50L、4L至约25L、约4L至约20L、约4L至约15L、约4L至约10L、约4L至约8L、约4L至约6L、约4L至约5L、约5L至约500L、约5L至约400L、约5L至约300L、约5L至约200L、约5L至约100L、约5L至约50L、5L至约25L、约5L至约20L、约5L至约15L、约5L至约10L、约5L至约8L、约5L至约6L、约6L至约500L、约6L至约400L、约6L至约300L、约6L至约200L、约6L至约100L、约6L至约50L、6L至约25L、约6L至约20L、约6L至约15L、约6L至约10L、约6L至约8L、约8L至约500L、约8L至约400L、约8L至约300L、约8L至约200L、约8L至约100L、约8L至约50L、8L至约25L、约8L至约20L、约8L至约15L、约8L至约10L、约10L至约500L、约10L至约400L、约10L至约300L、约10L至约200L、约10L至约100L、约10L至约50L、10L至约25L、约10L至约20L、约10L至约15L、约15L至约500L、约15L至约400L、约15L至约300L、约15L至约200L、约15L至约100L、约15L至约50L、15L至约25L、约15L至约20L、约20L至约500L、约20L至约400L、约20L至约300L、约20L至约200L、约20L至约100L、约20L至约50L、20L至约25L、约25L至约500L、约25L至约400L、约25L至约300L、约25L至约200L、约25L至约100L、约25L至约50L、约50L至约500L、约50L至约400L、约50L至约300L、约50L至约200L、约50L至约100L、约100L至约500L、约100L至约400L、约100L至约300L、约100L至约200L、约200L至约500L、约200L至约400L、约200L至约300L、约300L至约500L、约300L至约400L、或约400L至约500L。

在一些实施方案中，培养袋可以下列摇动速率进行温育：约5个摇动循环/分钟至约40个摇动循环/分钟、约5个摇动循环/分钟至约35个摇动循环/分钟、约5个摇动循环/分钟至约30个摇动循环/分钟、约5个摇动循环/分钟至约25个摇动循环/分钟、约5个摇动循环/分钟至约20个摇动循环/分钟、约5个摇动循环/分钟至约15个摇动循环/分钟、约5个摇动循环/分钟至约10个摇动循环/分钟、约10个摇动循环/分钟至约40个摇动循环/分钟、约10个摇动循环/分钟至约35个摇动循环/分钟、约10个摇动循环/分钟至约30个摇动循环/分钟、约10个摇动循环/分钟至约25个摇动循环/分钟、约10个摇动循环/分钟至约20个摇动循环/分钟、约10个摇动循环/分钟至约15个摇动循环/分钟、约15个摇动循环/分钟至约40个摇动循环/分钟、约15个摇动循环/分钟至约35个摇动循环/分钟、约15个摇动循环/分钟至约30个摇动循环/分钟、约15个摇动循环/分钟至约25个摇动循环/分钟、约15个摇动循环/分钟至约20个摇动循环/分钟、约20个摇动循环/分钟至约40个摇动循环/分钟、约20个摇动循环/分钟至约35个摇动循环/分钟、约20个摇动循环/分钟至约30个摇动循环/分钟、约20个摇动循环/分钟至约25个摇动循环/分钟、约25个摇动循环/分钟至约40个摇动循环/分钟、约25个摇动循环/分钟至约35个摇动循环/分钟、约25个摇动循环/分钟至约30个摇动循环/分钟、约30个摇动循环/分钟至约40个摇动循环/分钟、约30个摇动循环/分钟至约35个摇动循环/分钟、或约35个摇动循环/分钟至约40个摇动循环/分钟。

各种培养袋都是可商购的。培养袋的其他非限制性方面是本领域已知的。

生物反应器

本文所述方法的一些方面包括使用生物反应器(例如，灌注生物反应器)。在一些实施方案中，生物反应器(例如，灌注生物反应器)的体积可为约500mL至约15,000L、约500mL至约12,500L、约500mL至约10,000L、约500mL至约8,000L、约500mL至约6,000L、约500mL至约4,000L、约500mL至约2,000L、约500mL至约1,000L、约500mL至约800L、约500mL至约600L、约500mL至约400L、约500mL至约200L、约500mL至约100L、约500mL至约50L、约500mL至约20L、约500mL至约10L、约500mL至约5L、约500mL至约1L、约500mL至约750mL、约750mL至约15,000L、约750mL至约12,500L、约750mL至约10,000L、约750mL至约8,000L、约750mL至约6,000L、约750mL至约4,000L、约750mL至约2,000L、约750mL至约1,000L、约750mL至约800L、约750mL至约600L、约750mL至约400L、约750mL至约200L、约750mL至约100L、约750mL至约50L、约750mL至约20L、约750mL至约10L、约750mL至约5L、约750mL至约1L、约1L至约15,000L、约1L至约12,500L、约1L至约10,000L、约1L至约8,000L、约1L至约6,000L、约1L至约4,000L、约1L至约2,000L、约1L至约1,000L、约1L至约800L、约1L至约600L、约1L至约400L、约1L至约200L、约1L至约100L、约1L至约50L、约1L至约20L、约1L至约10L、约1L至约5L、约5L至约15,000L、约5L至约12,500L、约5L至约10,000L、约5L至约8,000L、约5L至约6,000L、约5L至约4,000L、约5L至约2,000L、约5L至约1,000L、约5L至约800L、约5L至约600L、约5L至约400L、约5L至约200L、约5L至约100L、约5L至约50L、约5L至约20L、约5L至约10L、约10L至约15,000L、约10L至约12,500L、约10L至约10,000L、约10L至约8,000L、约10L至约6,000L、约10L至约4,000L、约10L至约2,000L、约10L至约1,000L、约10L至约800L、约10L至约600L、约10L至约400L、约10L至约200L、约10L至约100L、约10L至约50L、约10L至约20L、约20L至约15,000L、约20L至约12,500L、约20L至约10,000L、约20L至约8,000L、约20L至约6,000L、约20L至约4,000L、约20L至约2,000L、约20L至约1,000L、约20L至约800L、约20L至约600L、约20L至约400L、约20L至约200L、约20L至约100L、约20L至约50L、约50L至约15,000L、约50L至约12,500L、约50L至约10,000L、约50L至约8,000L、约50L至约6,000L、约50L至约4,000L、约50L至约2,000L、约50L至约1,000L、约50L至约800L、约50L至约600L、约50L至约400L、约50L至约200L、约50L至约100L、约100L至约15,000L、约100L至约12,500L、约100L至约10,000L、约100L至约8,000L、约100L至约6,000L、约100L至约4,000L、约100L至约2,000L、约100L至约1,000L、约100L至约800L、约100L至约600L、约100L至约400L、约100L至约200L、约200L至约15,000L、约200L至约12,500L、约200L至约10,000L、约200L至约8,000L、约200L至约6,000L、约200L至约4,000L、约200L至约2,000L、约200L至约1,000L、约200L至约800L、约200L至约600L、约200L至约400L、约400L至约15,000L、约400L至约12,500L、约400L至约10,000L、约400L至约8,000L、约400L至约6,000L、约400L至约4,000L、约400L至约2,000L、约400L至约1,000L、约400L至约800L、约400L至约600L、约600L至约15,000L、约600L至约12,500L、约600L至约10,000L、约600L至约8,000L、约600L至约6,000L、约600L至约4,000L、约600L至约2,000L、约600L至约1,000L、约600L至约800L、约800L至约15,000L、约800L至约12,500L、约800L至约10,000L、约800L至约8,000L、约800L至约6,000L、约800L至约4,000L、约800L至约2,000L、约800L至约1,000L、约1,000L至约15,000L、约1,000L至约12,500L、约1,000L至约10,000L、约1,000L至约8,000L、约1,000L至约6,000L、约1,000L至约4,000L、约1,000L至约2,000L、约2,000L至约15,000L、约2,000L至约12,500L、约2,000L至约10,000L、约2,000L至约8,000L、约2,000L至约6,000L、约2,000L至约4,000L、约4,000L至约15,000L、约4,000L至约12,500L、约4,000L至约10,000L、约4,000L至约8,000L、约2,000L至约6,000L、约6,000L至约15,000L、约6,000L至约12,500L、约6,000L至约10,000L、约6,000L至约8,000L、约8,000L至约15,000L、约8,000L至约12,500L、约8,000L至约10,000L、约10,000L至约15,000L、约10,000L至约12,500L、或约12,500L至约15,000L。

多种生物反应器(例如灌注生物反应器)是可商购的。生物反应器(例如灌注生物反应器)的其他非限制性方面是本领域已知的。

提供第二细胞培养物(步骤A)

在本文所述的任何方法中，步骤(a)包括将一定体积的红系祖细胞(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性红系祖细胞)的第一细胞培养物放置到包含在器皿(例如生物反应器(例如，灌注生物反应器)、摇瓶、摇管或培养袋)内的第二培养基(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性第二培养基)中以提供第二细胞培养物(例如，具有的初始细胞密度为约0.1x10

在一些实施方案中，步骤(a)包括放置下列体积：约0.1mL至约5,000L、约0.1mL至约4,500L、约0.1mL至约4,000L、约0.1mL至约3,500L、约0.1mL至约3,000L、约0.1mL至约2,500L、约0.1mL至约2,000L、约0.1mL至约1,500L、约1mL至约1,000L、约0.1mL至约800mL、约0.1mL至约600mL、约0.1mL至约500mL、约0.1mL至约450mL、约0.1mL至约400mL、约0.1mL至约350mL、约0.1mL至约300mL、约0.1mL至约250mL、约0.1mL至约200mL、约0.1mL至约150mL、约0.1mL至约100mL、约0.1mL至约50mL、约0.1mL至约20mL、约0.1mL至约10mL、约0.1mL至约5mL、约5mL至约5,000L、约5mL至约4,500L、约5mL至约4,000L、约5mL至约3,500L、约5mL至约3,000L、约5mL至约2,500L、约5mL至约2,000L、约5mL至约1,500L、约5mL至约1,000L、约5mL至约800mL、约5mL至约600mL、约5mL至约500mL、约5mL至约450mL、约5mL至约400mL、约5mL至约350mL、约5mL至约300mL、约5mL至约250mL、约5mL至约200mL、约5mL至约150mL、约5mL至约100mL、约5mL至约50mL、约5mL至约20mL、约5mL至约10mL、约10mL至约5,000L、约10mL至约4,500L、约10mL至约4,000L、约10mL至约3,500L、约10mL至约3,000L、约10mL至约2,500L、约10mL至约2,000L、约10mL至约1,500L、约10mL至约1,000L、约10mL至约800mL、约10mL至约600mL、约10mL至约500mL、约10mL至约450mL、约10mL至约400mL、约10mL至约350mL、约10mL至约300mL、约10mL至约250mL、约10mL至约200mL、约10mL至约150mL、约10mL至约100mL、约10mL至约50mL、约10mL至约20mL、约20mL至约5,000L、约20mL至约4,500L、约20mL至约4,000L、约20mL至约3,500L、约20mL至约3,000L、约20mL至约2,500L、约20mL至约2,000L、约20mL至约1,500L、约20mL至约1,000L、约20mL至约800mL、约20mL至约600mL、约20mL至约500mL、约20mL至约450mL、约20mL至约400mL、约20mL至约350mL、约20mL至约300mL、约20mL至约250mL、约20mL至约200mL、约20mL至约150mL、约20mL至约100mL、约20mL至约50mL、约50mL至约5,000L、约50mL至约4,500L、约50mL至约4,000L、约50mL至约3,500L、约50mL至约3,000L、约50mL至约2,500L、约50mL至约2,000L、约50mL至约1,500L、约50mL至约1,000L、约50mL至约800mL、约50mL至约600mL、约50mL至约500mL、约50mL至约450mL、约50mL至约400mL、约50mL至约350mL、约50mL至约300mL、约50mL至约250mL、约50mL至约200mL、约50mL至约150mL、约50mL至约100mL、约100mL至约5,000L、约100mL至约4,500L、约100mL至约4,000L、约100mL至约3,500L、约100mL至约3,000L、约100mL至约2,500L、约100mL至约2,000L、约100mL至约1,500L、约100mL至约1,000L、约100mL至约800mL、约100mL至约600mL、约100mL至约500mL、约100mL至约450mL、约100mL至约400mL、约100mL至约350mL、约100mL至约300mL、约100mL至约250mL、约100mL至约200mL、约100mL至约150mL、约150mL至约5,000L、约150mL至约4,500L、约150mL至约4,000L、约150mL至约3,500L、约150mL至约3,000L、约150mL至约2,500L、约150mL至约2,000L、约150mL至约1,500L、约150mL至约1,000L、约150mL至约800mL、约150mL至约600mL、约150mL至约500mL、约150mL至约450mL、约150mL至约400mL、约150mL至约350mL、约150mL至约300mL、约150mL至约250mL、约150mL至约200mL、约200mL至约5,000L、约200mL至约4,500L、约200mL至约4,000L、约200mL至约3,500L、约200mL至约3,000L、约200mL至约2,500L、约200mL至约2,000L、约200mL至约1,500L、约200mL至约1,000L、约200mL至约800mL、约200mL至约600mL、约200mL至约500mL、约200mL至约450mL、约200mL至约400mL、约200mL至约350mL、约200mL至约300mL、约200mL至约250mL、约250mL至约5,000L、约250mL至约4,500L、约250mL至约4,000L、约250mL至约3,500L、约250mL至约3,000L、约250mL至约2,500L、约250mL至约2,000L、约250mL至约1,500L、约250mL至约1,000L、约250mL至约800mL、约250mL至约600mL、约250mL至约500mL、约250mL至约450mL、约250mL至约400mL、约250mL至约350mL、约250mL至约300mL、约300mL至约5,000L、约300mL至约4,500L、约300mL至约4,000L、约300mL至约3,500L、约300mL至约3,000L、约300mL至约2,500L、约300mL至约2,000L、约300mL至约1,500L、约300mL至约1,000L、约300mL至约800mL、约300mL至约600mL、约300mL至约500mL、约300mL至约450mL、约300mL至约400mL、约300mL至约350mL、约350mL至约5,000L、约350mL至约4,500L、约350mL至约4,000L、约350mL至约3,500L、约350mL至约3,000L、约350mL至约2,500L、约350mL至约2,000L、约350mL至约1,500L、约350mL至约1,000L、约350mL至约800mL、约350mL至约600mL、约350mL至约500mL、约350mL至约450mL、约350mL至约400mL、约400mL至约5,000L、约400mL至约4,500L、约400mL至约4,000L、约400mL至约3,500L、约400mL至约3,000L、约400mL至约2,500L、约400mL至约2,000L、约400mL至约1,500L、约400mL至约1,000L、约400mL至约800mL、约400mL至约600mL、约400mL至约500mL、约400mL至约450mL、约450mL至约5,000L、约450mL至约4,500L、约450mL至约4,000L、约450mL至约3,500L、约450mL至约3,000L、约450mL至约2,500L、约450mL至约2,000L、约450mL至约1,500L、约450mL至约1,000L、约450mL至约800mL、约450mL至约600mL、约450mL至约500mL、约500mL至约5,000L、约500mL至约4,500L、约500mL至约4,000L、约500mL至约3,500L、约500mL至约3,000L、约500mL至约2,500L、约500mL至约2,000L、约500mL至约1,500L、约500mL至约1,000L、约500mL至约800mL、约500mL至约600mL、约600mL至约5,000L、约600mL至约4,500L、约600mL至约4,000L、约600mL至约3,500L、约600mL至约3,000L、约600mL至约2,500L、约600mL至约2,000L、约600mL至约1,500L、约600mL至约1,000L、约600mL至约800mL、约800mL至约5,000L、约800mL至约4,500L、约800mL至约4,000L、约800mL至约3,500L、约800mL至约3,000L、约800mL至约2,500L、约800mL至约2,000L、约800mL至约1,500L、约800mL至约1,000L、约1,000L至约5,000L、约1,000L至约4,500L、约1,000L至约4,000L、约1,000L至约3,500L、约1,000L至约3,000L、约1,000L至约2,500L、约1,000L至约2,000L、约1,000L至约1,500L、约1,500L至约5,000L、约1,500L至约4,500L、约1,500L至约4,000L、约1,500L至约3,500L、约1,500L至约3,000L、约1,500L至约2,500L、约1,500L至约2,000L、约2,000L至约5,000L、约2,000L至约4,500L、约2,000L至约4,000L、约2,000L至约3,500L、约2,000L至约3,000L、约2,000L至约2,500L、约2,500L至约5,000L、约2,500L至约4,500L、约2,500L至约4,000L、约2,500L至约3,500L、约2,500L至约3,000L、约3,000L至约5,000L、约3,000L至约4,500L、约3,000L至约4,000L、约3,000L至约3,500L、约3,500L至约5,000L、约3,500L至约4,500L、约3,500L至约4,000L、约4,000L至约5,000L、约4,000L至约4,500L、约4,500L至约5,000L。

在一些实施方案中，步骤(a)包括放置下列体积：约10μL至约0.1mL、约10μL至约80μL、约10μL至约60μL、约10μL至约40μL、约10μL至约20μL、约20μL至约0.1mL、约20μL至约80μL、约20μL至约60μL、约20μL至约40μL、约40μL至约0.1mL、约40μL至约80μL、约40μL至约60μL、约60μL至约0.1mL、约60μL至约80μL,或约60μL至约0.1mL。

在一些实施方案中，步骤(a)中的器皿是生物反应器(例如，灌注生物反应器)(例如，具有本文所述的任何示例性体积的本文所述的任何示例性生物反应器)。可用于步骤(a)的生物反应器的其他实例和方面是本领域已知的。

在一些实施方案中，步骤(a)中的器皿是摇瓶(例如，本文所述的具有本文所述的任何示例性体积的任何示例性摇瓶)。可用于步骤(a)的摇瓶的其他实例和方面是本领域已知的。

在一些实施方案中，步骤(a)中的器皿是摇管(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性摇管)。可用于步骤(a)的摇管的其他实例和方面是本领域已知的。在一些实施方案中，步骤(a)中的器皿是培养袋(例如，本文所述的任何示例性培养袋)。

在一些实施方案中，第二培养基包含下列中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种或六种)：运铁蛋白(例如，脱铁运铁蛋白、全运铁蛋白或它们的组合)(例如，约1μg/mL至约500μg/mL运铁蛋白(例如，脱铁运铁蛋白、全运铁蛋白或它们的组合)或本文所述的该范围的任何子范围)、IL-3(例如，约0.1ng/mL至约200ng/mL IL-3或本文所述的该范围的任何子范围)、干细胞因子(SCF)(例如，约1ng/mL至约1μg/mL SCF或本文所述的该范围的任何子范围)、地塞米松(例如，约0.1nM至约200nM地塞米松或本文所述的该范围的任何子范围)、促红细胞生成素(EPO)或EPO-模拟肽(例如，约1ng/mL至约500ng/mL EPO或本文所述的该范围的任何子范围的EPO-模拟肽)和胰岛素(例如，约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素或本文所述的该范围的任何子范围的子范围)。在本文所述的任何第二培养基的一些实施方案中，第二培养基包含伊思柯夫改良杜氏培养基(Iscove's modified Dulbecco'smedium，IMDM)。在本文所述的任何第二培养基的一些实施方案中，第二培养基包含脂质(例如，脂质混合物)。在本文所述的任何第二培养基的一些实施方案中，第二培养基包含约0.1mM至约10mM(或本文所述的该范围的任何子范围)的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。在本文所述的任何第二培养基的一些实施方案中，第二培养基包含0.1％w/v至约4％w/v(例如，约0.1％w/v至约3.5％w/v、约0.1％w/v至约3.0％w/v、约0.1％w/v至约2.5％w/v、约0.1％w/v至约2.0％w/v、约0.1％w/v至约1.5％w/v、约0.1％w/v至约1.0％w/v、约0.1％w/v至约0.5％w/v、约0.2％w/v至约4％w/v、约0.2％w/v至约3.5％w/v、约0.2％w/v至约3.0％w/v、约0.2％w/v至约2.5％w/v、约0.2％w/v至约2.0％w/v、约0.2％w/v至约1.5％w/v、约0.2％w/v至约1.0％w/v、约0.2％w/v至约0.5％w/v、约0.5％w/v至约4％w/v、约0.5％w/v至约3.5％w/v、约0.5％w/v至约3.0％w/v、约0.5％w/v至约2.5％w/v、约0.5％w/v至约2.0％w/v、约0.5％w/v至约1.5％w/v、约0.5％w/v至约1.0％w/v、约1.0％w/v至约4％w/v、约1.0％w/v至约3.5％w/v、约1.0％w/v至约3.0％w/v、约1.0％w/v至约2.5％w/v、约1.0％w/v至约2.0％w/v、约1.0％w/v至约1.5％w/v、约1.5％w/v至约4％w/v、约1.5％w/v至约3.5％w/v、约1.5％w/v至约3.0％w/v、约1.5％w/v至约2.5％w/v、约1.5％w/v至约2.0％w/v、约2.0％w/v至约4％w/v、约2.0％w/v至约3.5％w/v、约2.0％w/v至约3.0％w/v、约2.0％w/v至约2.5％w/v、约2.5％w/v至约4％w/v、约2.5％w/v至约3.5％w/v、约2.5％w/v至约3.0％w/v、约3.0％w/v至约4％w/v、约3.0％w/v至约3.5％w/v、或约3.5％w/v至约4.0％w/v)的人血清白蛋白。在本文所述的任何第二培养基的一些实施方案中，第二培养基包含约0.1％w/v至约3％w/v(例如，约0.1％w/v至约2.5％w/v、约0.1％w/v至约2.0％w/v、约0.1％w/v至约1.5％w/v、约0.1％w/v至约1.0％w/v、约0.1％w/v至约0.5％w/v、约0.5％w/v至约3％w/v、约0.5％w/v至约2.5％w/v、约0.5％w/v至约2.0％w/v、约0.5％w/v至约1.5％w/v、约0.5％w/v至约1.0％w/v、约1.0％w/v至约3％w/v、约1.0％w/v至约2.5％w/v、约1.0％w/v至约2.0％w/v、约1.0％w/v至约1.5％w/v、约1.5％w/v至约3％w/v、约1.5％w/v至约2.5％w/v、约1.5％w/v至约2.0％w/v、约2.0％w/v至约3％w/v、约2.0％w/v至约2.5％w/v、或约2.5％w/v至约3％w/v)的泊洛沙姆-188(P188)。

在一些实施方案中，第二培养基包含约1μg/mL至约500μg/mL、约1μg/mL至约480μg/mL、约1μg/mL至约460μg/mL、约1μg/mL至约440μg/mL、约1μg/mL至约420μg/mL、约1μg/mL至约400μg/mL、约1μg/mL至约380μg/mL、约1μg/mL至约360μg/mL、约1μg/mL至约340μg/mL、约1μg/mL至约320μg/mL、约1μg/mL至约300μg/mL、约1μg/mL至约280μg/mL、约1μg/mL至约260μg/mL、约1μg/mL至约240μg/mL、约1μg/mL至约220μg/mL、约1μg/mL至约200μg/mL、约1μg/mL至约180μg/mL、约1μg/mL至约160μg/mL、约1μg/mL至约140μg/mL、约1μg/mL至约120μg/mL、约1μg/mL至约100μg/mL、约1μg/mL至约80μg/mL、约1μg/mL至约60μg/mL、约1μg/mL至约40μg/mL、约1μg/mL至约20μg/mL、约1μg/mL至约10μg/mL、约10μg/mL至约500μg/mL、约10μg/mL至约480μg/mL、约10μg/mL至约460μg/mL、约10μg/mL至约440μg/mL、约10μg/mL至约420μg/mL、约10μg/mL至约400μg/mL、约10μg/mL至约380μg/mL、约10μg/mL至约360μg/mL、约10μg/mL至约340μg/mL、约10μg/mL至约320μg/mL、约10μg/mL至约300μg/mL、约10μg/mL至约280μg/mL、约10μg/mL至约260μg/mL、约10μg/mL至约240μg/mL、约10μg/mL至约220μg/mL、约10μg/mL至约200μg/mL、约10μg/mL至约180μg/mL、约10μg/mL至约160μg/mL、约10μg/mL至约140μg/mL、约10μg/mL至约120μg/mL、约10μg/mL至约100μg/mL、约10μg/mL至约80μg/mL、约10μg/mL至约60μg/mL、约10μg/mL至约40μg/mL、约10μg/mL至约20μg/mL、约20μg/mL至约500μg/mL、约20μg/mL至约480μg/mL、约20μg/mL至约460μg/mL、约20μg/mL至约440μg/mL、约20μg/mL至约420μg/mL、约20μg/mL至约400μg/mL、约20μg/mL至约380μg/mL、约20μg/mL至约360μg/mL、约20μg/mL至约340μg/mL、约20μg/mL至约320μg/mL、约20μg/mL至约300μg/mL、约20μg/mL至约280μg/mL、约20μg/mL至约260μg/mL、约20μg/mL至约240μg/mL、约20μg/mL至约220μg/mL、约20μg/mL至约200μg/mL、约20μg/mL至约180μg/mL、约20μg/mL至约160μg/mL、约20μg/mL至约140μg/mL、约20μg/mL至约120μg/mL、约20μg/mL至约100μg/mL、约20μg/mL至约80μg/mL、约20μg/mL至约60μg/mL、约20μg/mL至约40μg/mL、约40μg/mL至约500μg/mL、约40μg/mL至约480μg/mL、约40μg/mL至约460μg/mL、约40μg/mL至约440μg/mL、约40μg/mL至约420μg/mL、约40μg/mL至约400μg/mL、约40μg/mL至约380μg/mL、约40μg/mL至约360μg/mL、约40μg/mL至约340μg/mL、约40μg/mL至约320μg/mL、约40μg/mL至约300μg/mL、约40μg/mL至约280μg/mL、约40μg/mL至约260μg/mL、约40μg/mL至约240μg/mL、约40μg/mL至约220μg/mL、约40μg/mL至约200μg/mL、约40μg/mL至约180μg/mL、约40μg/mL至约160μg/mL、约40μg/mL至约140μg/mL、约40μg/mL至约120μg/mL、约40μg/mL至约100μg/mL、约40μg/mL至约80μg/mL、约40μg/mL至约60μg/mL、约60μg/mL至约500μg/mL、约60μg/mL至约480μg/mL、约60μg/mL至约460μg/mL、约60μg/mL至约440μg/mL、约60μg/mL至约420μg/mL、约60μg/mL至约400μg/mL、约60μg/mL至约380μg/mL、约60μg/mL至约360μg/mL、约60μg/mL至约340μg/mL、约60μg/mL至约320μg/mL、约60μg/mL至约300μg/mL、约60μg/mL至约280μg/mL、约60μg/mL至约260μg/mL、约60μg/mL至约240μg/mL、约60μg/mL至约220μg/mL、约60μg/mL至约200μg/mL、约60μg/mL至约180μg/mL、约60μg/mL至约160μg/mL、约60μg/mL至约140μg/mL、约60μg/mL至约120μg/mL、约60μg/mL至约100μg/mL、约60μg/mL至约80μg/mL、约80μg/mL至约500μg/mL、约80μg/mL至约480μg/mL、约80μg/mL至约460μg/mL、约80μg/mL至约440μg/mL、约80μg/mL至约420μg/mL、约80μg/mL至约400μg/mL、约80μg/mL至约380μg/mL、约80μg/mL至约360μg/mL、约80μg/mL至约340μg/mL、约80μg/mL至约320μg/mL、约80μg/mL至约300μg/mL、约80μg/mL至约280μg/mL、约80μg/mL至约260μg/mL、约80μg/mL至约240μg/mL、约80μg/mL至约220μg/mL、约80μg/mL至约200μg/mL、约80μg/mL至约180μg/mL、约80μg/mL至约160μg/mL、约80μg/mL至约140μg/mL、约80μg/mL至约120μg/mL、约80μg/mL至约100μg/mL、约100μg/mL至约500μg/mL、约100μg/mL至约480μg/mL、约100μg/mL至约460μg/mL、约100μg/mL至约440μg/mL、约100μg/mL至约420μg/mL、约100μg/mL至约400μg/mL、约100μg/mL至约380μg/mL、约100μg/mL至约360μg/mL、约100μg/mL至约340μg/mL、约100μg/mL至约320μg/mL、约100μg/mL至约300μg/mL、约100μg/mL至约280μg/mL、约100μg/mL至约260μg/mL、约100μg/mL至约240μg/mL、约100μg/mL至约220μg/mL、约100μg/mL至约200μg/mL、约100μg/mL至约180μg/mL、约100μg/mL至约160μg/mL、约100μg/mL至约140μg/mL、约100μg/mL至约120μg/mL、约120μg/mL至约500μg/mL、约120μg/mL至约480μg/mL、约120μg/mL至约460μg/mL、约120μg/mL至约440μg/mL、约120μg/mL至约420μg/mL、约120μg/mL至约400μg/mL、约120μg/mL至约380μg/mL、约120μg/mL至约360μg/mL、约120μg/mL至约340μg/mL、约120μg/mL至约320μg/mL、约120μg/mL至约300μg/mL、约120μg/mL至约280μg/mL、约120μg/mL至约260μg/mL、约120μg/mL至约240μg/mL、约120μg/mL至约220μg/mL、约120μg/mL至约200μg/mL、约120μg/mL至约180μg/mL、约120μg/mL至约160μg/mL、约120μg/mL至约140μg/mL、约140μg/mL至约500μg/mL、约140μg/mL至约480μg/mL、约140μg/mL至约460μg/mL、约140μg/mL至约440μg/mL、约140μg/mL至约420μg/mL、约140μg/mL至约400μg/mL、约140μg/mL至约380μg/mL、约140μg/mL至约360μg/mL、约140μg/mL至约340μg/mL、约140μg/mL至约320μg/mL、约140μg/mL至约300μg/mL、约140μg/mL至约280μg/mL、约140μg/mL至约260μg/mL、约140μg/mL至约240μg/mL、约140μg/mL至约220μg/mL、约140μg/mL至约200μg/mL、约140μg/mL至约180μg/mL、约140μg/mL至约160μg/mL、约160μg/mL至约500μg/mL、约160μg/mL至约480μg/mL、约160μg/mL至约460μg/mL、约160μg/mL至约440μg/mL、约160μg/mL至约420μg/mL、约160μg/mL至约400μg/mL、约160μg/mL至约380μg/mL、约160μg/mL至约360μg/mL、约160μg/mL至约340μg/mL、约160μg/mL至约320μg/mL、约160μg/mL至约300μg/mL、约160μg/mL至约280μg/mL、约160μg/mL至约260μg/mL、约160μg/mL至约240μg/mL、约160μg/mL至约220μg/mL、约160μg/mL至约200μg/mL、约160μg/mL至约180μg/mL、约180μg/mL至约500μg/mL、约180μg/mL至约480μg/mL、约180μg/mL至约460μg/mL、约180μg/mL至约440μg/mL、约180μg/mL至约420μg/mL、约180μg/mL至约400μg/mL、约180μg/mL至约380μg/mL、约180μg/mL至约360μg/mL、约180μg/mL至约340μg/mL、约180μg/mL至约320μg/mL、约180μg/mL至约300μg/mL、约180μg/mL至约280μg/mL、约180μg/mL至约260μg/mL、约180μg/mL至约240μg/mL、约180μg/mL至约220μg/mL、约180μg/mL至约200μg/mL、约200μg/mL至约500μg/mL、约200μg/mL至约480μg/mL、约200μg/mL至约460μg/mL、约200μg/mL至约440μg/mL、约200μg/mL至约420μg/mL、约200μg/mL至约400μg/mL、约200μg/mL至约380μg/mL、约200μg/mL至约360μg/mL、约200μg/mL至约340μg/mL、约200μg/mL至约320μg/mL、约200μg/mL至约300μg/mL、约200μg/mL至约280μg/mL、约200μg/mL至约260μg/mL、约200μg/mL至约240μg/mL、约200μg/mL至约220μg/mL、约220μg/mL至约500μg/mL、约220μg/mL至约480μg/mL、约220μg/mL至约460μg/mL、约220μg/mL至约440μg/mL、约220μg/mL至约420μg/mL、约220μg/mL至约400μg/mL、约220μg/mL至约380μg/mL、约220μg/mL至约360μg/mL、约220μg/mL至约340μg/mL、约220μg/mL至约320μg/mL、约220μg/mL至约300μg/mL、约220μg/mL至约280μg/mL、约220μg/mL至约260μg/mL、约220μg/mL至约240μg/mL、约240μg/mL至约500μg/mL、约240μg/mL至约480μg/mL、约240μg/mL至约460μg/mL、约240μg/mL至约440μg/mL、约240μg/mL至约420μg/mL、约240μg/mL至约400μg/mL、约240μg/mL至约380μg/mL、约240μg/mL至约360μg/mL、约240μg/mL至约340μg/mL、约240μg/mL至约320μg/mL、约240μg/mL至约300μg/mL、约240μg/mL至约280μg/mL、约240μg/mL至约260μg/mL、约260μg/mL至约500μg/mL、约260μg/mL至约480μg/mL、约260μg/mL至约460μg/mL、约260μg/mL至约440μg/mL、约260μg/mL至约420μg/mL、约260μg/mL至约400μg/mL、约260μg/mL至约380μg/mL、约260μg/mL至约360μg/mL、约260μg/mL至约340μg/mL、约260μg/mL至约320μg/mL、约260μg/mL至约300μg/mL、约260μg/mL至约280μg/mL、约280μg/mL至约500μg/mL、约280μg/mL至约480μg/mL、约280μg/mL至约460μg/mL、约280μg/mL至约440μg/mL、约280μg/mL至约420μg/mL、约280μg/mL至约400μg/mL、约280μg/mL至约380μg/mL、约280μg/mL至约360μg/mL、约280μg/mL至约340μg/mL、约280μg/mL至约320μg/mL、约280μg/mL至约300μg/mL、约300μg/mL至约500μg/mL、约300μg/mL至约480μg/mL、约300μg/mL至约460μg/mL、约300μg/mL至约440μg/mL、约300μg/mL至约420μg/mL、约300μg/mL至约400μg/mL、约300μg/mL至约380μg/mL、约300μg/mL至约360μg/mL、约300μg/mL至约340μg/mL、约300μg/mL至约320μg/mL、约320μg/mL至约500μg/mL、约320μg/mL至约480μg/mL、约320μg/mL至约460μg/mL、约320μg/mL至约440μg/mL、约320μg/mL至约420μg/mL、约320μg/mL至约400μg/mL、约320μg/mL至约380μg/mL、约320μg/mL至约360μg/mL、约320μg/mL至约340μg/mL、约340μg/mL至约500μg/mL、约340μg/mL至约480μg/mL、约340μg/mL至约460μg/mL、约340μg/mL至约440μg/mL、约340μg/mL至约420μg/mL、约340μg/mL至约400μg/mL、约340μg/mL至约380μg/mL、约340μg/mL至约360μg/mL、约360μg/mL至约500μg/mL、约360μg/mL至约480μg/mL、约360μg/mL至约460μg/mL、约360μg/mL至约440μg/mL、约360μg/mL至约420μg/mL、约360μg/mL至约400μg/mL、约360μg/mL至约380μg/mL、约380μg/mL至约500μg/mL、约380μg/mL至约480μg/mL、约380μg/mL至约460μg/mL、约380μg/mL至约440μg/mL、约380μg/mL至约420μg/mL、约380μg/mL至约400μg/mL、约400μg/mL至约500μg/mL、约400μg/mL至约480μg/mL、约400μg/mL至约460μg/mL、约400μg/mL至约440μg/mL、约400μg/mL至约420μg/mL、约420μg/mL至约500μg/mL、约420μg/mL至约480μg/mL、约420μg/mL至约460μg/mL、约420μg/mL至约440μg/mL、约440μg/mL至约500μg/mL、约440μg/mL至约480μg/mL、约440μg/mL至约460μg/mL、约460μg/mL至约500μg/mL、约460μg/mL至约480μg/mL、或约480μg/mL至约500μg/mL的运铁蛋白(例如，人脱铁运铁蛋白、人全铁运铁蛋白或它们的组合)。

在一些实施方案中，第二培养基包含约0.1ng/mL至约200ng/mL、约0.1ng/mL至约180ng/mL、约0.1ng/mL至约160ng/mL、约0.1ng/mL至约140ng/mL、约0.1ng/mL至约120ng/mL、约0.1ng/mL至约100ng/mL、约0.1ng/mL至约80ng/mL、约0.1ng/mL至约60ng/mL、约0.1ng/mL至约40ng/mL、约0.1ng/mL至约20ng/mL、约0.1ng/mL至约10ng/mL、约0.1ng/mL至约5ng/mL、约5ng/mL至约200ng/mL、约5ng/mL至约180ng/mL、约5ng/mL至约160ng/mL、约5ng/mL至约140ng/mL、约5ng/mL至约120ng/mL、约5ng/mL至约100ng/mL、约5ng/mL至约80ng/mL、约5ng/mL至约60ng/mL、约5ng/mL至约40ng/mL、约5ng/mL至约20ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约200ng/mL、约10ng/mL至约180ng/mL、约10ng/mL至约160ng/mL、约10ng/mL至约140ng/mL、约10ng/mL至约120ng/mL、约10ng/mL至约100ng/mL、约10ng/mL至约80ng/mL、约10ng/mL至约60ng/mL、约10ng/mL至约40ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约20ng/mL至约200ng/mL、约20ng/mL至约180ng/mL、约20ng/mL至约160ng/mL、约20ng/mL至约140ng/mL、约20ng/mL至约120ng/mL、约20ng/mL至约100ng/mL、约20ng/mL至约80ng/mL、约20ng/mL至约60ng/mL、约20ng/mL至约40ng/mL、约40ng/mL至约200ng/mL、约40ng/mL至约180ng/mL、约40ng/mL至约160ng/mL、约40ng/mL至约140ng/mL、约40ng/mL至约120ng/mL、约40ng/mL至约100ng/mL、约40ng/mL至约80ng/mL、约40ng/mL至约60ng/mL、约60ng/mL至约200ng/mL、约60ng/mL至约180ng/mL、约60ng/mL至约160ng/mL、约60ng/mL至约140ng/mL、约60ng/mL至约120ng/mL、约60ng/mL至约100ng/mL、约60ng/mL至约80ng/mL、约80ng/mL至约200ng/mL、约80ng/mL至约180ng/mL、约80ng/mL至约160ng/mL、约80ng/mL至约140ng/mL、约80ng/mL至约120ng/mL、约80ng/mL至约100ng/mL、约100ng/mL至约200ng/mL、约100ng/mL至约180ng/mL、约100ng/mL至约160ng/mL、约100ng/mL至约140ng/mL、约100ng/mL至约120ng/mL、约120ng/mL至约200ng/mL、约120ng/mL至约180ng/mL、约120ng/mL至约160ng/mL、约120ng/mL至约140ng/mL、约140ng/mL至约200ng/mL、约140ng/mL至约180ng/mL、约140ng/mL至约160ng/mL、约160ng/mL至约200ng/mL、约160ng/mL至约180ng/mL、或约180ng/mL至约200ng/mL的IL-3(例如，人IL-3)。

在一些实施方案中，第二培养基包含约1ng/mL至约1μg/mL、约1ng/mL至约950ng/mL、约1ng/mL至约900ng/mL、约1ng/mL至约850ng/mL、约1ng/mL至约800ng/mL、约1ng/mL至约750ng/mL、约1ng/mL至约700ng/mL、约1ng/mL至约650ng/mL、约1ng/mL至约600ng/mL、约1ng/mL至约550ng/mL、约1ng/mL至约500ng/mL、约1ng/mL至约450ng/mL、约1ng/mL至约400ng/mL、约1ng/mL至约350ng/mL、约1ng/mL至约300ng/mL、约1ng/mL至约250ng/mL、约1ng/mL至约200ng/mL、约1ng/mL至约150ng/mL、约1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约80ng/mL、约1ng/mL至约60ng/mL、约1ng/mL至约40ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约1μg/mL、约10ng/mL至约950ng/mL、约10ng/mL至约900ng/mL、约10ng/mL至约850ng/mL、约10ng/mL至约800ng/mL、约10ng/mL至约750ng/mL、约10ng/mL至约700ng/mL、约10ng/mL至约650ng/mL、约10ng/mL至约600ng/mL、约10ng/mL至约550ng/mL、约10ng/mL至约500ng/mL、约10ng/mL至约450ng/mL、约10ng/mL至约400ng/mL、约10ng/mL至约350ng/mL、约10ng/mL至约300ng/mL、约10ng/mL至约250ng/mL、约10ng/mL至约200ng/mL、约10ng/mL至约150ng/mL、约10ng/mL至约100ng/mL、约10ng/mL至约80ng/mL、约10ng/mL至约60ng/mL、约10ng/mL至约40ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约20ng/mL至约1μg/mL、约20ng/mL至约950ng/mL、约20ng/mL至约900ng/mL、约20ng/mL至约850ng/mL、约20ng/mL至约800ng/mL、约20ng/mL至约750ng/mL、约20ng/mL至约700ng/mL、约20ng/mL至约650ng/mL、约20ng/mL至约600ng/mL、约20ng/mL至约550ng/mL、约20ng/mL至约500ng/mL、约20ng/mL至约450ng/mL、约20ng/mL至约400ng/mL、约20ng/mL至约350ng/mL、约20ng/mL至约300ng/mL、约20ng/mL至约250ng/mL、约20ng/mL至约200ng/mL、约20ng/mL至约150ng/mL、约20ng/mL至约100ng/mL、约20ng/mL至约80ng/mL、约20ng/mL至约60ng/mL、约20ng/mL至约40ng/mL、约40ng/mL至约1μg/mL、约40ng/mL至约950ng/mL、约40ng/mL至约900ng/mL、约40ng/mL至约850ng/mL、约40ng/mL至约800ng/mL、约40ng/mL至约750ng/mL、约40ng/mL至约700ng/mL、约40ng/mL至约650ng/mL、约40ng/mL至约600ng/mL、约40ng/mL至约550ng/mL、约40ng/mL至约500ng/mL、约40ng/mL至约450ng/mL、约40ng/mL至约400ng/mL、约40ng/mL至约350ng/mL、约40ng/mL至约300ng/mL、约40ng/mL至约250ng/mL、约40ng/mL至约200ng/mL、约40ng/mL至约150ng/mL、约40ng/mL至约100ng/mL、约40ng/mL至约80ng/mL、约40ng/mL至约60ng/mL、约60ng/mL至约1μg/mL、约60ng/mL至约950ng/mL、约60ng/mL至约900ng/mL、约60ng/mL至约850ng/mL、约60ng/mL至约800ng/mL、约60ng/mL至约750ng/mL、约60ng/mL至约700ng/mL、约60ng/mL至约650ng/mL、约60ng/mL至约600ng/mL、约60ng/mL至约550ng/mL、约60ng/mL至约500ng/mL、约60ng/mL至约450ng/mL、约60ng/mL至约400ng/mL、约60ng/mL至约350ng/mL、约60ng/mL至约300ng/mL、约60ng/mL至约250ng/mL、约60ng/mL至约200ng/mL、约60ng/mL至约150ng/mL、约60ng/mL至约100ng/mL、约60ng/mL至约80ng/mL、约80ng/mL至约1μg/mL、约80ng/mL至约950ng/mL、约80ng/mL至约900ng/mL、约80ng/mL至约850ng/mL、约80ng/mL至约800ng/mL、约80ng/mL至约750ng/mL、约80ng/mL至约700ng/mL、约80ng/mL至约650ng/mL、约80ng/mL至约600ng/mL、约80ng/mL至约550ng/mL、约80ng/mL至约500ng/mL、约80ng/mL至约450ng/mL、约80ng/mL至约400ng/mL、约80ng/mL至约350ng/mL、约80ng/mL至约300ng/mL、约80ng/mL至约250ng/mL、约80ng/mL至约200ng/mL、约80ng/mL至约150ng/mL、约80ng/mL至约100ng/mL、约100ng/mL至约1μg/mL、约100ng/mL至约950ng/mL、约100ng/mL至约900ng/mL、约100ng/mL至约850ng/mL、约100ng/mL至约800ng/mL、约100ng/mL至约750ng/mL、约100ng/mL至约700ng/mL、约100ng/mL至约650ng/mL、约100ng/mL至约600ng/mL、约100ng/mL至约550ng/mL、约100ng/mL至约500ng/mL、约100ng/mL至约450ng/mL、约100ng/mL至约400ng/mL、约100ng/mL至约350ng/mL、约100ng/mL至约300ng/mL、约100ng/mL至约250ng/mL、约100ng/mL至约200ng/mL、约100ng/mL至约150ng/mL、约150ng/mL至约1μg/mL、约150ng/mL至约950ng/mL、约150ng/mL至约900ng/mL、约150ng/mL至约850ng/mL、约150ng/mL至约800ng/mL、约150ng/mL至约750ng/mL、约150ng/mL至约700ng/mL、约150ng/mL至约650ng/mL、约150ng/mL至约600ng/mL、约150ng/mL至约550ng/mL、约150ng/mL至约500ng/mL、约150ng/mL至约450ng/mL、约150ng/mL至约400ng/mL、约150ng/mL至约350ng/mL、约150ng/mL至约300ng/mL、约150ng/mL至约250ng/mL、约150ng/mL至约200ng/mL、约200ng/mL至约1μg/mL、约200ng/mL至约950ng/mL、约200ng/mL至约900ng/mL、约200ng/mL至约850ng/mL、约200ng/mL至约800ng/mL、约200ng/mL至约750ng/mL、约200ng/mL至约700ng/mL、约200ng/mL至约650ng/mL、约200ng/mL至约600ng/mL、约200ng/mL至约550ng/mL、约200ng/mL至约500ng/mL、约200ng/mL至约450ng/mL、约200ng/mL至约400ng/mL、约200ng/mL至约350ng/mL、约200ng/mL至约300ng/mL、约200ng/mL至约250ng/mL、约250ng/mL至约1μg/mL、约250ng/mL至约950ng/mL、约250ng/mL至约900ng/mL、约250ng/mL至约850ng/mL、约250ng/mL至约800ng/mL、约250ng/mL至约750ng/mL、约250ng/mL至约700ng/mL、约250ng/mL至约650ng/mL、约250ng/mL至约600ng/mL、约250ng/mL至约550ng/mL、约250ng/mL至约500ng/mL、约250ng/mL至约450ng/mL、约250ng/mL至约400ng/mL、约250ng/mL至约350ng/mL、约250ng/mL至约300ng/mL、约300ng/mL至约1μg/mL、约300ng/mL至约950ng/mL、约300ng/mL至约900ng/mL、约300ng/mL至约850ng/mL、约300ng/mL至约800ng/mL、约300ng/mL至约750ng/mL、约300ng/mL至约700ng/mL、约300ng/mL至约650ng/mL、约300ng/mL至约600ng/mL、约300ng/mL至约550ng/mL、约300ng/mL至约500ng/mL、约300ng/mL至约450ng/mL、约300ng/mL至约400ng/mL、约300ng/mL至约350ng/mL、约350ng/mL至约1μg/mL、约350ng/mL至约950ng/mL、约350ng/mL至约900ng/mL、约350ng/mL至约850ng/mL、约350ng/mL至约800ng/mL、约350ng/mL至约750ng/mL、约350ng/mL至约700ng/mL、约350ng/mL至约650ng/mL、约350ng/mL至约600ng/mL、约350ng/mL至约550ng/mL、约350ng/mL至约500ng/mL、约350ng/mL至约450ng/mL、约350ng/mL至约400ng/mL、约400ng/mL至约1μg/mL、约400ng/mL至约950ng/mL、约400ng/mL至约900ng/mL、约400ng/mL至约850ng/mL、约400ng/mL至约800ng/mL、约400ng/mL至约750ng/mL、约400ng/mL至约700ng/mL、约400ng/mL至约650ng/mL、约400ng/mL至约600ng/mL、约400ng/mL至约550ng/mL、约400ng/mL至约500ng/mL、约400ng/mL至约450ng/mL、约450ng/mL至约1μg/mL、约450ng/mL至约950ng/mL、约450ng/mL至约900ng/mL、约450ng/mL至约850ng/mL、约450ng/mL至约800ng/mL、约450ng/mL至约750ng/mL、约450ng/mL至约700ng/mL、约450ng/mL至约650ng/mL、约450ng/mL至约600ng/mL、约450ng/mL至约550ng/mL、约450ng/mL至约500ng/mL、约500ng/mL至约1μg/mL、约500ng/mL至约950ng/mL、约500ng/mL至约900ng/mL、约500ng/mL至约850ng/mL、约500ng/mL至约800ng/mL、约500ng/mL至约750ng/mL、约500ng/mL至约700ng/mL、约500ng/mL至约650ng/mL、约500ng/mL至约600ng/mL、约500ng/mL至约550ng/mL、约550ng/mL至约1μg/mL、约550ng/mL至约950ng/mL、约550ng/mL至约900ng/mL、约550ng/mL至约850ng/mL、约550ng/mL至约800ng/mL、约550ng/mL至约750ng/mL、约550ng/mL至约700ng/mL、约550ng/mL至约650ng/mL、约550ng/mL至约600ng/mL、约600ng/mL至约1μg/mL、约600ng/mL至约950ng/mL、约600ng/mL至约900ng/mL、约600ng/mL至约850ng/mL、约600ng/mL至约800ng/mL、约600ng/mL至约750ng/mL、约600ng/mL至约700ng/mL、约600ng/mL至约650ng/mL、约650ng/mL至约1μg/mL、约650ng/mL至约950ng/mL、约650ng/mL至约900ng/mL、约650ng/mL至约850ng/mL、约650ng/mL至约800ng/mL、约650ng/mL至约750ng/mL、约650ng/mL至约700ng/mL、约700ng/mL至约1μg/mL、约700ng/mL至约950ng/mL、约700ng/mL至约900ng/mL、约700ng/mL至约850ng/mL、约700ng/mL至约800ng/mL、约700ng/mL至约750ng/mL、约750ng/mL至约1μg/mL、约750ng/mL至约950ng/mL、约750ng/mL至约900ng/mL、约750ng/mL至约850ng/mL、约750ng/mL至约800ng/mL、约800ng/mL至约1μg/mL、约800ng/mL至约950ng/mL、约800ng/mL至约900ng/mL、约800ng/mL至约850ng/mL、约850ng/mL至约1μg/mL、约850ng/mL至约950ng/mL、约850ng/mL至约900ng/mL、约900ng/mL至约1μg/mL、约900ng/mL至约950ng/mL、约950ng/mL至约1μg/mL的SCF(例如，人干细胞因子)。

在一些实施方案中，第二培养基包含约0.1nM至约200nM、约0.1nM至约180nM、约0.1nM至约160nM、约0.1nM至约140nM、约0.1nM至约120nM、约0.1nM至约100nM、约0.1nM至约80nM、约0.1nM至约60nM、约0.1nM至约50nM、约0.1nM至约40nM、约0.1nM至约30nM、约0.1nM至约25nM、约0.1nM至约20nM、约0.1nM至约15nM、约0.1nM至约10nM、约0.1nM至约5nM、约0.1nM至约2nM、约0.1nM至约1nM、约1nM至约200nM、约1nM至约180nM、约1nM至约160nM、约1nM至约140nM、约1nM至约120nM、约1nM至约100nM、约1nM至约80nM、约1nM至约60nM、约1nM至约50nM、约1nM至约40nM、约1nM至约30nM、约1nM至约25nM、约1nM至约20nM、约1nM至约15nM、约1nM至约10nM、约1nM至约5nM、约1nM至约2nM、约2nM至约200nM、约2nM至约180nM、约2nM至约160nM、约2nM至约140nM、约2nM至约120nM、约2nM至约100nM、约2nM至约80nM、约2nM至约60nM、约2nM至约50nM、约2nM至约40nM、约2nM至约30nM、约2nM至约25nM、约2nM至约20nM、约2nM至约15nM、约2nM至约10nM、约2nM至约5nM、约5nM至约200nM、约5nM至约180nM、约5nM至约160nM、约5nM至约140nM、约5nM至约120nM、约5nM至约100nM、约5nM至约80nM、约5nM至约60nM、约5nM至约50nM、约5nM至约40nM、约5nM至约30nM、约5nM至约25nM、约5nM至约20nM、约5nM至约15nM、约5nM至约10nM、约10nM至约200nM、约10nM至约180nM、约10nM至约160nM、约10nM至约140nM、约10nM至约120nM、约10nM至约100nM、约10nM至约80nM、约10nM至约60nM、约10nM至约50nM、约10nM至约40nM、约10nM至约30nM、约10nM至约25nM、约10nM至约20nM、约10nM至约15nM、约15nM至约200nM、约15nM至约180nM、约15nM至约160nM、约15nM至约140nM、约15nM至约120nM、约15nM至约100nM、约15nM至约80nM、约15nM至约60nM、约15nM至约50nM、约15nM至约40nM、约15nM至约30nM、约15nM至约25nM、约15nM至约20nM、约20nM至约200nM、约20nM至约180nM、约20nM至约160nM、约20nM至约140nM、约20nM至约120nM、约20nM至约100nM、约20nM至约80nM、约20nM至约60nM、约20nM至约50nM、约20nM至约40nM、约20nM至约30nM、约20nM至约25nM、约25nM至约200nM、约25nM至约180nM、约25nM至约160nM、约25nM至约140nM、约25nM至约120nM、约25nM至约100nM、约25nM至约80nM、约25nM至约60nM、约25nM至约50nM、约25nM至约40nM、约25nM至约30nM、约30nM至约200nM、约30nM至约180nM、约30nM至约160nM、约30nM至约140nM、约30nM至约120nM、约30nM至约100nM、约30nM至约80nM、约30nM至约60nM、约30nM至约50nM、约30nM至约40nM、约40nM至约200nM、约40nM至约180nM、约40nM至约160nM、约40nM至约140nM、约40nM至约120nM、约40nM至约100nM、约40nM至约80nM、约40nM至约60nM、约40nM至约50nM、约50nM至约200nM、约50nM至约180nM、约50nM至约160nM、约50nM至约140nM、约50nM至约120nM、约50nM至约100nM、约50nM至约80nM、约50nM至约60nM、约60nM至约200nM、约60nM至约180nM、约60nM至约160nM、约60nM至约140nM、约60nM至约120nM、约60nM至约100nM、约60nM至约80nM、约80nM至约200nM、约80nM至约180nM、约80nM至约160nM、约80nM至约140nM、约80nM至约120nM、约80nM至约100nM、约100nM至约200nM、约100nM至约180nM、约100nM至约160nM、约100nM至约140nM、约100nM至约120nM、约120nM至约200nM、约120nM至约180nM、约120nM至约160nM、约120nM至约140nM、约140nM至约200nM、约140nM至约180nM、约140nM至约160nM、约160nM至约200nM、约160nM至约180nM、或约180nM至约200nM的地塞米松。

在一些实施方案中，第二培养基包含约1ng/mL至约500ng/mL、约1ng/mL至约480ng/mL、约1ng/mL至约460ng/mL、约1ng/mL至约440ng/mL、约1ng/mL至约420ng/mL、约1ng/mL至约400ng/mL、约1ng/mL至约380ng/mL、约1ng/mL至约360ng/mL、约1ng/mL至约340ng/mL、约1ng/mL至约320ng/mL、约1ng/mL至约300ng/mL、约1ng/mL至约280ng/mL、约1ng/mL至约260ng/mL、约1ng/mL至约240ng/mL、约1ng/mL至约220ng/mL、约1ng/mL至约200ng/mL、约1ng/mL至约180ng/mL、约1ng/mL至约160ng/mL、约1ng/mL至约140ng/mL、约1ng/mL至约120ng/mL、约1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约80ng/mL、约1ng/mL至约60ng/mL、约1ng/mL至约40ng/mL、约1ng/mL至约30ng/mL、约1ng/mL至约25ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、5ng/mL至约500ng/mL、约5ng/mL至约480ng/mL、约5ng/mL至约460ng/mL、约5ng/mL至约440ng/mL、约5ng/mL至约420ng/mL、约5ng/mL至约400ng/mL、约5ng/mL至约380ng/mL、约5ng/mL至约360ng/mL、约5ng/mL至约340ng/mL、约5ng/mL至约320ng/mL、约5ng/mL至约300ng/mL、约5ng/mL至约280ng/mL、约5ng/mL至约260ng/mL、约5ng/mL至约240ng/mL、约5ng/mL至约220ng/mL、约5ng/mL至约200ng/mL、约5ng/mL至约180ng/mL、约5ng/mL至约160ng/mL、约5ng/mL至约140ng/mL、约5ng/mL至约120ng/mL、约5ng/mL至约100ng/mL、约5ng/mL至约80ng/mL、约5ng/mL至约60ng/mL、约5ng/mL至约40ng/mL、约5ng/mL至约30ng/mL、约5ng/mL至约25ng/mL、约5ng/mL至约20ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、10ng/mL至约500ng/mL、约10ng/mL至约480ng/mL、约10ng/mL至约460ng/mL、约10ng/mL至约440ng/mL、约10ng/mL至约420ng/mL、约10ng/mL至约400ng/mL、约10ng/mL至约380ng/mL、约10ng/mL至约360ng/mL、约10ng/mL至约340ng/mL、约10ng/mL至约320ng/mL、约10ng/mL至约300ng/mL、约10ng/mL至约280ng/mL、约10ng/mL至约260ng/mL、约10ng/mL至约240ng/mL、约10ng/mL至约220ng/mL、约10ng/mL至约200ng/mL、约10ng/mL至约180ng/mL、约10ng/mL至约160ng/mL、约10ng/mL至约140ng/mL、约10ng/mL至约120ng/mL、约10ng/mL至约100ng/mL、约10ng/mL至约80ng/mL、约10ng/mL至约60ng/mL、约10ng/mL至约40ng/mL、约10ng/mL至约30ng/mL、约10ng/mL至约25ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约10ng/mL至约15ng/mL、15ng/mL至约500ng/mL、约15ng/mL至约480ng/mL、约15ng/mL至约460ng/mL、约15ng/mL至约440ng/mL、约15ng/mL至约420ng/mL、约15ng/mL至约400ng/mL、约15ng/mL至约380ng/mL、约15ng/mL至约360ng/mL、约15ng/mL至约340ng/mL、约15ng/mL至约320ng/mL、约15ng/mL至约300ng/mL、约15ng/mL至约280ng/mL、约15ng/mL至约260ng/mL、约15ng/mL至约240ng/mL、约15ng/mL至约220ng/mL、约15ng/mL至约200ng/mL、约15ng/mL至约180ng/mL、约15ng/mL至约160ng/mL、约15ng/mL至约140ng/mL、约15ng/mL至约120ng/mL、约15ng/mL至约100ng/mL、约15ng/mL至约80ng/mL、约15ng/mL至约60ng/mL、约15ng/mL至约40ng/mL、约15ng/mL至约30ng/mL、约15ng/mL至约25ng/mL、约15ng/mL至约20ng/mL、20ng/mL至约500ng/mL、约20ng/mL至约480ng/mL、约20ng/mL至约460ng/mL、约20ng/mL至约440ng/mL、约20ng/mL至约420ng/mL、约20ng/mL至约400ng/mL、约20ng/mL至约380ng/mL、约20ng/mL至约360ng/mL、约20ng/mL至约340ng/mL、约20ng/mL至约320ng/mL、约20ng/mL至约300ng/mL、约20ng/mL至约280ng/mL、约20ng/mL至约260ng/mL、约20ng/mL至约240ng/mL、约20ng/mL至约220ng/mL、约20ng/mL至约200ng/mL、约20ng/mL至约180ng/mL、约20ng/mL至约160ng/mL、约20ng/mL至约140ng/mL、约20ng/mL至约120ng/mL、约20ng/mL至约100ng/mL、约20ng/mL至约80ng/mL、约20ng/mL至约60ng/mL、约20ng/mL至约40ng/mL、约20ng/mL至约30ng/mL、约20ng/mL至约25ng/mL、25ng/mL至约500ng/mL、约25ng/mL至约480ng/mL、约25ng/mL至约460ng/mL、约25ng/mL至约440ng/mL、约25ng/mL至约420ng/mL、约25ng/mL至约400ng/mL、约25ng/mL至约380ng/mL、约25ng/mL至约360ng/mL、约25ng/mL至约340ng/mL、约25ng/mL至约320ng/mL、约25ng/mL至约300ng/mL、约25ng/mL至约280ng/mL、约25ng/mL至约260ng/mL、约25ng/mL至约240ng/mL、约25ng/mL至约220ng/mL、约25ng/mL至约200ng/mL、约25ng/mL至约180ng/mL、约25ng/mL至约160ng/mL、约25ng/mL至约140ng/mL、约25ng/mL至约120ng/mL、约25ng/mL至约100ng/mL、约25ng/mL至约80ng/mL、约25ng/mL至约60ng/mL、约25ng/mL至约40ng/mL、约25ng/mL至约30ng/mL、30ng/mL至约500ng/mL、约30ng/mL至约480ng/mL、约30ng/mL至约460ng/mL、约30ng/mL至约440ng/mL、约30ng/mL至约420ng/mL、约30ng/mL至约400ng/mL、约30ng/mL至约380ng/mL、约30ng/mL至约360ng/mL、约30ng/mL至约340ng/mL、约30ng/mL至约320ng/mL、约30ng/mL至约300ng/mL、约30ng/mL至约280ng/mL、约30ng/mL至约260ng/mL、约30ng/mL至约240ng/mL、约30ng/mL至约220ng/mL、约30ng/mL至约200ng/mL、约30ng/mL至约180ng/mL、约30ng/mL至约160ng/mL、约30ng/mL至约140ng/mL、约30ng/mL至约120ng/mL、约30ng/mL至约100ng/mL、约30ng/mL至约80ng/mL、约30ng/mL至约60ng/mL、约30ng/mL至约40ng/mL、40ng/mL至约500ng/mL、约40ng/mL至约480ng/mL、约40ng/mL至约460ng/mL、约40ng/mL至约440ng/mL、约40ng/mL至约420ng/mL、约40ng/mL至约400ng/mL、约40ng/mL至约380ng/mL、约40ng/mL至约360ng/mL、约40ng/mL至约340ng/mL、约40ng/mL至约320ng/mL、约40ng/mL至约300ng/mL、约40ng/mL至约280ng/mL、约40ng/mL至约260ng/mL、约40ng/mL至约240ng/mL、约40ng/mL至约220ng/mL、约40ng/mL至约200ng/mL、约40ng/mL至约180ng/mL、约40ng/mL至约160ng/mL、约40ng/mL至约140ng/mL、约40ng/mL至约120ng/mL、约40ng/mL至约100ng/mL、约40ng/mL至约80ng/mL、约40ng/mL至约60ng/mL、60ng/mL至约500ng/mL、约60ng/mL至约480ng/mL、约60ng/mL至约460ng/mL、约60ng/mL至约440ng/mL、约60ng/mL至约420ng/mL、约60ng/mL至约400ng/mL、约60ng/mL至约380ng/mL、约60ng/mL至约360ng/mL、约60ng/mL至约340ng/mL、约60ng/mL至约320ng/mL、约60ng/mL至约300ng/mL、约60ng/mL至约280ng/mL、约60ng/mL至约260ng/mL、约60ng/mL至约240ng/mL、约60ng/mL至约220ng/mL、约60ng/mL至约200ng/mL、约60ng/mL至约180ng/mL、约60ng/mL至约160ng/mL、约60ng/mL至约140ng/mL、约60ng/mL至约120ng/mL、约60ng/mL至约100ng/mL、约60ng/mL至约80ng/mL、80ng/mL至约500ng/mL、约80ng/mL至约480ng/mL、约80ng/mL至约460ng/mL、约80ng/mL至约440ng/mL、约80ng/mL至约420ng/mL、约80ng/mL至约400ng/mL、约80ng/mL至约380ng/mL、约80ng/mL至约360ng/mL、约80ng/mL至约340ng/mL、约80ng/mL至约320ng/mL、约80ng/mL至约300ng/mL、约80ng/mL至约280ng/mL、约80ng/mL至约260ng/mL、约80ng/mL至约240ng/mL、约80ng/mL至约220ng/mL、约80ng/mL至约200ng/mL、约80ng/mL至约180ng/mL、约80ng/mL至约160ng/mL、约80ng/mL至约140ng/mL、约80ng/mL至约120ng/mL、约80ng/mL至约100ng/mL、100ng/mL至约500ng/mL、约100ng/mL至约480ng/mL、约100ng/mL至约460ng/mL、约100ng/mL至约440ng/mL、约100ng/mL至约420ng/mL、约100ng/mL至约400ng/mL、约100ng/mL至约380ng/mL、约100ng/mL至约360ng/mL、约100ng/mL至约340ng/mL、约100ng/mL至约320ng/mL、约100ng/mL至约300ng/mL、约100ng/mL至约280ng/mL、约100ng/mL至约260ng/mL、约100ng/mL至约240ng/mL、约100ng/mL至约220ng/mL、约100ng/mL至约200ng/mL、约100ng/mL至约180ng/mL、约100ng/mL至约160ng/mL、约100ng/mL至约140ng/mL、约100ng/mL至约120ng/mL、120ng/mL至约500ng/mL、约120ng/mL至约480ng/mL、约120ng/mL至约460ng/mL、约120ng/mL至约440ng/mL、约120ng/mL至约420ng/mL、约120ng/mL至约400ng/mL、约120ng/mL至约380ng/mL、约120ng/mL至约360ng/mL、约120ng/mL至约340ng/mL、约120ng/mL至约320ng/mL、约120ng/mL至约300ng/mL、约120ng/mL至约280ng/mL、约120ng/mL至约260ng/mL、约120ng/mL至约240ng/mL、约120ng/mL至约220ng/mL、约120ng/mL至约200ng/mL、约120ng/mL至约180ng/mL、约120ng/mL至约160ng/mL、约120ng/mL至约140ng/mL、140ng/mL至约500ng/mL、约140ng/mL至约480ng/mL、约140ng/mL至约460ng/mL、约140ng/mL至约440ng/mL、约140ng/mL至约420ng/mL、约140ng/mL至约400ng/mL、约140ng/mL至约380ng/mL、约140ng/mL至约360ng/mL、约140ng/mL至约340ng/mL、约140ng/mL至约320ng/mL、约140ng/mL至约300ng/mL、约140ng/mL至约280ng/mL、约140ng/mL至约260ng/mL、约140ng/mL至约240ng/mL、约140ng/mL至约220ng/mL、约140ng/mL至约200ng/mL、约140ng/mL至约180ng/mL、约140ng/mL至约160ng/mL、160ng/mL至约500ng/mL、约160ng/mL至约480ng/mL、约160ng/mL至约460ng/mL、约160ng/mL至约440ng/mL、约160ng/mL至约420ng/mL、约160ng/mL至约400ng/mL、约160ng/mL至约380ng/mL、约160ng/mL至约360ng/mL、约160ng/mL至约340ng/mL、约160ng/mL至约320ng/mL、约160ng/mL至约300ng/mL、约160ng/mL至约280ng/mL、约160ng/mL至约260ng/mL、约160ng/mL至约240ng/mL、约160ng/mL至约220ng/mL、约160ng/mL至约200ng/mL、约160ng/mL至约180ng/mL、180ng/mL至约500ng/mL、约180ng/mL至约480ng/mL、约180ng/mL至约460ng/mL、约180ng/mL至约440ng/mL、约180ng/mL至约420ng/mL、约180ng/mL至约400ng/mL、约180ng/mL至约380ng/mL、约180ng/mL至约360ng/mL、约180ng/mL至约340ng/mL、约180ng/mL至约320ng/mL、约180ng/mL至约300ng/mL、约180ng/mL至约280ng/mL、约180ng/mL至约260ng/mL、约180ng/mL至约240ng/mL、约180ng/mL至约220ng/mL、约180ng/mL至约200ng/mL、200ng/mL至约500ng/mL、约200ng/mL至约480ng/mL、约200ng/mL至约460ng/mL、约200ng/mL至约440ng/mL、约200ng/mL至约420ng/mL、约200ng/mL至约400ng/mL、约200ng/mL至约380ng/mL、约200ng/mL至约360ng/mL、约200ng/mL至约340ng/mL、约200ng/mL至约320ng/mL、约200ng/mL至约300ng/mL、约200ng/mL至约280ng/mL、约200ng/mL至约260ng/mL、约200ng/mL至约240ng/mL、约200ng/mL至约220ng/mL、220ng/mL至约500ng/mL、约220ng/mL至约480ng/mL、约220ng/mL至约460ng/mL、约220ng/mL至约440ng/mL、约220ng/mL至约420ng/mL、约220ng/mL至约300ng/mL、约220ng/mL至约380ng/mL、约220ng/mL至约360ng/mL、约220ng/mL至约340ng/mL、约220ng/mL至约320ng/mL、约220ng/mL至约400ng/mL、约220ng/mL至约280ng/mL、约220ng/mL至约260ng/mL、约220ng/mL至约240ng/mL、240ng/mL至约500ng/mL、约240ng/mL至约480ng/mL、约240ng/mL至约460ng/mL、约240ng/mL至约440ng/mL、约240ng/mL至约420ng/mL、约240ng/mL至约400ng/mL、约240ng/mL至约380ng/mL、约240ng/mL至约360ng/mL、约240ng/mL至约340ng/mL、约240ng/mL至约320ng/mL、约240ng/mL至约300ng/mL、约240ng/mL至约280ng/mL、约240ng/mL至约260ng/mL、260ng/mL至约500ng/mL、约260ng/mL至约480ng/mL、约260ng/mL至约460ng/mL、约260ng/mL至约440ng/mL、约260ng/mL至约420ng/mL、约260ng/mL至约400ng/mL、约260ng/mL至约380ng/mL、约260ng/mL至约360ng/mL、约260ng/mL至约340ng/mL、约260ng/mL至约320ng/mL、约260ng/mL至约300ng/mL、约260ng/mL至约280ng/mL、280ng/mL至约500ng/mL、约280ng/mL至约480ng/mL、约280ng/mL至约460ng/mL、约280ng/mL至约440ng/mL、约280ng/mL至约420ng/mL、约280ng/mL至约400ng/mL、约280ng/mL至约380ng/mL、约280ng/mL至约360ng/mL、约280ng/mL至约340ng/mL、约280ng/mL至约320ng/mL、约280ng/mL至约300ng/mL、300ng/mL至约500ng/mL、约300ng/mL至约480ng/mL、约300ng/mL至约460ng/mL、约300ng/mL至约440ng/mL、约300ng/mL至约420ng/mL、约300ng/mL至约400ng/mL、约300ng/mL至约380ng/mL、约300ng/mL至约360ng/mL、约300ng/mL至约340ng/mL、约300ng/mL至约320ng/mL、320ng/mL至约500ng/mL、约320ng/mL至约480ng/mL、约320ng/mL至约460ng/mL、约320ng/mL至约440ng/mL、约320ng/mL至约420ng/mL、约320ng/mL至约400ng/mL、约320ng/mL至约380ng/mL、约320ng/mL至约360ng/mL、约320ng/mL至约340ng/mL、340ng/mL至约500ng/mL、约340ng/mL至约480ng/mL、约340ng/mL至约460ng/mL、约340ng/mL至约440ng/mL、约340ng/mL至约420ng/mL、约340ng/mL至约400ng/mL、约340ng/mL至约380ng/mL、约340ng/mL至约360ng/mL、360ng/mL至约500ng/mL、约360ng/mL至约480ng/mL、约360ng/mL至约460ng/mL、约360ng/mL至约440ng/mL、约360ng/mL至约420ng/mL、约360ng/mL至约400ng/mL、约360ng/mL至约380ng/mL、380ng/mL至约500ng/mL、约380ng/mL至约480ng/mL、约380ng/mL至约460ng/mL、约380ng/mL至约440ng/mL、约380ng/mL至约420ng/mL、约380ng/mL至约400ng/mL、400ng/mL至约500ng/mL、约400ng/mL至约480ng/mL、约400ng/mL至约460ng/mL、约400ng/mL至约440ng/mL、约400ng/mL至约420ng/mL、420ng/mL至约500ng/mL、约420ng/mL至约480ng/mL、约420ng/mL至约460ng/mL、约420ng/mL至约440ng/mL、440ng/mL至约500ng/mL、约440ng/mL至约480ng/mL、约440ng/mL至约460ng/mL、约460ng/mL至约500ng/mL、约460ng/mL至约480ng/mL、或约480ng/mL至约500ng/mL的EPO(例如，重组人EPO)或EPO-模拟肽。EPO-模拟肽的非限制性实例包括例如EPO-模拟肽(EMP1；GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSEQ ID NO:1)或其使用限定的化学接头或更大的聚合PEG接头的肽二聚体(例如Johnson和Jolliffe,Nephrology Dialysis Transplantation 15(9):1274-1277,2000中描述的那些)，ERB1–7(例如McConnell等，Biol.Chem.379(10):1279-86,1998中所述的那些)，EPO-R衍生肽(ERP)(例如Naranda等，et al.,PNAS96(13):7569-7574,1999中所述的那些)，EMP20(YSCHFGPLTWVCK(SEQ ID NO:2))(Johnson等，,Biochemistry 37(11):3699-3710,1998中所述的那些,AGEM400(羟乙基淀粉)，以及pegosihedide(例如在Gupta和Wish,Curr.Opin.Nephrol.Hypertens.27(5):345-350,2018中描述的那些)。EPO-模拟肽的其他实例是本领域已知的。

在一些实施方案中，第二培养基包含约0.1μg/mL至约50μg/mL、约0.1μg/mL至约45μg/mL、约0.1μg/mL至约40μg/mL、约0.1μg/mL至约35μg/mL、约0.1μg/mL至约30μg/mL、约0.1μg/mL至约25μg/mL、约0.1μg/mL至约20μg/mL、约0.1μg/mL约15μg/mL、约0.1μg/mL至约10μg/mL、约0.1μg/mL至约5μg/mL、约0.1μg/mL至约2μg/mL、约0.1μg/mL至约1μg/mL、约1μg/mL至约50μg/mL、约1μg/mL至约45μg/mL、约1μg/mL至约40μg/mL、约1μg/mL至约35μg/mL、约1μg/mL至约30μg/mL、约1μg/mL至约25μg/mL、约1μg/mL至约20μg/mL、约1μg/mL约15μg/mL、约1μg/mL至约10μg/mL、约1μg/mL至约5μg/mL、约1μg/mL至约2μg/mL、约2μg/mL至约50μg/mL、约2μg/mL至约45μg/mL、约2μg/mL至约40μg/mL、约2μg/mL至约35μg/mL、约2μg/mL至约30μg/mL、约2μg/mL至约25μg/mL、约2μg/mL至约20μg/mL、约2μg/mL约15μg/mL、约2μg/mL至约10μg/mL、约2μg/mL至约5μg/mL、约5μg/mL至约50μg/mL、约5μg/mL至约45μg/mL、约5μg/mL至约40μg/mL、约5μg/mL至约35μg/mL、约5μg/mL至约30μg/mL、约5μg/mL至约25μg/mL、约5μg/mL至约20μg/mL、约5μg/mL约15μg/mL、约5μg/mL至约10μg/mL、约10μg/mL至约50μg/mL、约10μg/mL至约45μg/mL、约10μg/mL至约40μg/mL、约10μg/mL至约35μg/mL、约10μg/mL至约30μg/mL、约10μg/mL至约25μg/mL、约10μg/mL至约20μg/mL、约10μg/mL约15μg/mL、约15μg/mL至约50μg/mL、约15μg/mL至约45μg/mL、约15μg/mL至约40μg/mL、约15μg/mL至约35μg/mL、约15μg/mL至约30μg/mL、约15μg/mL至约25μg/mL、约15μg/mL至约20μg/mL、约20μg/mL至约50μg/mL、约20μg/mL至约45μg/mL、约20μg/mL至约40μg/mL、约20μg/mL至约35μg/mL、约20μg/mL至约30μg/mL、约20μg/mL至约25μg/mL、约25μg/mL至约50μg/mL、约25μg/mL至约45μg/mL、约25μg/mL至约40μg/mL、约25μg/mL至约35μg/mL、约25μg/mL至约30μg/mL、约30μg/mL至约50μg/mL、约30μg/mL至约45μg/mL、约30μg/mL至约40μg/mL、约30μg/mL至约35μg/mL、约35μg/mL至约50μg/mL、约35μg/mL至约45μg/mL、约35μg/mL至约40μg/mL、约40μg/mL至约50μg/mL、约40μg/mL至约45μg/mL、或约45μg/mL至约50μg/mL的胰岛素(例如，人胰岛素)。在本文所述的任何第二培养基的一些实施方案中，第二培养基包含伊思柯夫改良杜氏培养基(Iscove'smodified Dulbecco's medium，IMDM)。在本文所述的任何第二培养基的一些实施方案中，第二培养基包含约1μg/mL至约10μg/mL(或本文所述的该范围的任何子范围)的脂质(例如，脂质混合物)。在本文所述的任何第二培养基的一些实施方案中，第二培养基包含约0.1mM至约10mM(或本文所述的该范围的任何子范围)的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。在本文所述的任何第二培养基的一些实施方案中，第二培养基包含0.1％w/v至约4％w/v(或本文所述的该范围的任何子范围)的人血清白蛋白。在本文所述的任何第二培养基的一些实施方案中，第二培养基包含约0.1％w/v至约3％w/v(或本文所述的该范围的任何子范围)的泊洛沙姆-188(P188)。

在一些实施方案中，第二培养基可以是例如化学成分确定的液体培养基、无动物组分的液体培养基、或化学成分确定的无动物组分的液体培养基、和/或无血清液体培养基。

在步骤A之前的任选培养步骤

本文所述的任何方法的一些实施方案可进一步包括，在步骤(a)之前，(i)将多个红系祖细胞(例如，本文所述的或本领域已知的示例性红系祖细胞中的任一种)放置到包含在器皿(例如，生物反应器，摇管或摇瓶，例如，本文所述的示例性生物反应器，摇管或摇瓶中的任一种)中的第一培养基中以提供第一细胞培养物(例如，具有的初始细胞密度为约0.1x10

在一些实施方案中，步骤(i)包括将多个红系祖细胞(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性红系祖细胞)放置到包含在摇瓶(例如，具有本文所述任何示例性体积的本文所述任何示例性摇瓶)内的第一培养基中。在此类实施方案中，步骤(ii)包括在在摇瓶中以0.1xg至约50xg(或本文所述的该范围的任何子范围)温育第一细胞培养物。

在一些实施方案中，步骤(i)包括将多个红系祖细胞(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性红系祖细胞)放置到包含在摇管(例如，具有本文所述任何示例性体积的本文所述任何示例性摇管)内的第一培养基中。在此类实施方案中，步骤(ii)包括在摇管中以约0.1xg至约50xg(或本文所述的该范围的子范围中的任何一个)温育第一细胞培养物。

在一些实施方案中，步骤(i)包括将多个红系祖细胞(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性红系祖细胞)放置到本文所述的具有本文所述任何示例性体积的培养袋中。在此类实施方案中，步骤(ii)在培养袋中以约10个摇动循环/分钟至约50个摇动循环/分钟(或本文所述的该范围的任何子范围)的摇动速率温育第一细胞培养物。

在一些实施方案中，步骤(ii)包括对第一细胞培养物进行分批培养。

补料分批培养

在一些实施方案中，步骤(ii)包括对第一细胞培养物进行补料分批培养。在一些实施方案中，步骤(ii)中的补料分批培养包括随时间推移添加额外体积的第一培养基(例如，本文所述的任何示例性第一培养基)。在一些实施方案中，随时间推移向第一细胞培养物中连续地添加额外体积的第一培养基。在一些实施方案中，随时间推移向第一细胞培养物中周期性地添加额外体积的第一培养基(例如，每三天一次、每两天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每天五次、每天六次、每天七次、每天八次、每天九次、每天十次、每天十一次或每天十二次)。在一些实施方案中，将约0.1x至约10x(例如，约0.1x至约9.5x、约0.1x至约9.0x、约0.1x至约8.5x、约0.1x至约8.0x、约0.1x至约7.5x、约0.1x至约7.0x、约0.1x至约6.5x、约0.1x至约6.0x、约0.1x至约5.5x、约0.1x至约5.0x、约0.1x至约4.5x、约0.1x至约4.0x、约0.1x至约3.5x、约0.1x至约3.0x、约0.1x至约2.5x、约0.1x至约2.0x、约0.1x至约1.5x、约0.1x至约1.0x、约0.1x至约0.5x、约0.1x至约0.3x、约0.1x至约0.2x、约0.2x至约10x、约0.2x至约9.5x、约0.2x至约9.0x、约0.2x至约8.5x、约0.2x至约8.0x、约0.2x至约7.5x、约0.2x至约7.0x、约0.2x至约6.5x、约0.2x至约6.0x、约0.2x至约5.5x、约0.2x至约5.0x、约0.2x至约4.5x、约0.2x至约4.0x、约0.2x至约3.5x、约0.2x至约3.0x、约0.2x至约2.5x、约0.2x至约2.0x、约0.2x至约1.5x、约0.2x至约1.0x、约0.2x至约0.5x、约0.2x至约0.3x、约0.3x至约10x、约0.3x至约9.5x、约0.3x至约9.0x、约0.3x至约8.5x、约0.3x至约8.0x、约0.3x至约7.5x、约0.3x至约7.0x、约0.3x至约6.5x、约0.3x至约6.0x、约0.3x至约5.5x、约0.3x至约5.0x、约0.3x至约4.5x、约0.3x至约4.0x、约0.3x至约3.5x、约0.3x至约3.0x、约0.3x至约2.5x、约0.3x至约2.0x、约0.3x至约1.5x、约0.3x至约1.0x、约0.3x至约0.5x、约0.5x至约10x、约0.5x至约9.5x、约0.5x至约9.0x、约0.5x至约8.5x、约0.5x至约8.0x、约0.5x至约7.5x、约0.5x至约7.0x、约0.5x至约6.5x、约0.5x至约6.0x、约0.5x至约5.5x、约0.5x至约5.0x、约0.5x至约4.5x、约0.5x至约4.0x、约0.5x至约3.5x、约0.5x至约3.0x、约0.5x至约2.5x、约0.5x至约2.0x、约0.5x至约1.5x、约0.5x至约1.0x、约1.0x至约10x、约1.0x至约9.5x、约1.0x至约9.0x、约1.0x至约8.5x、约1.0x至约8.0x、约1.0x至约7.5x、约1.0x至约7.0x、约1.0x至约6.5x、约1.0x至约6.0x、约1.0x至约5.5x、约1.0x至约5.0x、约1.0x至约4.5x、约1.0x至约4.0x、约1.0x至约3.5x、约1.0x至约3.0x、约1.0x至约2.5x、约1.0x至约2.0x、约1.0x至约1.5x、约1.5x至约10x、约1.5x至约9.5x、约1.5x至约9.0x、约1.5x至约8.5x、约1.5x至约8.0x、约1.5x至约7.5x、约1.5x至约7.0x、约1.5x至约6.5x、约1.5x至约6.0x、约1.5x至约5.5x、约1.5x至约5.0x、约1.5x至约4.5x、约1.5x至约4.0x、约1.5x至约3.5x、约1.5x至约3.0x、约1.5x至约2.5x、约1.5x至约2.0x、约2.0x至约10x、约2.0x至约9.5x、约2.0x至约9.0x、约2.0x至约8.5x、约2.0x至约8.0x、约2.0x至约7.5x、约2.0x至约7.0x、约2.0x至约6.5x、约2.0x至约6.0x、约2.0x至约5.5x、约2.0x至约5.0x、约2.0x至约4.5x、约2.0x至约4.0x、约2.0x至约3.5x、约2.0x至约3.0x、约2.0x至约2.5x、约2.5x至约10x、约2.5x至约9.5x、约2.5x至约9.0x、约2.5x至约8.5x、约2.5x至约8.0x、约2.5x至约7.5x、约2.5x至约7.0x、约2.5x至约6.5x、约2.5x至约6.0x、约2.5x至约5.5x、约2.5x至约5.0x、约2.5x至约4.5x、约2.5x至约4.0x、约2.5x至约3.5x、约2.5x至约3.0x、约3.0x至约10x、约3.0x至约9.5x、约3.0x至约9.0x、约3.0x至约8.5x、约3.0x至约8.0x、约3.0x至约7.5x、约3.0x至约7.0x、约3.0x至约6.5x、约3.0x至约6.0x、约3.0x至约5.5x、约3.0x至约5.0x、约3.0x至约4.5x、约3.0x至约4.0x、约3.0x至约3.5x、约3.5x至约10x、约3.5x至约9.5x、约3.5x至约9.0x、约3.5x至约8.5x、约3.5x至约8.0x、约3.5x至约7.5x、约3.5x至约7.0x、约3.5x至约6.5x、约3.5x至约6.0x、约3.5x至约5.5x、约3.5x至约5.0x、约3.5x至约4.5x、约3.5x至约4.0x、约4.0x至约10x、约4.0x至约9.5x、约4.0x至约9.0x、约4.0x至约8.5x、约4.0x至约8.0x、约4.0x至约7.5x、约4.0x至约7.0x、约4.0x至约6.5x、约4.0x至约6.0x、约4.0x至约5.5x、约4.0x至约5.0x、约4.0x至约4.5x、约4.5x至约10x、约4.5x至约9.5x、约4.5x至约9.0x、约4.5x至约8.5x、约4.5x至约8.0x、约4.5x至约7.5x、约4.5x至约7.0x、约4.5x至约6.5x、约4.5x至约6.0x、约4.5x至约5.5x、约4.5x至约5.0x、约5.0x至约10x、约5.0x至约9.5x、约5.0x至约9.0x、约5.0x至约8.5x、约5.0x至约8.0x、约5.0x至约7.5x、约5.0x至约7.0x、约5.0x至约6.5x、约5.0x至约6.0x、约5.0x至约5.5x、约5.5x至约10x、约5.5x至约9.5x、约5.5x至约9.0x、约5.5x至约8.5x、约5.5x至约8.0x、约5.5x至约7.5x、约5.5x至约7.0x、约5.5x至约6.5x、约5.5x至约6.0x、约6.0x至约10x、约6.0x至约9.5x、约6.0x至约9.0x、约6.0x至约8.5x、约6.0x至约8.0x、约6.0x至约7.5x、约6.0x至约7.0x、约6.0x至约6.5x、约6.5x至约10x、约6.5x至约9.5x、约6.5x至约9.0x、约6.5x至约8.5x、约6.5x至约8.0x、约6.5x至约7.5x、约6.5x至约7.0x、约7.0x至约10x、约7.0x至约9.5x、约7.0x至约9.0x、约7.0x至约8.5x、约7.0x至约8.0x、约7.0x至约7.5x、约7.5x至约10x、约7.5x至约9.5x、约7.5x至约9.0x、约7.5x至约8.5x、约7.5x至约8.0x、约8.0x至约10x、约8.0x至约9.5x、约8.0x至约9.0x、约8.0x至约8.5x、约8.5x至约10x、约8.5x至约9.5x、约8.5x至约9.0x、约9.0x至约10x、约9.0x至约9.5x、或约9.5x至约10x体积的第一细胞培养物在步骤(i)后立即以每24小时的增量添加。在一些实施方案中，一旦第一细胞培养物达到特定靶细胞密度，例如约1.0x10

灌注培养

在一些实施方案中，步骤(ii)包括对第一细胞培养物进行灌注培养。在一些实施方案中，步骤(ii)包括以约10W/m

在一些实施方案中，步骤(ii)中的灌注培养可使用以下灌注率进行：约0.04nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约4nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约2nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约1nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约0.5nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约0.1nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约4nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约2nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约1nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约0.5nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约4nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约2nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约1nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约4nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约2nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约4nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约35nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约35nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约35nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约35nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约35nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约40nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约40nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约40nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约40nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约45nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约45nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约45nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约50nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约50nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、或约55nL/细胞/天至约60nL/细胞/天。在一些实施方案中，灌注速率随时间推移增加。

在一些实施方案中，步骤(ii)中的灌注培养可使用以下灌注率进行：约0.1器皿体积/天(VVD)至约3VVD(例如，约0.1VVD至约2.8VVD、约0.1VVD至约2.6VVD、约0.1VVD至约2.4VVD、约0.1VVD至约2.2VVD、约0.1VVD至约2.0VVD、约0.1VVD至约1.8VVD、约0.1VVD至约1.6VVD、约0.1VVD至约1.4VVD、约0.1VVD至约1.2VVD、约0.1VVD至约1.0VVD、约0.1VVD至约0.8VVD、约0.1VVD至约0.6VVD、约0.1VVD至约0.4VVD、约0.1VVD至约0.2VVD、约0.2VVD至约3VVD、约0.2VVD至约2.8VVD、约0.2VVD至约2.6VVD、约0.2VVD至约2.4VVD、约0.2VVD至约2.2VVD、约0.2VVD至约2.0VVD、约0.2VVD至约1.8VVD、约0.2VVD至约1.6VVD、约0.2VVD至约1.4VVD、约0.2VVD至约1.2VVD、约0.2VVD至约1.0VVD、约0.2VVD至约0.8VVD、约0.2VVD至约0.6VVD、约0.2VVD至约0.4VVD、约0.4VVD至约3VVD、约0.4VVD至约2.8VVD、约0.4VVD至约2.6VVD、约0.4VVD至约2.4VVD、约0.4VVD至约2.2VVD、约0.4VVD至约2.0VVD、约0.4VVD至约1.8VVD、约0.4VVD至约1.6VVD、约0.4VVD至约1.4VVD、约0.4VVD至约1.2VVD、约0.4VVD至约1.0VVD、约0.4VVD至约0.8VVD、约0.4VVD至约0.6VVD、约0.6VVD至约3VVD、约0.6VVD至约2.8VVD、约0.6VVD至约2.6VVD、约0.6VVD至约2.4VVD、约0.6VVD至约2.2VVD、约0.6VVD至约2.0VVD、约0.6VVD至约1.8VVD、约0.6VVD至约1.6VVD、约0.6VVD至约1.4VVD、约0.6VVD至约1.2VVD、约0.6VVD至约1.0VVD、约0.6VVD至约0.8VVD、约0.8VVD至约3VVD、约0.8VVD至约2.8VVD、约0.8VVD至约2.6VVD、约0.8VVD至约2.4VVD、约0.8VVD至约2.2VVD、约0.8VVD至约2.0VVD、约0.8VVD至约1.8VVD、约0.8VVD至约1.6VVD、约0.8VVD至约1.4VVD、约0.8VVD至约1.2VVD、约0.8VVD至约1.0VVD、约1.0VVD至约3VVD、约1.0VVD至约2.8VVD、约1.0VVD至约2.6VVD、约1.0VVD至约2.4VVD、约1.0VVD至约2.2VVD、约1.0VVD至约2.0VVD、约1.0VVD至约1.8VVD、约1.0VVD至约1.6VVD、约1.0VVD至约1.4VVD、约1.0VVD至约1.2VVD、约1.2VVD至约3VVD、约1.2VVD至约2.8VVD、约1.2VVD至约2.6VVD、约1.2VVD至约2.4VVD、约1.2VVD至约2.2VVD、约1.2VVD至约2.0VVD、约1.2VVD至约1.8VVD、约1.2VVD至约1.6VVD、约1.2VVD至约1.4VVD、约1.4VVD至约3VVD、约1.4VVD至约2.8VVD、约1.4VVD至约2.6VVD、约1.4VVD至约2.4VVD、约1.4VVD至约2.2VVD、约1.4VVD至约2.0VVD、约1.4VVD至约1.8VVD、约1.4VVD至约1.6VVD、约1.6VVD至约3VVD、约1.6VVD至约2.8VVD、约1.6VVD至约2.6VVD、约1.6VVD至约2.4VVD、约1.6VVD至约2.2VVD、约1.6VVD至约2.0VVD、约1.6VVD至约1.8VVD、约1.8VVD至约3VVD、约1.8VVD至约2.8VVD、约1.8VVD至约2.6VVD、约1.8VVD至约2.4VVD、约1.8VVD至约2.2VVD、约1.8VVD至约2.0VVD、约2.0VVD至约3VVD、约2.0VVD至约2.8VVD、约2.0VVD至约2.6VVD、约2.0VVD至约2.4VVD、约2.0VVD至约2.2VVD、约2.2VVD至约3VVD、约2.2VVD至约2.8VVD、约2.2VVD至约2.6VVD、约2.2VVD至约2.4VVD、约2.4VVD至约3VVD、约2.4VVD至约2.8VVD、约2.4VVD至约2.6VVD、约2.6VVD至约3VVD、约2.6VVD至约2.8VVD、或约2.8VVD至约3VVD)。

在一些实施方案中，步骤(ii)中的灌注培养包括，至少部分地，随时间推移向第一细胞培养物中添加额外体积的培养基(例如，第一培养基(例如，本文所述的任何示例性第一培养基))。在一些实施方案中，随时间推移向第一细胞培养物中连续地添加额外体积的培养基(例如，第一培养基(例如，本文所述的任何示例性第一培养基))。在一些实施方案中，随时间推移向第一细胞培养物中周期性地添加额外体积的培养基(例如，第一培养基(例如，本文所述的任何示例性第一培养基))(例如，每三天一次、每两天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每天五次、每天六次、每天七次、每天八次、每天九次、每天十次、每天十一次或每天十二次)。培养基(例如，本文所述的任何示例性第一培养基)的添加可以机械地进行，例如使用蠕动泵或灌注泵，或手动地(例如，通过无菌移液)进行。

在一些实施方案中，步骤(ii)中的灌注培养包括，至少部分地，随时间推移去除一定体积的培养基(例如，基本上不含细胞的培养基)。在一些实施方案中，随时间推移连续地去除培养基(例如，基本上不含细胞的培养基)。在一些实施方案中，培养基随时间推移周期性地(例如，每三天一次、每两天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每天五次、每天六次、每天七次、每天八次、每天九次、每天十次、每天十一次或每天十二次)去除。培养基(例如，基本上不含细胞的培养基)的去除可以机械地进行，例如，使用切向流过滤(TFF)或交替流过滤(ATF)，或手动地(例如，通过无菌移液)进行。本文描述了切向流过滤的另外的非限制性方面。在一些实施方案中，灌注培养包括使用切向过滤(例如切向流过滤(TFF)或交替切向过滤(ATF))。在一些实施方案中，切向过滤(例如切向流过滤或交替切向过滤)包括使用一个或多个具有下列平均孔尺寸的过滤器：约10nm至约6.0μm、约10nm至约5.5μm、约10nm至约5.0μm、约10nm至约4.5μm、约10nm至约4.0μm、约10nm至约3.5μm、约10nm至约3.0μm、约10nm至约2.5μm、约10nm至约2.0μm、约10nm至约1.5μm、约10nm至约1.0μm、约10nm至约0.5μm、约10nm至约0.2μm、10nm至约0.1μm、约10nm至约50nm、约50nm至约6.0μm、约50nm至约5.5μm、约50nm至约5.0μm、约50nm至约4.5μm、约50nm至约4.0μm、约50nm至约3.5μm、约50nm至约3.0μm、约50nm至约2.5μm、约50nm至约2.0μm、约50nm至约1.5μm、约50nm至约1.0μm、约50nm至约0.5μm、约50nm至约0.2μm、约50nm至约0.1μm、约0.1μm至约6.0μm、约0.1μm至约5.5μm、约0.1μm至约5.0μm、约0.1μm至约4.5μm、约0.1μm至约4.0μm、约0.1μm至约3.5μm、约0.1μm至约3.0μm、约0.1μm至约2.5μm、约0.1μm至约2.0μm、约0.1μm至约1.5μm、约0.1μm至约1.0μm、约0.1μm至约0.5μm、约0.1μm至约0.2μm、约0.2μm至约6.0μm、约0.2μm至约5.5μm、约0.2μm至约5.0μm、约0.2μm至约4.5μm、约0.2μm至约4.0μm、约0.2μm至约3.5μm、约0.2μm至约3.0μm、约0.2μm至约2.5μm、约0.2μm至约2.0μm、约0.2μm至约1.5μm、约0.2μm至约1.0μm、约0.2μm至约0.5μm、约0.5μm至约6.0μm、约0.5μm至约5.5μm、约0.5μm至约5.0μm、约0.5μm至约4.5μm、约0.5μm至约4.0μm、约0.5μm至约3.5μm、约0.5μm至约3.0μm、约0.5μm至约2.5μmM、约0.5μm至约2.0μm、约0.5μm至约1.5μm、约0.5μm至约1.0μm、约1.0μm至约6.0μm、约1.0μm至约5.5μm、约1.0μm至约5.0μm、约1.0μm至约4.5μm、约1.0μm至约4.0μm、约1.0μm至约3.5μm、约1.0μm至约3.0μm、约1.0μm至约2.5μm、约1.0μm至约2.0μm、约1.0μm至约1.5μm、约1.5μm至约6.0μm、约1.5μm至约5.5μm、约1.5μm至约5.0μm、约1.5μm至约4.5μm、约1.5μm至约4.0μm、约1.5μm至约3.5μm、约1.5μm至约3.0μm、约1.5μm至约2.5μm、约1.5μm至约2.0μm、约2.0μm至约6.0μm、约2.0μm至约5.5μm、约2.0μm至约5.0μm、约2.0μm至约4.5μm、约2.0μm至约4.0μm、约2.0μm至约3.5μm、约2.0μm至约3.0μm、约2.0μm至约2.5μm、约2.5μm至约6.0μm、约2.5μm至约5.5μm、约2.5μm至约5.0μm、约2.5μm至约4.5μm、约2.5μm至约4.0μm、约2.5μm至约3.5μm、约2.5μm至约3.0μm、约3.0μm至约6.0μm、约3.0μm至约5.5μm、约3.0μm至约5.0μm、约3.0μm至约4.5μm、约3.0μm至约4.0μm、约3.0μm至约3.5μm、约3.5μm至约6.0μm、约3.5μm至约5.5μm、约3.5μm至约5.0μm、约3.5μm至约4.5μm、约3.5μm至约4.0μm、约4.0μm至约6.0μm、约4.0μm至约5.5μm、约4.0μm至约5.0μm、约4.0μm至约4.5μm、约4.5μm至约6.0μm、约4.5μm至约5.5μm、约4.5μm至约5.0μm、约5.0μm至约6.0μm、约5.0μm至约5.5μm、或约5.5μm至约6.0μm。

在一些实施方案中，一旦第一细胞培养物达到特定靶细胞密度，例如1.0x10

在一些实施方案中，第一培养基包含一种或多种(例如，一种、两种、三种或四种)Flt-3配体(例如，0.1ng/mL至约200ng/mLFlt-3配体或本文所述的该范围的任何子范围)、SCF(例如，约1ng/mL至约1μg/mLSCF或本文所述的该范围的任何子范围)、IL-3(例如，约0.1ng/mL至约200ng/mLIL-3或本文所述的该范围的任何子范围)，和IL-6(例如，约0.1ng/mL至约200ng/mLIL-6或本文所述的该范围的任何子范围)。在本文所述的任何第一培养基的一些实施方案中，第一培养基包含CellGenixSCMG培养基。在本文所述的任何第一培养基的一些实施方案中，第一培养基包含IMDM。在任何第一培养基的一些实施方案中，第一培养基包含约0.1mM至约10mM(例如，约0.1mM至约9.5mM、约0.1mM至约9.0mM、约0.1mM至约8.5mM、约0.1mM至约8.0mM、约0.1mM至约7.5mM、约0.1mM至约7.0mM、约0.1mM至约6.5mM、约0.1mM至约6.0mM、约0.1mM至约5.5mM、约0.1mM至约5mM、约0.1mM至约4.5mM、约0.1mM至约4.0mM、约0.1mM至约3.5mM、约0.1mM至约3.0mM、约0.1mM至约2.5mM、约0.1mM至约2.0mM、约0.1mM至约1.5mM、约0.1mM至约1.0mM、约0.1mM至约0.5mM、约0.5mM至约10mM、约0.5mM至约9.5mM、约0.5mM至约9.0mM、约0.5mM至约8.5mM、约0.5mM至约8.0mM、约0.5mM至约7.5mM、约0.5mM至约7.0mM、约0.5mM至约6.5mM、约0.5mM至约6.0mM、约0.5mM至约5.5mM、约0.5mM至约5mM、约0.5mM至约4.5mM、约0.5mM至约4.0mM、约0.5mM至约3.5mM、约0.5mM至约3.0mM、约0.5mM至约2.5mM、约0.5mM至约2.0mM、约0.5mM至约1.5mM、约0.5mM至约1.0mM、约1.0mM至约10mM、约1.0mM至约9.5mM、约1.0mM至约9.0mM、约1.0mM至约8.5mM、约1.0mM至约8.0mM、约1.0mM至约7.5mM、约1.0mM至约7.0mM、约1.0mM至约6.5mM、约1.0mM至约6.0mM、约1.0mM至约5.5mM、约1.0mM至约5mM、约1.0mM至约4.5mM、约1.0mM至约4.0mM、约1.0mM至约3.5mM、约1.0mM至约3.0mM、约1.0mM至约2.5mM、约1.0mM至约2.0mM、约1.0mM至约1.5mM、约1.5mM至约10mM、约1.5mM至约9.5mM、约1.5mM至约9.0mM、约1.5mM至约8.5mM、约1.5mM至约8.0mM、约1.5mM至约7.5mM、约1.5mM至约7.0mM、约1.5mM至约6.5mM、约1.5mM至约6.0mM、约1.5mM至约5.5mM、约1.5mM至约5mM、约1.5mM至约4.5mM、约1.5mM至约4.0mM、约1.5mM至约3.5mM、约1.5mM至约3.0mM、约1.5mM至约2.5mM、约1.5mM至约2.0mM、约2.0mM至约10mM、约2.0mM至约9.5mM、约2.0mM至约9.0mM、约2.0mM至约8.5mM、约2.0mM至约8.0mM、约2.0mM至约7.5mM、约2.0mM至约7.0mM、约2.0mM至约6.5mM、约2.0mM至约6.0mM、约2.0mM至约5.5mM、约2.0mM至约5mM、约2.0mM至约4.5mM、约2.0mM至约4.0mM、约2.0mM至约3.5mM、约2.0mM至约3.0mM、约2.0mM至约2.5mM、约2.5mM至约10mM、约2.5mM至约9.5mM、约2.5mM至约9.0mM、约2.5mM至约8.5mM、约2.5mM至约8.0mM、约2.5mM至约7.5mM、约2.5mM至约7.0mM、约2.5mM至约6.5mM、约2.5mM至约6.0mM、约2.5mM至约5.5mM、约2.5mM至约5mM、约2.5mM至约4.5mM、约2.5mM至约4.0mM、约2.5mM至约3.5mM、约2.5mM至约3.0mM、约3.0mM至约10mM、约3.0mM至约9.5mM、约3.0mM至约9.0mM、约3.0mM至约8.5mM、约3.0mM至约8.0mM、约3.0mM至约7.5mM、约3.0mM至约7.0mM、约3.0mM至约6.5mM、约3.0mM至约6.0mM、约3.0mM至约5.5mM、约3.0mM至约5mM、约3.0mM至约4.5mM、约3.0mM至约4.0mM、约3.0mM至约3.5mM、约3.5mM至约10mM、约3.5mM至约9.5mM、约3.5mM至约9.0mM、约3.5mM至约8.5mM、约3.5mM至约8.0mM、约3.5mM至约7.5mM、约3.5mM至约7.0mM、约3.5mM至约6.5mM、约3.5mM至约6.0mM、约3.5mM至约5.5mM、约3.5mM至约5mM、约3.5mM至约4.5mM、约3.5mM至约4.0mM、约4.0mM至约10mM、约4.0mM至约9.5mM、约4.0mM至约9.0mM、约4.0mM至约8.5mM、约4.0mM至约8.0mM、约4.0mM至约7.5mM、约4.0mM至约7.0mM、约4.0mM至约6.5mM、约4.0mM至约6.0mM、约4.0mM至约5.5mM、约4.0mM至约5mM、约4.0mM至约4.5mM、约4.5mM至约10mM、约4.5mM至约9.5mM、约4.5mM至约9.0mM、约4.5mM至约8.5mM、约4.5mM至约8.0mM、约4.5mM至约7.5mM、约4.5mM至约7.0mM、约4.5mM至约6.5mM、约4.5mM至约6.0mM、约4.5mM至约5.5mM、约4.5mM至约5.0mM、约5.0mM至约10mM、约5.0mM至约9.5mM、约5.0mM至约9.0mM、约5.0mM至约8.5mM、约5.0mM至约8.0mM、约5.0mM至约7.5mM、约5.0mM至约7.0mM、约5.0mM至约6.5mM、约5.0mM至约6.0mM、约5.0mM至约5.5mM、约5.5mM至约10mM、约5.5mM至约9.5mM、约5.5mM至约9.0mM、约5.5mM至约8.5mM、约5.5mM至约8.0mM、约5.5mM至约7.5mM、约5.5mM至约7.0mM、约5.5mM至约6.5mM、约5.5mM至约6.0mM、约6.0mM至约10mM、约6.0mM至约9.5mM、约6.0mM至约9.0mM、约6.0mM至约8.5mM、约6.0mM至约8.0mM、约6.0mM至约7.5mM、约6.0mM至约7.0mM、约6.0mM至约6.5mM、约6.5mM至约10mM、约6.5mM至约9.5mM、约6.5mM至约9.0mM、约6.5mM至约8.5mM、约6.5mM至约8.0mM、约6.5mM至约7.5mM、约6.5mM至约7.0mM、约7.0mM至约10mM、约7.0mM至约9.5mM、约7.0mM至约9.0mM、约7.0mM至约8.5mM、约7.0mM至约8.0mM、约7.0mM至约7.5mM、约7.5mM至约10mM、约7.5mM至约9.5mM、约7.5mM至约9.0mM、约7.5mM至约8.5mM、约7.5mM至约8.0mM、约8.0mM至约10mM、约8.0mM至约9.5mM、约8.0mM至约9.0mM、约8.0mM至约8.5mM、约8.5mM至约10mM、约8.5mM至约9.5mM、约8.5mM至约9.0mM、约9.0mM至约10mM、约9.0mM至约9.5mM、或约9.5mM至约10mM)的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。

在本文所述的任何第一培养基的一些实施方案中，第一培养基包含约1μg/mL至约20μg/mL(例如，约1μg/mL至约19μg/mL、约1μg/mL至约18μg/mL、约1μg/mL至约17μg/mL、约1μg/mL至约16μg/mL、约1μg/mL至约15μg/mL、约1μg/mL至约14μg/mL、约1μg/mL至约13μg/mL、约1μg/mL至约12μg/mL、约1μg/mL至约11μg/mL、约1μg/mL至约10μg/mL、约1μg/mL至约9μg/mL、约1μg/mL至约8μg/mL、约1μg/mL至约7μg/mL、约1μg/mL至约6μg/mL、约1μg/mL至约5μg/mL、约1μg/mL至约4μg/mL、约1μg/mL至约3μg/mL、约1μg/mL至约2μg/mL、约2μg/mL至约20μg/mL、约2μg/mL至约19μg/mL、约2μg/mL至约18μg/mL、约2μg/mL至约17μg/mL、约2μg/mL至约16μg/mL、约2μg/mL至约15μg/mL、约2μg/mL至约14μg/mL、约2μg/mL至约13μg/mL、约2μg/mL至约12μg/mL、约2μg/mL至约11μg/mL、约2μg/mL至约10μg/mL、约2μg/mL至约9μg/mL、约2μg/mL至约8μg/mL、约2μg/mL至约7μg/mL、约2μg/mL至约6μg/mL、约2μg/mL至约5μg/mL、约2μg/mL至约4μg/mL、约2μg/mL至约3μg/mL、约3μg/mL至约20μg/mL、约3μg/mL至约19μg/mL、约3μg/mL至约18μg/mL、约3μg/mL至约17μg/mL、约3μg/mL至约16μg/mL、约3μg/mL至约15μg/mL、约3μg/mL至约14μg/mL、约3μg/mL至约13μg/mL、约3μg/mL至约12μg/mL、约3μg/mL至约11μg/mL、约3μg/mL至约10μg/mL、约3μg/mL至约9μg/mL、约3μg/mL至约8μg/mL、约3μg/mL至约7μg/mL、约3μg/mL至约6μg/mL、约3μg/mL至约5μg/mL、约3μg/mL至约4μg/mL、约4μg/mL至约20μg/mL、约4μg/mL至约19μg/mL、约4μg/mL至约18μg/mL、约4μg/mL至约17μg/mL、约4μg/mL至约16μg/mL、约4μg/mL至约15μg/mL、约4μg/mL至约14μg/mL、约4μg/mL至约13μg/mL、约4μg/mL至约12μg/mL、约4μg/mL至约11μg/mL、约4μg/mL至约10μg/mL、约4μg/mL至约9μg/mL、约4μg/mL至约8μg/mL、约4μg/mL至约7μg/mL、约4μg/mL至约6μg/mL、约4μg/mL至约5μg/mL、约5μg/mL至约20μg/mL、约5μg/mL至约19μg/mL、约5μg/mL至约18μg/mL、约5μg/mL至约17μg/mL、约5μg/mL至约16μg/mL、约5μg/mL至约15μg/mL、约5μg/mL至约14μg/mL、约5μg/mL至约13μg/mL、约5μg/mL至约12μg/mL、约5μg/mL至约11μg/mL、约5μg/mL至约10μg/mL、约5μg/mL至约9μg/mL、约5μg/mL至约8μg/mL、约5μg/mL至约7μg/mL、约5μg/mL至约6μg/mL、约6μg/mL至约20μg/mL、约6μg/mL至约19μg/mL、约6μg/mL至约18μg/mL、约6μg/mL至约17μg/mL、约6μg/mL至约16μg/mL、约6μg/mL至约15μg/mL、约6μg/mL至约14μg/mL、约6μg/mL至约13μg/mL、约6μg/mL至约12μg/mL、约6μg/mL至约11μg/mL、约6μg/mL至约10μg/mL、约6μg/mL至约9μg/mL、约6μg/mL至约8μg/mL、约6μg/mL至约7μg/mL、约7μg/mL至约20μg/mL、约7μg/mL至约19μg/mL、约7μg/mL至约18μg/mL、约7μg/mL至约17μg/mL、约7μg/mL至约16μg/mL、约7μg/mL至约15μg/mL、约7μg/mL至约14μg/mL、约7μg/mL至约13μg/mL、约7μg/mL至约12μg/mL、约7μg/mL至约11μg/mL、约7μg/mL至约10μg/mL、约7μg/mL至约9μg/mL、约7μg/mL至约8μg/mL、约8μg/mL至约20μg/mL、约8μg/mL至约19μg/mL、约8μg/mL至约18μg/mL、约8μg/mL至约17μg/mL、约8μg/mL至约16μg/mL、约8μg/mL至约15μg/mL、约8μg/mL至约14μg/mL、约8μg/mL至约13μg/mL、约8μg/mL至约12μg/mL、约8μg/mL至约11μg/mL、约8μg/mL至约10μg/mL、约8μg/mL至约9μg/mL、约9μg/mL至约20μg/mL、约9μg/mL至约19μg/mL、约9μg/mL至约18μg/mL、约9μg/mL至约17μg/mL、约9μg/mL至约16μg/mL、约9μg/mL至约15μg/mL、约9μg/mL至约14μg/mL、约9μg/mL至约13μg/mL、约9μg/mL至约12μg/mL、约9μg/mL至约11μg/mL、约9μg/mL至约10μg/mL、约10μg/mL至约20μg/mL、约10μg/mL至约19μg/mL、约10μg/mL至约18μg/mL、约10μg/mL至约17μg/mL、约10μg/mL至约16μg/mL、约10μg/mL至约15μg/mL、约10μg/mL至约14μg/mL、约10μg/mL至约13μg/mL、约10μg/mL至约12μg/mL、约10μg/mL至约11μg/mL、约11μg/mL至约20μg/mL、约11μg/mL至约19μg/mL、约11μg/mL至约18μg/mL、约11μg/mL至约17μg/mL、约11μg/mL至约16μg/mL、约11μg/mL至约15μg/mL、约11μg/mL至约14μg/mL、约11μg/mL至约13μg/mL、约11μg/mL至约12μg/mL、12μg/mL至约20μg/mL、约12μg/mL至约19μg/mL、约12μg/mL至约18μg/mL、约12μg/mL至约17μg/mL、约12μg/mL至约16μg/mL、约12μg/mL至约15μg/mL、约12μg/mL至约14μg/mL、约12μg/mL至约13μg/mL、13μg/mL至约20μg/mL、约13μg/mL至约19μg/mL、约13μg/mL至约18μg/mL、约13μg/mL至约17μg/mL、约13μg/mL至约16μg/mL、约13μg/mL至约15μg/mL、约13μg/mL至约14μg/mL、14μg/mL至约20μg/mL、约14μg/mL至约19μg/mL、约14μg/mL至约18μg/mL、约14μg/mL至约17μg/mL、约14μg/mL至约16μg/mL、约14μg/mL至约15μg/mL、15μg/mL至约20μg/mL、约15μg/mL至约19μg/mL、约15μg/mL至约18μg/mL、约15μg/mL至约17μg/mL、约15μg/mL至约16μg/mL、16μg/mL至约20μg/mL、约16μg/mL至约19μg/mL、约16μg/mL至约18μg/mL、约16μg/mL至约17μg/mL、17μg/mL至约20μg/mL、约17μg/mL至约19μg/mL、约17μg/mL至约18μg/mL、约18μg/mL至约20μg/mL、约18μg/mL至约19μg/mL、或约19μg/mL至约20μg/mL)胰岛素(例如，人胰岛素)。

在本文所述的任何第一培养基的一些实施方案中，第一培养基包含脂质(例如，脂质混合物)。

在本文所述的任何第一培养基的一些实施方案中，第一培养基包含运铁蛋白(例如，脱铁运铁蛋白、全铁运铁蛋白或它们的组合)(例如，约50μg/mL至约400μg/mL、约50μg/mL至约350μg/mL、约50μg/mL至约300μg/mL、约50μg/mL至约250μg/mL、约50μg/mL至约200μg/mL、约50μg/mL至约150μg/mL、约50μg/mL至约100μg/mL、约100μg/mL至约400μg/mL、约100μg/mL至约350μg/mL、约100μg/mL至约300μg/mL、约100μg/mL至约250μg/mL、约100μg/mL至约200μg/mL、约100μg/mL至约150μg/mL、约150μg/mL至约400μg/mL、约150μg/mL至约350μg/mL、约150μg/mL至约300μg/mL、约150μg/mL至约250μg/mL、约150μg/mL至约200μg/mL、约200μg/mL至约400μg/mL、约200μg/mL至约350μg/mL、约200μg/mL至约300μg/mL、约200μg/mL至约250μg/mL、约250μg/mL至约400μg/mL、约250μg/mL至约350μg/mL、约250μg/mL至约300μg/mL、约300μg/mL至约400μg/mL、约300μg/mL至约350μg/mL、或约350至约400μg/mL的运铁蛋白(例如，脱铁运铁蛋白、全铁运铁蛋白或它们的组合)。

在一些实施方案中，第一培养基包含约0.1ng/mL至约200ng/mL、约0.1ng/mL至约190ng/mL、约0.1ng/mL至约180ng/mL、约0.1ng/mL至约170ng/mL、约0.1ng/mL至约160ng/mL、约0.1ng/mL至约150ng/mL、约0.1ng/mL至约140ng/mL、约0.1ng/mL至约130ng/mL、约0.1ng/mL至约120ng/mL、约0.1ng/mL至约110ng/mL、约0.1ng/mL至约100ng/mL、约0.1ng/mL至约90ng/mL、约0.1ng/mL至约80ng/mL、约0.1ng/mL至约70ng/mL、约0.1ng/mL至约60ng/mL、约0.1ng/mL至约50ng/mL、约0.1ng/mL至约40ng/mL、约0.1ng/mL至约30ng/mL、约0.1ng/mL至约20ng/mL、约0.1ng/mL至约10ng/mL、约0.1ng/mL至约5ng/mL、约5ng/mL至约200ng/mL、约5ng/mL至约190ng/mL、约5ng/mL至约180ng/mL、约5ng/mL至约170ng/mL、约5ng/mL至约160ng/mL、约5ng/mL至约150ng/mL、约5ng/mL至约140ng/mL、约5ng/mL至约130ng/mL、约5ng/mL至约120ng/mL、约5ng/mL至约110ng/mL、约5ng/mL至约100ng/mL、约5ng/mL至约90ng/mL、约5ng/mL至约80ng/mL、约5ng/mL至约70ng/mL、约5ng/mL至约60ng/mL、约5ng/mL至约50ng/mL、约5ng/mL至约40ng/mL、约5ng/mL至约30ng/mL、约5ng/mL至约20ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约200ng/mL、约10ng/mL至约190ng/mL、约10ng/mL至约180ng/mL、约10ng/mL至约170ng/mL、约10ng/mL至约160ng/mL、约10ng/mL至约150ng/mL、约10ng/mL至约140ng/mL、约10ng/mL至约130ng/mL、约10ng/mL至约120ng/mL、约10ng/mL至约110ng/mL、约10ng/mL至约100ng/mL、约10ng/mL至约90ng/mL、约10ng/mL至约80ng/mL、约10ng/mL至约70ng/mL、约10ng/mL至约60ng/mL、约10ng/mL至约50ng/mL、约10ng/mL至约40ng/mL、约10ng/mL至约30ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约20ng/mL至约200ng/mL、约20ng/mL至约190ng/mL、约20ng/mL至约180ng/mL、约20ng/mL至约170ng/mL、约20ng/mL至约160ng/mL、约20ng/mL至约150ng/mL、约20ng/mL至约140ng/mL、约20ng/mL至约130ng/mL、约20ng/mL至约120ng/mL、约20ng/mL至约110ng/mL、约20ng/mL至约100ng/mL、约20ng/mL至约90ng/mL、约20ng/mL至约80ng/mL、约20ng/mL至约70ng/mL、约20ng/mL至约60ng/mL、约20ng/mL至约50ng/mL、约20ng/mL至约40ng/mL、约20ng/mL至约30ng/mL、约30ng/mL至约200ng/mL、约30ng/mL至约190ng/mL、约30ng/mL至约180ng/mL、约30ng/mL至约170ng/mL、约30ng/mL至约160ng/mL、约30ng/mL至约150ng/mL、约30ng/mL至约140ng/mL、约30ng/mL至约130ng/mL、约30ng/mL至约120ng/mL、约30ng/mL至约110ng/mL、约30ng/mL至约100ng/mL、约30ng/mL至约90ng/mL、约30ng/mL至约80ng/mL、约30ng/mL至约70ng/mL、约30ng/mL至约60ng/mL、约30ng/mL至约50ng/mL、约30ng/mL至约40ng/mL、约40ng/mL至约200ng/mL、约40ng/mL至约190ng/mL、约40ng/mL至约180ng/mL、约40ng/mL至约170ng/mL、约40ng/mL至约160ng/mL、约40ng/mL至约150ng/mL、约40ng/mL至约140ng/mL、约40ng/mL至约130ng/mL、约40ng/mL至约120ng/mL、约40ng/mL至约110ng/mL、约40ng/mL至约100ng/mL、约40ng/mL至约90ng/mL、约40ng/mL至约80ng/mL、约40ng/mL至约70ng/mL、约40ng/mL至约60ng/mL、约40ng/mL至约50ng/mL、约50ng/mL至约200ng/mL、约50ng/mL至约190ng/mL、约50ng/mL至约180ng/mL、约50ng/mL至约170ng/mL、约50ng/mL至约160ng/mL、约50ng/mL至约150ng/mL、约50ng/mL至约140ng/mL、约50ng/mL至约130ng/mL、约50ng/mL至约120ng/mL、约50ng/mL至约110ng/mL、约50ng/mL至约100ng/mL、约50ng/mL至约90ng/mL、约50ng/mL至约80ng/mL、约50ng/mL至约70ng/mL、约50ng/mL至约60ng/mL、约60ng/mL至约200ng/mL、约60ng/mL至约190ng/mL、约60ng/mL至约180ng/mL、约60ng/mL至约170ng/mL、约60ng/mL至约160ng/mL、约60ng/mL至约150ng/mL、约60ng/mL至约140ng/mL、约60ng/mL至约130ng/mL、约60ng/mL至约120ng/mL、约60ng/mL至约110ng/mL、约60ng/mL至约100ng/mL、约60ng/mL至约90ng/mL、约60ng/mL至约80ng/mL、约60ng/mL至约70ng/mL、约70ng/mL至约200ng/mL、约70ng/mL至约190ng/mL、约70ng/mL至约180ng/mL、约70ng/mL至约170ng/mL、约70ng/mL至约160ng/mL、约70ng/mL至约150ng/mL、约70ng/mL至约140ng/mL、约70ng/mL至约130ng/mL、约70ng/mL至约120ng/mL、约70ng/mL至约110ng/mL、约70ng/mL至约100ng/mL、约70ng/mL至约90ng/mL、约70ng/mL至约80ng/mL、约80ng/mL至约200ng/mL、约80ng/mL至约190ng/mL、约80ng/mL至约180ng/mL、约80ng/mL至约170ng/mL、约80ng/mL至约160ng/mL、约80ng/mL至约150ng/mL、约80ng/mL至约140ng/mL、约80ng/mL至约130ng/mL、约80ng/mL至约120ng/mL、约80ng/mL至约110ng/mL、约80ng/mL至约100ng/mL、约80ng/mL至约90ng/mL、约90ng/mL至约200ng/mL、约90ng/mL至约190ng/mL、约90ng/mL至约180ng/mL、约90ng/mL至约170ng/mL、约90ng/mL至约160ng/mL、约90ng/mL至约150ng/mL、约90ng/mL至约140ng/mL、约90ng/mL至约130ng/mL、约90ng/mL至约120ng/mL、约90ng/mL至约110ng/mL、约90ng/mL至约100ng/mL、约100ng/mL至约200ng/mL、约100ng/mL至约190ng/mL、约100ng/mL至约180ng/mL、约100ng/mL至约170ng/mL、约100ng/mL至约160ng/mL、约100ng/mL至约150ng/mL、约100ng/mL至约140ng/mL、约100ng/mL至约130ng/mL、约100ng/mL至约120ng/mL、约100ng/mL至约110ng/mL、约110ng/mL至约200ng/mL、约110ng/mL至约190ng/mL、约110ng/mL至约180ng/mL、约110ng/mL至约170ng/mL、约110ng/mL至约160ng/mL、约110ng/mL至约150ng/mL、约110ng/mL至约140ng/mL、约110ng/mL至约130ng/mL、约110ng/mL至约120ng/mL、约120ng/mL至约200ng/mL、约120ng/mL至约190ng/mL、约120ng/mL至约180ng/mL、约120ng/mL至约170ng/mL、约120ng/mL至约160ng/mL、约120ng/mL至约150ng/mL、约120ng/mL至约140ng/mL、约120ng/mL至约130ng/mL、约130ng/mL至约200ng/mL、约130ng/mL至约190ng/mL、约130ng/mL至约180ng/mL、约130ng/mL至约170ng/mL、约130ng/mL至约160ng/mL、约130ng/mL至约150ng/mL、约130ng/mL至约140ng/mL、约140ng/mL至约200ng/mL、约140ng/mL至约190ng/mL、约140ng/mL至约180ng/mL、约140ng/mL至约170ng/mL、约140ng/mL至约160ng/mL、约140ng/mL至约150ng/mL、约150ng/mL至约200ng/mL、约150ng/mL至约190ng/mL、约150ng/mL至约180ng/mL、约150ng/mL至约170ng/mL、约150ng/mL至约160ng/mL、约160ng/mL至约200ng/mL、约160ng/mL至约190ng/mL、约160ng/mL至约180ng/mL、约160ng/mL至约170ng/mL、约170ng/mL至约200ng/mL、约170ng/mL至约190ng/mL、约170ng/mL至约180ng/mL、约180ng/mL至约200ng/mL、约180ng/mL至约190ng/mL、或约190ng/mL至约200ng/mL的Flt-3配体(例如，重组人Flt-3配体)。

在一些实施方案中，第一培养基包含约1ng/mL至约1μg/mL、约1ng/mL至约950ng/mL、约1ng/mL至约900ng/mL、约1ng/mL至约850ng/mL、约1ng/mL至约800ng/mL、约1ng/mL至约750ng/mL、约1ng/mL至约700ng/mL、约1ng/mL至约650ng/mL、约1ng/mL至约600ng/mL、约1ng/mL至约550ng/mL、约1ng/mL至约500ng/mL、约1ng/mL至约450ng/mL、约1ng/mL至约400ng/mL、约1ng/mL至约350ng/mL、约1ng/mL至约300ng/mL、约1ng/mL至约250ng/mL、约1ng/mL至约200ng/mL、约1ng/mL至约150ng/mL、约1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约50ng/mL、约1ng/mL至约25ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、约5ng/mL至约1μg/mL、约5ng/mL至约950ng/mL、约5ng/mL至约900ng/mL、约5ng/mL至约850ng/mL、约5ng/mL至约800ng/mL、约5ng/mL至约750ng/mL、约5ng/mL至约700ng/mL、约5ng/mL至约650ng/mL、约5ng/mL至约600ng/mL、约5ng/mL至约550ng/mL、约5ng/mL至约500ng/mL、约5ng/mL至约450ng/mL、约5ng/mL至约400ng/mL、约5ng/mL至约350ng/mL、约5ng/mL至约300ng/mL、约5ng/mL至约250ng/mL、约5ng/mL至约200ng/mL、约5ng/mL至约150ng/mL、约5ng/mL至约100ng/mL、约5ng/mL至约50ng/mL、约5ng/mL至约25ng/mL、约5ng/mL至约20ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约1μg/mL、约10ng/mL至约950ng/mL、约10ng/mL至约900ng/mL、约10ng/mL至约850ng/mL、约10ng/mL至约800ng/mL、约10ng/mL至约750ng/mL、约10ng/mL至约700ng/mL、约10ng/mL至约650ng/mL、约10ng/mL至约600ng/mL、约10ng/mL至约550ng/mL、约10ng/mL至约500ng/mL、约10ng/mL至约450ng/mL、约10ng/mL至约400ng/mL、约10ng/mL至约350ng/mL、约10ng/mL至约300ng/mL、约10ng/mL至约250ng/mL、约10ng/mL至约200ng/mL、约10ng/mL至约150ng/mL、约10ng/mL至约100ng/mL、约10ng/mL至约50ng/mL、约10ng/mL至约25ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约10ng/mL至约15ng/mL、约15ng/mL至约1μg/mL、约15ng/mL至约950ng/mL、约15ng/mL至约900ng/mL、约15ng/mL至约850ng/mL、约15ng/mL至约800ng/mL、约15ng/mL至约750ng/mL、约15ng/mL至约700ng/mL、约15ng/mL至约650ng/mL、约15ng/mL至约600ng/mL、约15ng/mL至约550ng/mL、约15ng/mL至约500ng/mL、约15ng/mL至约450ng/mL、约15ng/mL至约400ng/mL、约15ng/mL至约350ng/mL、约15ng/mL至约300ng/mL、约15ng/mL至约250ng/mL、约15ng/mL至约200ng/mL、约15ng/mL至约150ng/mL、约15ng/mL至约100ng/mL、约15ng/mL至约50ng/mL、约15ng/mL至约25ng/mL、约15ng/mL至约20ng/mL、约20ng/mL至约1μg/mL、约20ng/mL至约950ng/mL、约20ng/mL至约900ng/mL、约20ng/mL至约850ng/mL、约20ng/mL至约800ng/mL、约20ng/mL至约750ng/mL、约20ng/mL至约700ng/mL、约20ng/mL至约650ng/mL、约20ng/mL至约600ng/mL、约20ng/mL至约550ng/mL、约20ng/mL至约500ng/mL、约20ng/mL至约450ng/mL、约20ng/mL至约400ng/mL、约20ng/mL至约350ng/mL、约20ng/mL至约300ng/mL、约20ng/mL至约250ng/mL、约20ng/mL至约200ng/mL、约20ng/mL至约150ng/mL、约20ng/mL至约100ng/mL、约20ng/mL至约50ng/mL、约20ng/mL至约25ng/mL、约25ng/mL至约1μg/mL、约25ng/mL至约950ng/mL、约25ng/mL至约900ng/mL、约25ng/mL至约850ng/mL、约25ng/mL至约800ng/mL、约25ng/mL至约750ng/mL、约25ng/mL至约700ng/mL、约25ng/mL至约650ng/mL、约25ng/mL至约600ng/mL、约25ng/mL至约550ng/mL、约25ng/mL至约500ng/mL、约25ng/mL至约450ng/mL、约25ng/mL至约400ng/mL、约25ng/mL至约350ng/mL、约25ng/mL至约300ng/mL、约25ng/mL至约250ng/mL、约25ng/mL至约200ng/mL、约25ng/mL至约150ng/mL、约25ng/mL至约100ng/mL、约25ng/mL至约50ng/mL、约50ng/mL至约1μg/mL、约50ng/mL至约950ng/mL、约50ng/mL至约900ng/mL、约50ng/mL至约850ng/mL、约50ng/mL至约800ng/mL、约50ng/mL至约750ng/mL、约50ng/mL至约700ng/mL、约50ng/mL至约650ng/mL、约50ng/mL至约600ng/mL、约50ng/mL至约550ng/mL、约50ng/mL至约500ng/mL、约50ng/mL至约450ng/mL、约50ng/mL至约400ng/mL、约50ng/mL至约350ng/mL、约50ng/mL至约300ng/mL、约50ng/mL至约250ng/mL、约50ng/mL至约200ng/mL、约50ng/mL至约150ng/mL、约50ng/mL至约100ng/mL、约100ng/mL至约1μg/mL、约100ng/mL至约950ng/mL、约100ng/mL至约900ng/mL、约100ng/mL至约850ng/mL、约100ng/mL至约800ng/mL、约100ng/mL至约750ng/mL、约100ng/mL至约700ng/mL、约100ng/mL至约650ng/mL、约100ng/mL至约600ng/mL、约100ng/mL至约550ng/mL、约100ng/mL至约500ng/mL、约100ng/mL至约450ng/mL、约100ng/mL至约400ng/mL、约100ng/mL至约350ng/mL、约100ng/mL至约300ng/mL、约100ng/mL至约250ng/mL、约100ng/mL至约200ng/mL、约100ng/mL至约150ng/mL、约150ng/mL至约1μg/mL、约150ng/mL至约950ng/mL、约150ng/mL至约900ng/mL、约150ng/mL至约850ng/mL、约150ng/mL至约800ng/mL、约150ng/mL至约750ng/mL、约150ng/mL至约700ng/mL、约150ng/mL至约650ng/mL、约150ng/mL至约600ng/mL、约150ng/mL至约550ng/mL、约150ng/mL至约500ng/mL、约150ng/mL至约450ng/mL、约150ng/mL至约400ng/mL、约150ng/mL至约350ng/mL、约150ng/mL至约300ng/mL、约150ng/mL至约250ng/mL、约150ng/mL至约200ng/mL、约200ng/mL至约1μg/mL、约200ng/mL至约950ng/mL、约200ng/mL至约900ng/mL、约200ng/mL至约850ng/mL、约200ng/mL至约800ng/mL、约200ng/mL至约750ng/mL、约200ng/mL至约700ng/mL、约200ng/mL至约650ng/mL、约200ng/mL至约600ng/mL、约200ng/mL至约550ng/mL、约200ng/mL至约500ng/mL、约200ng/mL至约450ng/mL、约200ng/mL至约400ng/mL、约200ng/mL至约350ng/mL、约200ng/mL至约300ng/mL、约200ng/mL至约250ng/mL、约250ng/mL至约1μg/mL、约250ng/mL至约950ng/mL、约250ng/mL至约900ng/mL、约250ng/mL至约850ng/mL、约250ng/mL至约800ng/mL、约250ng/mL至约750ng/mL、约250ng/mL至约700ng/mL、约250ng/mL至约650ng/mL、约250ng/mL至约600ng/mL、约250ng/mL至约550ng/mL、约250ng/mL至约500ng/mL、约250ng/mL至约450ng/mL、约250ng/mL至约400ng/mL、约250ng/mL至约350ng/mL、约250ng/mL至约300ng/mL、约300ng/mL至约1μg/mL、约300ng/mL至约950ng/mL、约300ng/mL至约900ng/mL、约300ng/mL至约850ng/mL、约300ng/mL至约800ng/mL、约300ng/mL至约750ng/mL、约300ng/mL至约700ng/mL、约300ng/mL至约650ng/mL、约300ng/mL至约600ng/mL、约300ng/mL至约550ng/mL、约300ng/mL至约500ng/mL、约300ng/mL至约450ng/mL、约300ng/mL至约400ng/mL、约300ng/mL至约350ng/mL、约350ng/mL至约1μg/mL、约350ng/mL至约950ng/mL、约350ng/mL至约900ng/mL、约350ng/mL至约850ng/mL、约350ng/mL至约800ng/mL、约350ng/mL至约750ng/mL、约350ng/mL至约700ng/mL、约350ng/mL至约650ng/mL、约350ng/mL至约600ng/mL、约350ng/mL至约550ng/mL、约350ng/mL至约500ng/mL、约350ng/mL至约450ng/mL、约350ng/mL至约400ng/mL、约400ng/mL至约1μg/mL、约400ng/mL至约950ng/mL、约400ng/mL至约900ng/mL、约400ng/mL至约850ng/mL、约400ng/mL至约800ng/mL、约400ng/mL至约750ng/mL、约400ng/mL至约700ng/mL、约400ng/mL至约650ng/mL、约400ng/mL至约600ng/mL、约400ng/mL至约550ng/mL、约400ng/mL至约500ng/mL、约400ng/mL至约450ng/mL、约450ng/mL至约1μg/mL、约450ng/mL至约950ng/mL、约450ng/mL至约900ng/mL、约450ng/mL至约850ng/mL、约450ng/mL至约800ng/mL、约450ng/mL至约750ng/mL、约450ng/mL至约700ng/mL、约450ng/mL至约650ng/mL、约450ng/mL至约600ng/mL、约450ng/mL至约550ng/mL、约450ng/mL至约500ng/mL、约500ng/mL至约1μg/mL、约500ng/mL至约950ng/mL、约500ng/mL至约900ng/mL、约500ng/mL至约850ng/mL、约500ng/mL至约800ng/mL、约500ng/mL至约750ng/mL、约500ng/mL至约700ng/mL、约500ng/mL至约650ng/mL、约500ng/mL至约600ng/mL、约500ng/mL至约550ng/mL、约550ng/mL至约1μg/mL、约550ng/mL至约950ng/mL、约550ng/mL至约900ng/mL、约550ng/mL至约850ng/mL、约550ng/mL至约800ng/mL、约550ng/mL至约750ng/mL、约550ng/mL至约700ng/mL、约550ng/mL至约650ng/mL、约550ng/mL至约600ng/mL、约600ng/mL至约1μg/mL、约600ng/mL至约950ng/mL、约600ng/mL至约900ng/mL、约600ng/mL至约850ng/mL、约600ng/mL至约800ng/mL、约600ng/mL至约750ng/mL、约600ng/mL至约700ng/mL、约600ng/mL至约650ng/mL、约650ng/mL至约1μg/mL、约650ng/mL至约950ng/mL、约650ng/mL至约900ng/mL、约650ng/mL至约850ng/mL、约650ng/mL至约800ng/mL、约650ng/mL至约750ng/mL、约650ng/mL至约700ng/mL、约700ng/mL至约1μg/mL、约700ng/mL至约950ng/mL、约700ng/mL至约900ng/mL、约700ng/mL至约850ng/mL、约700ng/mL至约800ng/mL、约700ng/mL至约750ng/mL、约750ng/mL至约1μg/mL、约750ng/mL至约950ng/mL、约750ng/mL至约900ng/mL、约750ng/mL至约850ng/mL、约750ng/mL至约800ng/mL、约800ng/mL至约1μg/mL、约800ng/mL至约950ng/mL、约800ng/mL至约900ng/mL、约800ng/mL至约850ng/mL、约850ng/mL至约1μg/mL、约850ng/mL至约950ng/mL、约850ng/mL至约900ng/mL、约900ng/mL至约1μg/mL、约900ng/mL至约950ng/mL、或约950ng/mL至约1μg/mL的SCF(例如，重组人干细胞因子)。

在一些实施方案中，第一培养基包含约0.1ng/mL至约200ng/mL、约0.1ng/mL至约190ng/mL、约0.1ng/mL至约180ng/mL、约0.1ng/mL至约170ng/mL、约0.1ng/mL至约160ng/mL、约0.1ng/mL至约150ng/mL、约0.1ng/mL至约140ng/mL、约0.1ng/mL至约130ng/mL、约0.1ng/mL至约120ng/mL、约0.1ng/mL至约110ng/mL、约0.1ng/mL至约100ng/mL、约0.1ng/mL至约90ng/mL、约0.1ng/mL至约80ng/mL、约0.1ng/mL至约70ng/mL、约0.1ng/mL至约60ng/mL、约0.1ng/mL至约50ng/mL、约0.1ng/mL至约40ng/mL、约0.1ng/mL至约30ng/mL、约0.1ng/mL至约20ng/mL、约0.1ng/mL至约10ng/mL、约0.1ng/mL至约5ng/mL、约0.1ng/mL至约2ng/mL、2ng/mL至约200ng/mL、约2ng/mL至约190ng/mL、约2ng/mL至约180ng/mL、约2ng/mL至约170ng/mL、约2ng/mL至约160ng/mL、约2ng/mL至约150ng/mL、约2ng/mL至约140ng/mL、约2ng/mL至约130ng/mL、约2ng/mL至约120ng/mL、约2ng/mL至约110ng/mL、约2ng/mL至约100ng/mL、约2ng/mL至约90ng/mL、约2ng/mL至约80ng/mL、约2ng/mL至约70ng/mL、约2ng/mL至约60ng/mL、约2ng/mL至约50ng/mL、约2ng/mL至约40ng/mL、约2ng/mL至约30ng/mL、约2ng/mL至约20ng/mL、约2ng/mL至约10ng/mL、约2ng/mL至约5ng/mL、约5ng/mL至约200ng/mL、约5ng/mL至约190ng/mL、约5ng/mL至约180ng/mL、约5ng/mL至约170ng/mL、约5ng/mL至约160ng/mL、约5ng/mL至约150ng/mL、约5ng/mL至约140ng/mL、约5ng/mL至约130ng/mL、约5ng/mL至约120ng/mL、约5ng/mL至约110ng/mL、约5ng/mL至约100ng/mL、约5ng/mL至约90ng/mL、约5ng/mL至约80ng/mL、约5ng/mL至约70ng/mL、约5ng/mL至约60ng/mL、约5ng/mL至约50ng/mL、约5ng/mL至约40ng/mL、约5ng/mL至约30ng/mL、约5ng/mL至约20ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约200ng/mL、约10ng/mL至约190ng/mL、约10ng/mL至约180ng/mL、约10ng/mL至约170ng/mL、约10ng/mL至约160ng/mL、约10ng/mL至约150ng/mL、约10ng/mL至约140ng/mL、约10ng/mL至约130ng/mL、约10ng/mL至约120ng/mL、约10ng/mL至约110ng/mL、约10ng/mL至约100ng/mL、约10ng/mL至约90ng/mL、约10ng/mL至约80ng/mL、约10ng/mL至约70ng/mL、约10ng/mL至约60ng/mL、约10ng/mL至约50ng/mL、约10ng/mL至约40ng/mL、约10ng/mL至约30ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约20ng/mL至约200ng/mL、约20ng/mL至约190ng/mL、约20ng/mL至约180ng/mL、约20ng/mL至约170ng/mL、约20ng/mL至约160ng/mL、约20ng/mL至约150ng/mL、约20ng/mL至约140ng/mL、约20ng/mL至约130ng/mL、约20ng/mL至约120ng/mL、约20ng/mL至约110ng/mL、约20ng/mL至约100ng/mL、约20ng/mL至约90ng/mL、约20ng/mL至约80ng/mL、约20ng/mL至约70ng/mL、约20ng/mL至约60ng/mL、约20ng/mL至约50ng/mL、约20ng/mL至约40ng/mL、约20ng/mL至约30ng/mL、约30ng/mL至约200ng/mL、约30ng/mL至约190ng/mL、约30ng/mL至约180ng/mL、约30ng/mL至约170ng/mL、约30ng/mL至约160ng/mL、约30ng/mL至约150ng/mL、约30ng/mL至约140ng/mL、约30ng/mL至约130ng/mL、约30ng/mL至约120ng/mL、约30ng/mL至约110ng/mL、约30ng/mL至约100ng/mL、约30ng/mL至约90ng/mL、约30ng/mL至约80ng/mL、约30ng/mL至约70ng/mL、约30ng/mL至约60ng/mL、约30ng/mL至约50ng/mL、约30ng/mL至约40ng/mL、约40ng/mL至约200ng/mL、约40ng/mL至约190ng/mL、约40ng/mL至约180ng/mL、约40ng/mL至约170ng/mL、约40ng/mL至约160ng/mL、约40ng/mL至约150ng/mL、约40ng/mL至约140ng/mL、约40ng/mL至约130ng/mL、约40ng/mL至约120ng/mL、约40ng/mL至约110ng/mL、约40ng/mL至约100ng/mL、约40ng/mL至约90ng/mL、约40ng/mL至约80ng/mL、约40ng/mL至约70ng/mL、约40ng/mL至约60ng/mL、约40ng/mL至约50ng/mL、约50ng/mL至约200ng/mL、约50ng/mL至约190ng/mL、约50ng/mL至约180ng/mL、约50ng/mL至约170ng/mL、约50ng/mL至约160ng/mL、约50ng/mL至约150ng/mL、约50ng/mL至约140ng/mL、约50ng/mL至约130ng/mL、约50ng/mL至约120ng/mL、约50ng/mL至约110ng/mL、约50ng/mL至约100ng/mL、约50ng/mL至约90ng/mL、约50ng/mL至约80ng/mL、约50ng/mL至约70ng/mL、约50ng/mL至约60ng/mL、约60ng/mL至约200ng/mL、约60ng/mL至约190ng/mL、约60ng/mL至约180ng/mL、约60ng/mL至约170ng/mL、约60ng/mL至约160ng/mL、约60ng/mL至约150ng/mL、约60ng/mL至约140ng/mL、约60ng/mL至约130ng/mL、约60ng/mL至约120ng/mL、约60ng/mL至约110ng/mL、约60ng/mL至约100ng/mL、约60ng/mL至约90ng/mL、约60ng/mL至约80ng/mL、约60ng/mL至约70ng/mL、约70ng/mL至约200ng/mL、约70ng/mL至约190ng/mL、约70ng/mL至约180ng/mL、约70ng/mL至约170ng/mL、约70ng/mL至约160ng/mL、约70ng/mL至约150ng/mL、约70ng/mL至约140ng/mL、约70ng/mL至约130ng/mL、约70ng/mL至约120ng/mL、约70ng/mL至约110ng/mL、约70ng/mL至约100ng/mL、约70ng/mL至约90ng/mL、约70ng/mL至约80ng/mL、约80ng/mL至约200ng/mL、约80ng/mL至约190ng/mL、约80ng/mL至约180ng/mL、约80ng/mL至约170ng/mL、约80ng/mL至约160ng/mL、约80ng/mL至约150ng/mL、约80ng/mL至约140ng/mL、约80ng/mL至约130ng/mL、约80ng/mL至约120ng/mL、约80ng/mL至约110ng/mL、约80ng/mL至约100ng/mL、约80ng/mL至约90ng/mL、约90ng/mL至约200ng/mL、约90ng/mL至约190ng/mL、约90ng/mL至约180ng/mL、约90ng/mL至约170ng/mL、约90ng/mL至约160ng/mL、约90ng/mL至约150ng/mL、约90ng/mL至约140ng/mL、约90ng/mL至约130ng/mL、约90ng/mL至约120ng/mL、约90ng/mL至约110ng/mL、约90ng/mL至约100ng/mL、约100ng/mL至约200ng/mL、约100ng/mL至约190ng/mL、约100ng/mL至约180ng/mL、约100ng/mL至约170ng/mL、约100ng/mL至约160ng/mL、约100ng/mL至约150ng/mL、约100ng/mL至约140ng/mL、约100ng/mL至约130ng/mL、约100ng/mL至约120ng/mL、约100ng/mL至约110ng/mL、约110ng/mL至约200ng/mL、约110ng/mL至约190ng/mL、约110ng/mL至约180ng/mL、约110ng/mL至约170ng/mL、约110ng/mL至约160ng/mL、约110ng/mL至约150ng/mL、约110ng/mL至约140ng/mL、约110ng/mL至约130ng/mL、约110ng/mL至约120ng/mL、约120ng/mL至约200ng/mL、约120ng/mL至约190ng/mL、约120ng/mL至约180ng/mL、约120ng/mL至约170ng/mL、约120ng/mL至约160ng/mL、约120ng/mL至约150ng/mL、约120ng/mL至约140ng/mL、约120ng/mL至约130ng/mL、约130ng/mL至约200ng/mL、约130ng/mL至约190ng/mL、约130ng/mL至约180ng/mL、约130ng/mL至约170ng/mL、约130ng/mL至约160ng/mL、约130ng/mL至约150ng/mL、约130ng/mL至约140ng/mL、约140ng/mL至约200ng/mL、约140ng/mL至约190ng/mL、约140ng/mL至约180ng/mL、约140ng/mL至约170ng/mL、约140ng/mL至约160ng/mL、约140ng/mL至约150ng/mL、约150ng/mL至约200ng/mL、约150ng/mL至约190ng/mL、约150ng/mL至约180ng/mL、约150ng/mL至约170ng/mL、约150ng/mL至约160ng/mL、约160ng/mL至约200ng/mL、约160ng/mL至约190ng/mL、约160ng/mL至约180ng/mL、约160ng/mL至约170ng/mL、约170ng/mL至约200ng/mL、约170ng/mL至约190ng/mL、约170ng/mL至约180ng/mL、约180ng/mL至约200ng/mL、约180ng/mL至约190ng/mL、或约190ng/mL至约200ng/mL的IL-3(例如，重组人IL-3)。

在一些实施方案中，第一培养基包含约0.1ng/mL至约200ng/mL、约0.1ng/mL至约190ng/mL、约0.1ng/mL至约180ng/mL、约0.1ng/mL至约170ng/mL、约0.1ng/mL至约160ng/mL、约0.1ng/mL至约150ng/mL、约0.1ng/mL至约140ng/mL、约0.1ng/mL至约130ng/mL、约0.1ng/mL至约120ng/mL、约0.1ng/mL至约110ng/mL、约0.1ng/mL至约100ng/mL、约0.1ng/mL至约90ng/mL、约0.1ng/mL至约80ng/mL、约0.1ng/mL至约70ng/mL、约0.1ng/mL至约60ng/mL、约0.1ng/mL至约50ng/mL、约0.1ng/mL至约40ng/mL、约0.1ng/mL至约30ng/mL、约0.1ng/mL至约20ng/mL、约0.1ng/mL至约10ng/mL、约0.1ng/mL至约5ng/mL、约0.1ng/mL至约2ng/mL、2ng/mL至约200ng/mL、约2ng/mL至约190ng/mL、约2ng/mL至约180ng/mL、约2ng/mL至约170ng/mL、约2ng/mL至约160ng/mL、约2ng/mL至约150ng/mL、约2ng/mL至约140ng/mL、约2ng/mL至约130ng/mL、约2ng/mL至约120ng/mL、约2ng/mL至约110ng/mL、约2ng/mL至约100ng/mL、约2ng/mL至约90ng/mL、约2ng/mL至约80ng/mL、约2ng/mL至约70ng/mL、约2ng/mL至约60ng/mL、约2ng/mL至约50ng/mL、约2ng/mL至约40ng/mL、约2ng/mL至约30ng/mL、约2ng/mL至约20ng/mL、约2ng/mL至约10ng/mL、约2ng/mL至约5ng/mL、约5ng/mL至约200ng/mL、约5ng/mL至约190ng/mL、约5ng/mL至约180ng/mL、约5ng/mL至约170ng/mL、约5ng/mL至约160ng/mL、约5ng/mL至约150ng/mL、约5ng/mL至约140ng/mL、约5ng/mL至约130ng/mL、约5ng/mL至约120ng/mL、约5ng/mL至约110ng/mL、约5ng/mL至约100ng/mL、约5ng/mL至约90ng/mL、约5ng/mL至约80ng/mL、约5ng/mL至约70ng/mL、约5ng/mL至约60ng/mL、约5ng/mL至约50ng/mL、约5ng/mL至约40ng/mL、约5ng/mL至约30ng/mL、约5ng/mL至约20ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约200ng/mL、约10ng/mL至约190ng/mL、约10ng/mL至约180ng/mL、约10ng/mL至约170ng/mL、约10ng/mL至约160ng/mL、约10ng/mL至约150ng/mL、约10ng/mL至约140ng/mL、约10ng/mL至约130ng/mL、约10ng/mL至约120ng/mL、约10ng/mL至约110ng/mL、约10ng/mL至约100ng/mL、约10ng/mL至约90ng/mL、约10ng/mL至约80ng/mL、约10ng/mL至约70ng/mL、约10ng/mL至约60ng/mL、约10ng/mL至约50ng/mL、约10ng/mL至约40ng/mL、约10ng/mL至约30ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约20ng/mL至约200ng/mL、约20ng/mL至约190ng/mL、约20ng/mL至约180ng/mL、约20ng/mL至约170ng/mL、约20ng/mL至约160ng/mL、约20ng/mL至约150ng/mL、约20ng/mL至约140ng/mL、约20ng/mL至约130ng/mL、约20ng/mL至约120ng/mL、约20ng/mL至约110ng/mL、约20ng/mL至约100ng/mL、约20ng/mL至约90ng/mL、约20ng/mL至约80ng/mL、约20ng/mL至约70ng/mL、约20ng/mL至约60ng/mL、约20ng/mL至约50ng/mL、约20ng/mL至约40ng/mL、约20ng/mL至约30ng/mL、约30ng/mL至约200ng/mL、约30ng/mL至约190ng/mL、约30ng/mL至约180ng/mL、约30ng/mL至约170ng/mL、约30ng/mL至约160ng/mL、约30ng/mL至约150ng/mL、约30ng/mL至约140ng/mL、约30ng/mL至约130ng/mL、约30ng/mL至约120ng/mL、约30ng/mL至约110ng/mL、约30ng/mL至约100ng/mL、约30ng/mL至约90ng/mL、约30ng/mL至约80ng/mL、约30ng/mL至约70ng/mL、约30ng/mL至约60ng/mL、约30ng/mL至约50ng/mL、约30ng/mL至约40ng/mL、约40ng/mL至约200ng/mL、约40ng/mL至约190ng/mL、约40ng/mL至约180ng/mL、约40ng/mL至约170ng/mL、约40ng/mL至约160ng/mL、约40ng/mL至约150ng/mL、约40ng/mL至约140ng/mL、约40ng/mL至约130ng/mL、约40ng/mL至约120ng/mL、约40ng/mL至约110ng/mL、约40ng/mL至约100ng/mL、约40ng/mL至约90ng/mL、约40ng/mL至约80ng/mL、约40ng/mL至约70ng/mL、约40ng/mL至约60ng/mL、约40ng/mL至约50ng/mL、约50ng/mL至约200ng/mL、约50ng/mL至约190ng/mL、约50ng/mL至约180ng/mL、约50ng/mL至约170ng/mL、约50ng/mL至约160ng/mL、约50ng/mL至约150ng/mL、约50ng/mL至约140ng/mL、约50ng/mL至约130ng/mL、约50ng/mL至约120ng/mL、约50ng/mL至约110ng/mL、约50ng/mL至约100ng/mL、约50ng/mL至约90ng/mL、约50ng/mL至约80ng/mL、约50ng/mL至约70ng/mL、约50ng/mL至约60ng/mL、约60ng/mL至约200ng/mL、约60ng/mL至约190ng/mL、约60ng/mL至约180ng/mL、约60ng/mL至约170ng/mL、约60ng/mL至约160ng/mL、约60ng/mL至约150ng/mL、约60ng/mL至约140ng/mL、约60ng/mL至约130ng/mL、约60ng/mL至约120ng/mL、约60ng/mL至约110ng/mL、约60ng/mL至约100ng/mL、约60ng/mL至约90ng/mL、约60ng/mL至约80ng/mL、约60ng/mL至约70ng/mL、约70ng/mL至约200ng/mL、约70ng/mL至约190ng/mL、约70ng/mL至约180ng/mL、约70ng/mL至约170ng/mL、约70ng/mL至约160ng/mL、约70ng/mL至约150ng/mL、约70ng/mL至约140ng/mL、约70ng/mL至约130ng/mL、约70ng/mL至约120ng/mL、约70ng/mL至约110ng/mL、约70ng/mL至约100ng/mL、约70ng/mL至约90ng/mL、约70ng/mL至约80ng/mL、约80ng/mL至约200ng/mL、约80ng/mL至约190ng/mL、约80ng/mL至约180ng/mL、约80ng/mL至约170ng/mL、约80ng/mL至约160ng/mL、约80ng/mL至约150ng/mL、约80ng/mL至约140ng/mL、约80ng/mL至约130ng/mL、约80ng/mL至约120ng/mL、约80ng/mL至约110ng/mL、约80ng/mL至约100ng/mL、约80ng/mL至约90ng/mL、约90ng/mL至约200ng/mL、约90ng/mL至约190ng/mL、约90ng/mL至约180ng/mL、约90ng/mL至约170ng/mL、约90ng/mL至约160ng/mL、约90ng/mL至约150ng/mL、约90ng/mL至约140ng/mL、约90ng/mL至约130ng/mL、约90ng/mL至约120ng/mL、约90ng/mL至约110ng/mL、约90ng/mL至约100ng/mL、约100ng/mL至约200ng/mL、约100ng/mL至约190ng/mL、约100ng/mL至约180ng/mL、约100ng/mL至约170ng/mL、约100ng/mL至约160ng/mL、约100ng/mL至约150ng/mL、约100ng/mL至约140ng/mL、约100ng/mL至约130ng/mL、约100ng/mL至约120ng/mL、约100ng/mL至约110ng/mL、约110ng/mL至约200ng/mL、约110ng/mL至约190ng/mL、约110ng/mL至约180ng/mL、约110ng/mL至约170ng/mL、约110ng/mL至约160ng/mL、约110ng/mL至约150ng/mL、约110ng/mL至约140ng/mL、约110ng/mL至约130ng/mL、约110ng/mL至约120ng/mL、约120ng/mL至约200ng/mL、约120ng/mL至约190ng/mL、约120ng/mL至约180ng/mL、约120ng/mL至约170ng/mL、约120ng/mL至约160ng/mL、约120ng/mL至约150ng/mL、约120ng/mL至约140ng/mL、约120ng/mL至约130ng/mL、约130ng/mL至约200ng/mL、约130ng/mL至约190ng/mL、约130ng/mL至约180ng/mL、约130ng/mL至约170ng/mL、约130ng/mL至约160ng/mL、约130ng/mL至约150ng/mL、约130ng/mL至约140ng/mL、约140ng/mL至约200ng/mL、约140ng/mL至约190ng/mL、约140ng/mL至约180ng/mL、约140ng/mL至约170ng/mL、约140ng/mL至约160ng/mL、约140ng/mL至约150ng/mL、约150ng/mL至约200ng/mL、约150ng/mL至约190ng/mL、约150ng/mL至约180ng/mL、约150ng/mL至约170ng/mL、约150ng/mL至约160ng/mL、约160ng/mL至约200ng/mL、约160ng/mL至约190ng/mL、约160ng/mL至约180ng/mL、约160ng/mL至约170ng/mL、约170ng/mL至约200ng/mL、约170ng/mL至约190ng/mL、约170ng/mL至约180ng/mL、约180ng/mL至约200ng/mL、约180ng/mL至约190ng/mL、或约190ng/mL至约200ng/mL的IL-6(例如，重组人IL-6)。

在一些实施方案中，第一培养基可以是例如化学成分确定的液体培养基、无动物组分的液体培养基、或化学成分确定的无动物组分的液体培养基、和/或无血清液体培养基。

培养步骤B

灌注培养

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(b)包括将第二细胞培养物(例如，在具有本文所述的任何示例性体积的任何示例性生物反应器中的任何第二细胞培养物)灌注培养约2天至约15天(例如，约2天至约14天、约2天至约13天、约2天至约12天、约2天至约11天、约2天至约10天、约2天至约9天、约2天至约8天、约2天至约7天、约2天至约6天、约2天至约5天、约2天至约4天、约2天至约3天、约3天至约15天、约3天至约14天、约3天至约13天、约3天至约12天、约3天至约11天、约3天至约10天、约3天至约9天、约3天至约8天、约3天至约7天、约3天至约6天、约3天至约5天、约3天至约4天、约4天至约15天、约4天至约14天、约4天至约13天、约4天至约12天、约4天至约11天、约4天至约10天、约4天至约9天、约4天至约8天、约4天至约7天、约4天至约6天、约4天至约5天、约5天至约15天、约5天至约14天、约5天至约13天、约5天至约12天、约5天至约11天、约5天至约10天、约5天至约9天、约5天至约8天、约5天至约7天、约5天至约6天、约6天至约15天、约6天至约14天、约6天至约13天、约6天至约12天、约6天至约11天、约6天至约10天、约6天至约9天、约6天至约8天、约6天至约7天、约7天至约15天、约7天至约14天、约7天至约13天、约7天至约12天、约7天至约11天、约7天至约10天、约7天至约9天、约7天至约8天、约8天至约15天、约8天至约14天、约8天至约13天、约8天至约12天、约8天至约11天、约8天至约10天、约8天至约9天、约9天至约15天、约9天至约14天、约9天至约13天、约9天至约12天、约9天至约11天、约9天至约10天、约10天至约15天、约10天至约14天、约10天至约13天、约10天至约12天、约10天至约11天、约11天至约15天、约11天至约14天、约11天至约13天、约11天至约12天、约12天至约15天、约12天至约14天、约12天至约13天、约13天至约15天、约13天至约14天、或约14天至约15天)。在一些实施方案中，步骤(b)包括以约10W/m

在一些实施方案中，步骤(b)中的灌注培养可以使用约0.04nL/细胞/天至约60nL/细胞/天(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)的灌注速率进行。在一些实施方案中，灌注速率随时间推移增加。

在一些实施方案中，步骤(b)中的灌注培养可以使用约0.1血管体积/天(VVD)至约3VVD(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)的灌注速率进行。

在一些实施方案中，步骤(b)中的灌注培养包括，至少部分地，随时间推移向第二细胞培养物中添加额外体积的培养基(例如，第二培养基(例如，本文所述的任何示例性第二培养基))。在一些实施方案中，随时间推移向第二细胞培养物中连续地添加额外体积的培养基(例如，第二培养基(例如，本文所述的任何示例性第二培养基))。在一些实施方案中，随时间推移向第二细胞培养物中周期性地添加额外体积的培养基(例如，第二培养基(例如，本文所述的任何示例性第二培养基))(例如，每三天一次、每两天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每天五次、每天六次、每天七次、每天八次、每天九次、每天十次、每天十一次或每天十二次)。培养基(例如，本文所述的任何示例性第二培养基)的添加可以机械地进行，例如使用蠕动泵或灌注泵，或手动地(例如，通过无菌移液)进行。

在一些实施方案中，步骤(b)中的灌注培养包括，至少部分地，随时间推移去除一定体积的培养基(例如，基本上不含细胞的培养基)。在一些实施方案中，随时间推移连续地去除培养基(例如，基本上不含细胞的培养基)。在一些实施方案中，培养基随时间推移周期性地(例如，每三天一次、每两天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每天五次、每天六次、每天七次、每天八次、每天九次、每天十次、每天十一次或每天十二次)去除。培养基(例如，基本上不含细胞的培养基)的去除可以机械地进行，例如，使用切向流过滤(TFF)或交替流过滤(ATF)，或手动地(例如，通过无菌移液)进行。本文描述了切向流过滤的另外的非限制性方面。

在这些方法的一些实施方案中，第二培养基包含下列中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种或六种)：运铁蛋白(例如，脱铁运铁蛋白、全铁运铁蛋白或它们的组合)(例如，约1μg/mL至约500μg/mL运铁蛋白(例如，人脱铁运铁蛋白、人全铁运铁蛋白或它们的组合)或本文所述的该范围的任何子范围)、IL-3(例如，约0.1ng/mL至约200ng/mLIL-3(例如，重组人IL-3)或本文所述的该范围的任何子范围)、SCF(例如，约1ng/mL至约1μg/mLSCF(例如，重组人SCF)或本文所述的该范围的任何子范围)、地塞米松(例如，约0.1nM至约200nM地塞米松或本文所述的该范围的任何子范围)、EPO(促红细胞生成素)或EPO-模拟肽(例如，约1ng/mL至约500ng/mLEPO)(例如，重组人EPO)或本文所述的该范围的任何子范围的EPO-模拟肽)和EPO(例如，约0.1μg/mL至约50μg胰岛素)或本文所述的该范围的任何子范围。在这些方法的一些实例中，第二培养基包含脂质(例如，约1μg/mL至约10μg/mL脂质混合物或本文所述的该范围的任何子范围)。在这些方法的一些实例中，第二培养基包含约0.1mM至约10mM(或本文所述此范围的任何子范围)的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。

在一些实施方案中，灌注培养包括使用切向过滤(例如切向流过滤(TFF)或交替切向过滤(ATF))。在一些实施方案中，切向过滤(例如切向流过滤或交替切向过滤)包括使用平均孔径为约10nm至约6.0μm(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)的一个或多个过滤器。

在一些实施方案中，一旦第一细胞培养物达到特定靶细胞密度，例如1.0x10

分批或补料分批培养

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(b)包括分批或补料分批培养第二细胞培养物(例如，在具有本文所述的任何示例性体积的本文所述的任何示例性摇瓶、摇管、培养袋或生物反应器中的任何第二细胞培养物)约2天至约15天(例如，约2天至约14天、约2天至约13天、约2天至约12天、约2天至约11天、约2天至约10天、约2天至约9天、约2天至约8天、约2天至约7天、约2天至约6天、约2天至约5天、约2天至约4天、约2天至约3天、约3天至约15天、约3天至约14天、约3天至约13天、约3天至约12天、约3天至约11天、约3天至约10天、约3天至约9天、约3天至约8天、约3天至约7天、约3天至约6天、约3天至约5天、约3天至约4天、约4天至约15天、约4天至约14天、约4天至约13天、约4天至约12天、约4天至约11天、约4天至约10天、约4天至约9天、约4天至约8天、约4天至约7天、约4天至约6天、约4天至约5天、约5天至约15天、约5天至约14天、约5天至约13天、约5天至约12天、约5天至约11天、约5天至约10天、约5天至约9天、约5天至约8天、约5天至约7天、约5天至约6天、约6天至约15天、约6天至约14天、约6天至约13天、约6天至约12天、约6天至约11天、约6天至约10天、约6天至约9天、约6天至约8天、约6天至约7天、约7天至约15天、约7天至约14天、约7天至约13天、约7天至约12天、约7天至约11天、约7天至约10天、约7天至约9天、约7天至约8天、约8天至约15天、约8天至约14天、约8天至约13天、约8天至约12天、约8天至约11天、约8天至约10天、约8天至约9天、约9天至约15天、约9天至约14天、约9天至约13天、约9天至约12天、约9天至约11天、约9天至约10天、约10天至约15天、约10天至约14天、约10天至约13天、约10天至约12天、约10天至约11天、约11天至约15天、约11天至约14天、约11天至约13天、约11天至约12天、约12天至约15天、约12天至约14天、约12天至约13天、约13天至约15天、约13天至约14天、或约14天至约15天)。

在一些实施方案中，步骤(b)包括对布置在生物反应器(例如，具有本文所述的任何示例性体积的本文所述的任何示例性生物反应器)中的第二细胞培养物进行分批或补料分批培养。在此类实施方案中，步骤(b)包括在生物反应器中与以约10W/m

在一些实施方案中，步骤(b)包括对放置在摇瓶(例如，具有本文所述的任何示例性体积的本文所述的任何示例性摇瓶)中的第二细胞培养物进行分批或补料分批培养。在此类实施方案中，步骤(b)包括在摇瓶中以约0.1xg至约50xg(或本文所述的该范围的任何子范围)温育第二细胞培养物。

在一些实施方案中，步骤(b)包括对放置在摇管(例如，本文所述的具有本文所述的任何示例性体积的任何示例性摇管(例如，圆锥形容器))中的第二细胞培养物进行分批或补料分批培养。在此类实施方案中，步骤(b)包括在摇管中以约0.1xg至约50xg(或本文所述的该范围的任何子范围)温育第二细胞培养物。

在一些实施方案中，步骤(b)包括对放置在培养袋(例如，本文所述的具有本文所述的任何示例性体积的任何示例性培养袋)中的第二细胞培养物进行分批或补料分批培养。在此类实施方案中，步骤(b)包括在培养袋中以以10个摇动循环/分钟至约50个摇动循环/分钟(或本文所述的该范围的任何子范围)的摇动速率温育第二细胞培养物。

在一些实施方案中，步骤(b)包括对第二细胞培养物进行分批培养。

在一些实施方案中，步骤(b)包括对第二细胞培养物进行补料分批培养。在一些实施方案中，步骤(b)中的补料分批培养包括随时间推移添加额外体积的第二培养基(例如，本文所述的任何示例性第二培养基)。在一些实施方案中，随时间推移向第二细胞培养物中连续地添加额外体积的培养基(例如，第二培养基(例如，本文所述的任何示例性第二培养基))。在一些实施方案中，随时间推移向第二细胞培养物中周期性地添加额外体积的培养基(例如，第二培养基(例如，本文所述的任何示例性第二培养基))(例如，每三天一次、每两天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每天五次、每天六次、每天七次、每天八次、每天九次、每天十次、每天十一次或每天十二次)。在一些实施方案中，将约0.1x至约10x(例如，约0.1x至约9.5x、约0.1x至约9.0x、约0.1x至约8.5x、约0.1x至约8.0x、约0.1x至约7.5x、约0.1x至约7.0x、约0.1x至约6.5x、约0.1x至约6.0x、约0.1x至约5.5x、约0.1x至约5.0x、约0.1x至约4.5x、约0.1x至约4.0x、约0.1x至约3.5x、约0.1x至约3.0x、约0.1x至约2.5x、约0.1x至约2.0x、约0.1x至约1.5x、约0.1x至约1.0x、约0.1x至约0.5x、约0.1x至约0.3x、约0.1x至约0.2x、约0.2x至约10x、约0.2x至约9.5x、约0.2x至约9.0x、约0.2x至约8.5x、约0.2x至约8.0x、约0.2x至约7.5x、约0.2x至约7.0x、约0.2x至约6.5x、约0.2x至约6.0x、约0.2x至约5.5x、约0.2x至约5.0x、约0.2x至约4.5x、约0.2x至约4.0x、约0.2x至约3.5x、约0.2x至约3.0x、约0.2x至约2.5x、约0.2x至约2.0x、约0.2x至约1.5x、约0.2x至约1.0x、约0.2x至约0.5x、约0.2x至约0.3x、约0.3x至约10x、约0.3x至约9.5x、约0.3x至约9.0x、约0.3x至约8.5x、约0.3x至约8.0x、约0.3x至约7.5x、约0.3x至约7.0x、约0.3x至约6.5x、约0.3x至约6.0x、约0.3x至约5.5x、约0.3x至约5.0x、约0.3x至约4.5x、约0.3x至约4.0x、约0.3x至约3.5x、约0.3x至约3.0x、约0.3x至约2.5x、约0.3x至约2.0x、约0.3x至约1.5x、约0.3x至约1.0x、约0.3x至约0.5x、约0.5x至约10x、约0.5x至约9.5x、约0.5x至约9.0x、约0.5x至约8.5x、约0.5x至约8.0x、约0.5x至约7.5x、约0.5x至约7.0x、约0.5x至约6.5x、约0.5x至约6.0x、约0.5x至约5.5x、约0.5x至约5.0x、约0.5x至约4.5x、约0.5x至约4.0x、约0.5x至约3.5x、约0.5x至约3.0x、约0.5x至约2.5x、约0.5x至约2.0x、约0.5x至约1.5x、约0.5x至约1.0x、约1.0x至约10x、约1.0x至约9.5x、约1.0x至约9.0x、约1.0x至约8.5x、约1.0x至约8.0x、约1.0x至约7.5x、约1.0x至约7.0x、约1.0x至约6.5x、约1.0x至约6.0x、约1.0x至约5.5x、约1.0x至约5.0x、约1.0x至约4.5x、约1.0x至约4.0x、约1.0x至约3.5x、约1.0x至约3.0x、约1.0x至约2.5x、约1.0x至约2.0x、约1.0x至约1.5x、约1.5x至约10x、约1.5x至约9.5x、约1.5x至约9.0x、约1.5x至约8.5x、约1.5x至约8.0x、约1.5x至约7.5x、约1.5x至约7.0x、约1.5x至约6.5x、约1.5x至约6.0x、约1.5x至约5.5x、约1.5x至约5.0x、约1.5x至约4.5x、约1.5x至约4.0x、约1.5x至约3.5x、约1.5x至约3.0x、约1.5x至约2.5x、约1.5x至约2.0x、约2.0x至约10x、约2.0x至约9.5x、约2.0x至约9.0x、约2.0x至约8.5x、约2.0x至约8.0x、约2.0x至约7.5x、约2.0x至约7.0x、约2.0x至约6.5x、约2.0x至约6.0x、约2.0x至约5.5x、约2.0x至约5.0x、约2.0x至约4.5x、约2.0x至约4.0x、约2.0x至约3.5x、约2.0x至约3.0x、约2.0x至约2.5x、约2.5x至约10x、约2.5x至约9.5x、约2.5x至约9.0x、约2.5x至约8.5x、约2.5x至约8.0x、约2.5x至约7.5x、约2.5x至约7.0x、约2.5x至约6.5x、约2.5x至约6.0x、约2.5x至约5.5x、约2.5x至约5.0x、约2.5x至约4.5x、约2.5x至约4.0x、约2.5x至约3.5x、约2.5x至约3.0x、约3.0x至约10x、约3.0x至约9.5x、约3.0x至约9.0x、约3.0x至约8.5x、约3.0x至约8.0x、约3.0x至约7.5x、约3.0x至约7.0x、约3.0x至约6.5x、约3.0x至约6.0x、约3.0x至约5.5x、约3.0x至约5.0x、约3.0x至约4.5x、约3.0x至约4.0x、约3.0x至约3.5x、约3.5x至约10x、约3.5x至约9.5x、约3.5x至约9.0x、约3.5x至约8.5x、约3.5x至约8.0x、约3.5x至约7.5x、约3.5x至约7.0x、约3.5x至约6.5x、约3.5x至约6.0x、约3.5x至约5.5x、约3.5x至约5.0x、约3.5x至约4.5x、约3.5x至约4.0x、约4.0x至约10x、约4.0x至约9.5x、约4.0x至约9.0x、约4.0x至约8.5x、约4.0x至约8.0x、约4.0x至约7.5x、约4.0x至约7.0x、约4.0x至约6.5x、约4.0x至约6.0x、约4.0x至约5.5x、约4.0x至约5.0x、约4.0x至约4.5x、约4.5x至约10x、约4.5x至约9.5x、约4.5x至约9.0x、约4.5x至约8.5x、约4.5x至约8.0x、约4.5x至约7.5x、约4.5x至约7.0x、约4.5x至约6.5x、约4.5x至约6.0x、约4.5x至约5.5x、约4.5x至约5.0x、约5.0x至约10x、约5.0x至约9.5x、约5.0x至约9.0x、约5.0x至约8.5x、约5.0x至约8.0x、约5.0x至约7.5x、约5.0x至约7.0x、约5.0x至约6.5x、约5.0x至约6.0x、约5.0x至约5.5x、约5.5x至约10x、约5.5x至约9.5x、约5.5x至约9.0x、约5.5x至约8.5x、约5.5x至约8.0x、约5.5x至约7.5x、约5.5x至约7.0x、约5.5x至约6.5x、约5.5x至约6.0x、约6.0x至约10x、约6.0x至约9.5x、约6.0x至约9.0x、约6.0x至约8.5x、约6.0x至约8.0x、约6.0x至约7.5x、约6.0x至约7.0x、约6.0x至约6.5x、约6.5x至约10x、约6.5x至约9.5x、约6.5x至约9.0x、约6.5x至约8.5x、约6.5x至约8.0x、约6.5x至约7.5x、约6.5x至约7.0x、约7.0x至约10x、约7.0x至约9.5x、约7.0x至约9.0x、约7.0x至约8.5x、约7.0x至约8.0x、约7.0x至约7.5x、约7.5x至约10x、约7.5x至约9.5x、约7.5x至约9.0x、约7.5x至约8.5x、约7.5x至约8.0x、约8.0x至约10x、约8.0x至约9.5x、约8.0x至约9.0x、约8.0x至约8.5x、约8.5x至约10x、约8.5x至约9.5x、约8.5x至约9.0x、约9.0x至约10x、约9.0x至约9.5x、或约9.5x至约10x)体积的第二细胞培养物在步骤(a)后立即以每24小时的增量添加。在一些实施方案中，一旦第一细胞培养物达到特定靶细胞密度，例如约1.0x10

培养基(例如，本文所述的任何示例性第二培养基)的添加可以机械地进行，例如使用蠕动泵，或手动地(例如，通过无菌移液)进行。

在这些方法的一些实施方案中，第二培养基包含下列中的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种或六种)：运铁蛋白(例如，脱铁运铁蛋白、全铁运铁蛋白或它们的组合)(例如，约1μg/mL至约500μg/mL运铁蛋白(例如，人脱铁运铁蛋白、人全铁运铁蛋白或它们的组合)或本文所述的该范围的任何子范围)、IL-3(例如，约0.1ng/mL至约200ng/mLIL-3(例如，重组人IL-3)或本文所述的该范围的任何子范围)、SCF(例如，约1ng/mL至约1μg/mLSCF(例如，重组人SCF)或本文所述的该范围的任何子范围)、地塞米松(例如，约0.1nM至约200nM地塞米松或本文所述的该范围的任何子范围)、EPO(促红细胞生成素)或EPO-模拟肽(例如，约1ng/mL至约500ng/mL的EPO)(例如，重组人EPO)或本文所述范围的子范围的EPO-模拟肽(例如，EPO)或本文所述范围的子范围的任何一个子范围的EPO-模拟肽)、地塞米松(例如，约0.1μg/mL至约50μg/mL或本文所述子范围的任何一个EPO-模拟肽)。在这些方法的一些实例中，第二培养基包含脂质(例如，脂质混合物)。在这些方法的一些实例中，第二培养基包含约0.1mM至约10mM(或本文所述此范围的任何子范围)的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。

提供第三细胞培养物(步骤C)

本文所述的方法包括以下步骤(步骤(c))：将步骤(b)的一定体积的第二细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第二细胞培养物)放置到包含在器皿(例如，生物反应器(例如，灌注生物反应器)，摇管，摇瓶或培养袋)内的第三培养基(例如，本文所述的任何示例性第三培养基)中以提供第三细胞培养物(例如，具有的初始细胞密度为约0.5x10

在一些实施方案中，步骤(c)包括将一定体积的步骤(b)的第二细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第二细胞培养物)放置到包含在生物反应器(例如，具有本文所述的任何示例性体积的任何生物反应器(例如，灌注生物反应器))内的第三培养基中，以提供具有约0.5x10

在一些实施方案中，步骤(c)包括将一定体积的步骤(b)的第二细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第二细胞培养物)放置到包含在摇瓶(例如，具有本文所述的任何示例性体积的本文所述的任何示例性摇瓶)内的第三培养基中，以提供具有约0.5x10

在一些实施方案中，步骤(c)包括将一定体积的步骤(b)的第二细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第二细胞培养物)放置到摇管(例如，本文所述的具有本文所述的任何示例性体积的任何示例性摇管(例如，锥形容器))内包含的第三培养基中，以提供具有约0.5x10

在一些实施方案中，步骤(c)包括将一定体积的步骤(b)的第二细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第二细胞培养物)放置到包含在培养袋(例如，具有本文所述的任何示例性体积的本文所述的任何示例性培养袋)内的第三培养基中，以提供具有约0.5x10

在一些实施方案中，第三培养基包含约0.01g/L至约70g/L(例如，约0.01g/L至约65g/L、约0.01g/L至约60g/L、约0.01g/L至约55g/L、约0.01g/L至约50g/L、约0.01g/L至约45g/L、约0.01g/L至约40g/L、约0.01g/L至约35g/L、约0.01g/L至约30g/L、约0.01g/L至约25g/L、约0.01g/L至约20g/L、约0.01g/L至约18g/L、约0.01g/L至约16g/L、约0.01g/L至约14g/L、约0.01g/L至约12g/L、约0.01g/L至约10g/L、约0.01g/L至约9.5g/L、约0.01g/L至约9.0g/L、约0.01g/L至约8.5g/L、约0.01g/L至约8.0g/L、约0.01g/L至约7.5g/L、约0.01g/L至约7.0g/L、约0.01g/L至约6.5g/L、约0.01g/L至约6.0g/L、约0.01g/L至约5.5g/L、约0.01g/L至约5.0g/L、约0.01g/L至约4.5g/L、约0.01g/L至约4.0g/L、约0.01g/L至约3.5g/L、约0.01g/L至约3.0g/L、约0.01g/L至约2.5g/L、约0.01g/L至约2.0g/L、约0.01g/L至约1.5g/L、约0.01g/L至约1.0g/L、约0.01g/L至约0.5g/L、约0.01g/L至约0.1g/L、约0.01g/L至约0.05g/L、约0.05g/L至约70g/L、约0.05g/L至约65g/L、约0.05g/L至约60g/L、约0.05g/L至约55g/L、约0.05g/L至约50g/L、约0.05g/L至约45g/L、约0.05g/L至约40g/L、约0.05g/L至约35g/L、约0.05g/L至约30g/L、约0.05g/L至约25g/L、约0.05g/L至约20g/L、约0.05g/L至约18g/L、约0.05g/L至约16g/L、约0.05g/L至约14g/L、约0.05g/L至约12g/L、约0.05g/L至约10g/L、约0.05g/L至约9.5g/L、约0.05g/L至约9.0g/L、约0.05g/L至约8.5g/L、约0.05g/L至约8.0g/L、约0.05g/L至约7.5g/L、约0.05g/L至约7.0g/L、约0.05g/L至约6.5g/L、约0.05g/L至约6.0g/L、约0.05g/L至约5.5g/L、约0.05g/L至约5.0g/L、约0.05g/L至约4.5g/L、约0.05g/L至约4.0g/L、约0.05g/L至约3.5g/L、约0.05g/L至约3.0g/L、约0.05g/L至约2.5g/L、约0.05g/L至约2.0g/L、约0.05g/L至约1.5g/L、约0.05g/L至约1.0g/L、约0.05g/L至约0.5g/L、约0.05g/L至约0.1g/L、约0.1g/L至约70g/L、约0.1g/L至约65g/L、约0.1g/L至约60g/L、约0.1g/L至约55g/L、约0.1g/L至约50g/L、约0.1g/L至约45g/L、约0.1g/L至约40g/L、约0.1g/L至约35g/L、约0.1g/L至约30g/L、约0.1g/L至约25g/L、约0.1g/L至约20g/L、约0.1g/L至约18g/L、约0.1g/L至约16g/L、约0.1g/L至约14g/L、约0.1g/L至约12g/L、约0.1g/L至约10g/L、约0.1g/L至约9.5g/L、约0.1g/L至约9.0g/L、约0.1g/L至约8.5g/L、约0.1g/L至约8.0g/L、约0.1g/L至约7.5g/L、约0.1g/L至约7.0g/L、约0.1g/L至约6.5g/L、约0.1g/L至约6.0g/L、约0.1g/L至约5.5g/L、约0.1g/L至约5.0g/L、约0.1g/L至约4.5g/L、约0.1g/L至约4.0g/L、约0.1g/L至约3.5g/L、约0.1g/L至约3.0g/L、约0.1g/L至约2.5g/L、约0.1g/L至约2.0g/L、约0.1g/L至约1.5g/L、约0.1g/L至约1.0g/L、约0.1g/L至约0.5g/L、约0.5g/L至约70g/L、约0.5g/L至约65g/L、约0.5g/L至约60g/L、约0.5g/L至约55g/L、约0.5g/L至约50g/L、约0.5g/L至约45g/L、约0.5g/L至约40g/L、约0.5g/L至约35g/L、约0.5g/L至约30g/L、约0.5g/L至约25g/L、约0.5g/L至约20g/L、约0.5g/L至约18g/L、约0.5g/L至约16g/L、约0.5g/L至约14g/L、约0.5g/L至约12g/L、约0.5g/L至约10g/L、约0.5g/L至约9.5g/L、约0.5g/L至约9.0g/L、约0.5g/L至约8.5g/L、约0.5g/L至约8.0g/L、约0.5g/L至约7.5g/L、约0.5g/L至约7.0g/L、约0.5g/L至约6.5g/L、约0.5g/L至约6.0g/L、约0.5g/L至约5.5g/L、约0.5g/L至约5.0g/L、约0.5g/L至约4.5g/L、约0.5g/L至约4.0g/L、约0.5g/L至约3.5g/L、约0.5g/L至约3.0g/L、约0.5g/L至约2.5g/L、约0.5g/L至约2.0g/L、约0.5g/L至约1.5g/L、约0.5g/L至约1.0g/L、约1.0g/L至约70g/L、约1.0g/L至约65g/L、约1.0g/L至约60g/L、约1.0g/L至约55g/L、约1.0g/L至约50g/L、约1.0g/L至约45g/L、约1.0g/L至约40g/L、约1.0g/L至约35g/L、约1.0g/L至约30g/L、约1.0g/L至约25g/L、约1.0g/L至约20g/L、约1.0g/L至约18g/L、约1.0g/L至约16g/L、约1.0g/L至约14g/L、约1.0g/L至约12g/L、约1.0g/L至约10g/L、约1.0g/L至约9.5g/L、约1.0g/L至约9.0g/L、约1.0g/L至约8.5g/L、约1.0g/L至约8.0g/L、约1.0g/L至约7.5g/L、约1.0g/L至约7.0g/L、约1.0g/L至约6.5g/L、约1.0g/L至约6.0g/L、约1.0g/L至约5.5g/L、约1.0g/L至约5.0g/L、约1.0g/L至约4.5g/L、约1.0g/L至约4.0g/L、约1.0g/L至约3.5g/L、约1.0g/L至约3.0g/L、约1.0g/L至约2.5g/L、约1.0g/L至约2.0g/L、约1.0g/L至约1.5g/L、约1.5g/L至约70g/L、约1.5g/L至约65g/L、约1.5g/L至约60g/L、约1.5g/L至约55g/L、约1.5g/L至约50g/L、约1.5g/L至约45g/L、约1.5g/L至约40g/L、约1.5g/L至约35g/L、约1.5g/L至约30g/L、约1.5g/L至约25g/L、约1.5g/L至约20g/L、约1.5g/L至约18g/L、约1.5g/L至约16g/L、约1.5g/L至约14g/L、约1.5g/L至约12g/L、约1.5g/L至约10g/L、约1.5g/L至约9.5g/L、约1.5g/L至约9.0g/L、约1.5g/L至约8.5g/L、约1.5g/L至约8.0g/L、约1.5g/L至约7.5g/L、约1.5g/L至约7.0g/L、约1.5g/L至约6.5g/L、约1.5g/L至约6.0g/L、约1.5g/L至约5.5g/L、约1.5g/L至约5.0g/L、约1.5g/L至约4.5g/L、约1.5g/L至约4.0g/L、约1.5g/L至约3.5g/L、约1.5g/L至约3.0g/L、约1.5g/L至约2.5g/L、约1.5g/L至约2.0g/L、约2.0g/L至约70g/L、约2.0g/L至约65g/L、约2.0g/L至约60g/L、约2.0g/L至约55g/L、约2.0g/L至约50g/L、约2.0g/L至约45g/L、约2.0g/L至约40g/L、约2.0g/L至约35g/L、约2.0g/L至约30g/L、约2.0g/L至约25g/L、约2.0g/L至约20g/L、约2.0g/L至约18g/L、约2.0g/L至约16g/L、约2.0g/L至约14g/L、约2.0g/L至约12g/L、约2.0g/L至约10g/L、约2.0g/L至约9.5g/L、约2.0g/L至约9.0g/L、约2.0g/L至约8.5g/L、约2.0g/L至约8.0g/L、约2.0g/L至约7.5g/L、约2.0g/L至约7.0g/L、约2.0g/L至约6.5g/L、约2.0g/L至约6.0g/L、约2.0g/L至约5.5g/L、约2.0g/L至约5.0g/L、约2.0g/L至约4.5g/L、约2.0g/L至约4.0g/L、约2.0g/L至约3.5g/L、约2.0g/L至约3.0g/L、约2.0g/L至约2.5g/L、约2.5g/L至约70g/L、约2.5g/L至约65g/L、约2.5g/L至约60g/L、约2.5g/L至约55g/L、约2.5g/L至约50g/L、约2.5g/L至约45g/L、约2.5g/L至约40g/L、约2.5g/L至约35g/L、约2.5g/L至约30g/L、约2.5g/L至约25g/L、约2.5g/L至约20g/L、约2.5g/L至约18g/L、约2.5g/L至约16g/L、约2.5g/L至约14g/L、约2.5g/L至约12g/L、约2.5g/L至约10g/L、约2.5g/L至约9.5g/L、约2.5g/L至约9.0g/L、约2.5g/L至约8.5g/L、约2.5g/L至约8.0g/L、约2.5g/L至约7.5g/L、约2.5g/L至约7.0g/L、约2.5g/L至约6.5g/L、约2.5g/L至约6.0g/L、约2.5g/L至约5.5g/L、约2.5g/L至约5.0g/L、约2.5g/L至约4.5g/L、约2.5g/L至约4.0g/L、约2.5g/L至约3.5g/L、约2.5g/L至约3.0g/L、约3.0g/L至约70g/L、约3.0g/L至约65g/L、约3.0g/L至约60g/L、约3.0g/L至约55g/L、约3.0g/L至约50g/L、约3.0g/L至约45g/L、约3.0g/L至约40g/L、约3.0g/L至约35g/L、约3.0g/L至约30g/L、约3.0g/L至约25g/L、约3.0g/L至约20g/L、约3.0g/L至约18g/L、约3.0g/L至约16g/L、约3.0g/L至约14g/L、约3.0g/L至约12g/L、约3.0g/L至约10g/L、约3.0g/L至约9.5g/L、约3.0g/L至约9.0g/L、约3.0g/L至约8.5g/L、约3.0g/L至约8.0g/L、约3.0g/L至约7.5g/L、约3.0g/L至约7.0g/L、约3.0g/L至约6.5g/L、约3.0g/L至约6.0g/L、约3.0g/L至约5.5g/L、约3.0g/L至约5.0g/L、约3.0g/L至约4.5g/L、约3.0g/L至约4.0g/L、约3.0g/L至约3.5g/L、约3.5g/L至约70g/L、约3.5g/L至约65g/L、约3.5g/L至约60g/L、约3.5g/L至约55g/L、约3.5g/L至约50g/L、约3.5g/L至约45g/L、约3.5g/L至约40g/L、约3.5g/L至约35g/L、约3.5g/L至约30g/L、约3.5g/L至约25g/L、约3.5g/L至约20g/L、约3.5g/L至约18g/L、约3.5g/L至约16g/L、约3.5g/L至约14g/L、约3.5g/L至约12g/L、约3.5g/L至约10g/L、约3.5g/L至约9.5g/L、约3.5g/L至约9.0g/L、约3.5g/L至约8.5g/L、约3.5g/L至约8.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或约80μM至约560mM(例如，约80μM至约540mM、约80μM至约520mM、约80μM至约500mM、约80μM至约480mM、约80μM至约460mM、约80μM至约440mM、约80μM至约420mM、约80μM至约400mM、约80μM至约380mM、约80μM至约360mM、约80μM至约340mM、约80μM至约320mM、约80μM至约300mM、约80μM至约280mM、约80μM至约260mM、约80μM至约240mM、约80μM至约220mM、约80μM至约200mM、约80μM至约180mM、约80μM至约160mM、约80μM至约140mM、约80μM至约120mM、约80μM至约100mM、约80μM至约95mM、约80μM至约90mM、约80μM至约85mM、约80μM至约80mM、约80μM至约75mM、约80μM至约70mM、约80μM至约65mM、约80μM至约60mM、约80μM至约55mM、约80μM至约50mM、约80μM至约45mM、约80μM至约40mM、约80μM至约35mM、约80μM至约30mM、约80μM至约25mM、约80μM至约20mM、约80μM至约15mM、约80μM至约10mM、约80μM至约5mM、约80μM至约2mM、约80μM至约1mM、约80μM至约0.5mM、约80μM至约250μM、约80μM至约100μM、约100μM至约560mM、约100μM至约540mM、约100μM至约520mM、约100μM至约500mM、约100μM至约480mM、约100μM至约460mM、约100μM至约440mM、约100μM至约420mM、约100μM至约400mM、约100μM至约380mM、约100μM至约360mM、约100μM至约340mM、约100μM至约320mM、约100μM至约300mM、约100μM至约280mM、约100μM至约260mM、约100μM至约240mM、约100μM至约220mM、约100μM至约200mM、约100μM至约180mM、约100μM至约160mM、约100μM至约140mM、约100μM至约120mM、约100μM至约100mM、约100μM至约95mM、约100μM至约90mM、约100μM至约85mM、约100μM至约80mM、约100μM至约75mM、约100μM至约70mM、约100μM至约65mM、约100μM至约60mM、约100μM至约55mM、约100μM至约50mM、约100μM至约45mM、约100μM至约40mM、约100μM至约35mM、约100μM至约30mM、约100μM至约25mM、约100μM至约20mM、约100μM至约15mM、约100μM至约10mM、约100μM至约5mM、约100μM至约2mM、约100μM至约1mM、约100μM至约0.5mM、约100μM至约250μM、约250μM至约560mM、约250μM至约540mM、约250μM至约520mM、约250μM至约500mM、约250μM至约480mM、约250μM至约460mM、约250μM至约440mM、约250μM至约420mM、约250μM至约400mM、约250μM至约380mM、约250μM至约360mM、约250μM至约340mM、约250μM至约320mM、约250μM至约300mM、约250μM至约280mM、约250μM至约260mM、约250μM至约240mM、约250μM至约220mM、约250μM至约200mM、约250μM至约180mM、约250μM至约160mM、约250μM至约140mM、约250μM至约120mM、约250μM至约100mM、约250μM至约95mM、约250μM至约90mM、约250μM至约85mM、约250μM至约80mM、约250μM至约75mM、约250μM至约70mM、约250μM至约65mM、约250μM至约60mM、约250μM至约55mM、约250μM至约50mM、约250μM至约45mM、约250μM至约40mM、约250μM至约35mM、约250μM至约30mM、约250μM至约25mM、约250μM至约20mM、约250μM至约15mM、约250μM至约10mM、约250μM至约5mM、约250μM至约2mM、约250μM至约1mM、约250μM至约0.5mM、约0.5mM至约560mM、约0.5mM至约540mM、约0.5mM至约520mM、约0.5mM至约500mM、约0.5mM至约480mM、约0.5mM至约460mM、约0.5mM至约440mM、约0.5mM至约420mM、约0.5mM至约400mM、约0.5mM至约380mM、约0.5mM至约360mM、约0.5mM至约340mM、约0.5mM至约320mM、约0.5mM至约300mM、约0.5mM至约280mM、约0.5mM至约260mM、约0.5mM至约240mM、约0.5mM至约220mM、约0.5mM至约200mM、约0.5mM至约180mM、约0.5mM至约160mM、约0.5mM至约140mM、约0.5mM至约120mM、约0.5mM至约100mM、约0.5mM至约95mM、约0.5mM至约90mM、约0.5mM至约85mM、约0.5mM至约80mM、约0.5mM至约75mM、约0.5mM至约70mM、约0.5mM至约65mM、约0.5mM至约60mM、约0.5mM至约55mM、约0.5mM至约50mM、约0.5mM至约45mM、约0.5mM至约40mM、约0.5mM至约35mM、约0.5mM至约30mM、约0.5mM至约25mM、约0.5mM至约20mM、约0.5mM至约15mM、约0.5mM至约10mM、约0.5mM至约5mM、约0.5mM至约2mM、约0.5mM至约1mM、约1mM至约560mM、约1mM至约540mM、约1mM至约520mM、约1mM至约500mM、约1mM至约480mM、约1mM至约460mM、约1mM至约440mM、约1mM至约420mM、约1mM至约400mM、约1mM至约380mM、约1mM至约360mM、约1mM至约340mM、约1mM至约320mM、约1mM至约300mM、约1mM至约280mM、约1mM至约260mM、约1mM至约240mM、约1mM至约220mM、约1mM至约200mM、约1mM至约180mM、约1mM至约160mM、约1mM至约140mM、约1mM至约120mM、约1mM至约100mM、约1mM至约95mM、约1mM至约90mM、约1mM至约85mM、约1mM至约80mM、约1mM至约75mM、约1mM至约70mM、约1mM至约65mM、约1mM至约60mM、约1mM至约55mM、约1mM至约50mM、约1mM至约45mM、约1mM至约40mM、约1mM至约35mM、约1mM至约30mM、约1mM至约25mM、约1mM至约20mM、约1mM至约15mM、约1mM至约10mM、约1mM至约5mM、约1mM至约2mM、约2mM至约560mM、约2mM至约540mM、约2mM至约520mM、约2mM至约500mM、约2mM至约480mM、约2mM至约460mM、约2mM至约440mM、约2mM至约420mM、约2mM至约400mM、约2mM至约380mM、约2mM至约360mM、约2mM至约340mM、约2mM至约320mM、约2mM至约300mM、约2mM至约280mM、约2mM至约260mM、约2mM至约240mM、约2mM至约220mM、约2mM至约200mM、约2mM至约180mM、约2mM至约160mM、约2mM至约140mM、约2mM至约120mM、约2mM至约100mM、约2mM至约95mM、约2mM至约90mM、约2mM至约85mM、约2mM至约80mM、约2mM至约75mM、约2mM至约70mM、约2mM至约65mM、约2mM至约60mM、约2mM至约55mM、约2mM至约50mM、约2mM至约45mM、约2mM至约40mM、约2mM至约35mM、约2mM至约30mM、约2mM至约25mM、约2mM至约20mM、约2mM至约15mM、约2mM至约10mM、约2mM至约5mM、约5mM至约560mM、约5mM至约540mM、约5mM至约520mM、约5mM至约500mM、约5mM至约480mM、约5mM至约460mM、约5mM至约440mM、约5mM至约420mM、约5mM至约400mM、约5mM至约380mM、约5mM至约360mM、约5mM至约340mM、约5mM至约320mM、约5mM至约300mM、约5mM至约280mM、约5mM至约260mM、约5mM至约240mM、约5mM至约220mM、约5mM至约200mM、约5mM至约180mM、约5mM至约160mM、约5mM至约140mM、约5mM至约120mM、约5mM至约100mM、约5mM至约95mM、约5mM至约90mM、约5mM至约85mM、约5mM至约80mM、约5mM至约75mM、约5mM至约70mM、约5mM至约65mM、约5mM至约60mM、约5mM至约55mM、约5mM至约50mM、约5mM至约45mM、约5mM至约40mM、约5mM至约35mM、约5mM至约30mM、约5mM至约25mM、约5mM至约20mM、约5mM至约15mM、约5mM至约10mM、约10mM至约560mM、约10mM至约540mM、约10mM至约520mM、约10mM至约500mM、约10mM至约480mM、约10mM至约460mM、约10mM至约440mM、约10mM至约420mM、约10mM至约400mM、约10mM至约380mM、约10mM至约360mM、约10mM至约340mM、约10mM至约320mM、约10mM至约300mM、约10mM至约280mM、约10mM至约260mM、约10mM至约240mM、约10mM至约220mM、约10mM至约200mM、约10mM至约180mM、约10mM至约160mM、约10mM至约140mM、约10mM至约120mM、约10mM至约100mM、约10mM至约95mM、约10mM至约90mM、约10mM至约85mM、约10mM至约80mM、约10mM至约75mM、约10mM至约70mM、约10mM至约65mM、约10mM至约60mM、约10mM至约55mM、约10mM至约50mM、约10mM至约45mM、约10mM至约40mM、约10mM至约35mM、约10mM至约30mM、约10mM至约25mM、约10mM至约20mM、约10mM至约15mM、约15mM至约560mM、约15mM至约540mM、约15mM至约520mM、约15mM至约500mM、约15mM至约480mM、约15mM至约460mM、约15mM至约440mM、约15mM至约420mM、约15mM至约400mM、约15mM至约380mM、约15mM至约360mM、约15mM至约340mM、约15mM至约320mM、约15mM至约300mM、约15mM至约280mM、约15mM至约260mM、约15mM至约240mM、约15mM至约220mM、约15mM至约200mM、约15mM至约180mM、约15mM至约160mM、约15mM至约140mM、约15mM至约120mM、约15mM至约100mM、约15mM至约95mM、约15mM至约90mM、约15mM至约85mM、约15mM至约80mM、约15mM至约75mM、约15mM至约70mM、约15mM至约65mM、约15mM至约60mM、约15mM至约55mM、约15mM至约50mM、约15mM至约45mM、约15mM至约40mM、约15mM至约35mM、约15mM至约30mM、约15mM至约25mM、约15mM至约20mM、约20mM至约560mM、约20mM至约540mM、约2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M、约440mM至约520mM、约440mM至约500mM、约440mM至约480mM、约440mM至约460mM、约460mM至约560mM、约460mM至约540mM、约460mM至约520mM、约460mM至约500mM、约460mM至约480mM、约480mM至约560mM、约480mM至约540mM、约480mM至约520mM、约480mM至约500mM、约500mM至约560mM、约500mM至约540mM、约500mM至约520mM、约520mM至约560mM、约520mM至约540mM、或约540mM至约560mM)牛磺酸(或牛磺酸前体(例如，L-半胱氨酸、L-半胱氨酸盐、半胱胺或半胱氨酸亚磺酸)或牛磺酸分解产物(例如，5-谷氨酰-牛磺酸、牛磺胆酸盐和脒基牛磺酸)和/或0.01g/L至约70g/L(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)或约90μM至约640mM(e.g、约90μM至约600mM、约90μM至约550mM、约90μM至约500mM、约90μM至约480mM、约90μM至约460mM、约90μM至约440mM、约90μM至约420mM、约90μM至约400mM、约90μM至约380mM、约90μM至约360mM、约90μM至约340mM、约90μM至约320mM、约90μM至约300mM、约90μM至约280mM、约90μM至约260mM、约90μM至约240mM、约90μM至约220mM、约90μM至约200mM、约90μM至约180mM、约90μM至约160mM、约90μM至约140mM、约90μM至约120mM、约90μM至约100mM、约90μM至约95mM、约90μM至约90mM、约90μM至约85mM、约90μM至约80mM、约90μM至约75mM、约90μM至约70mM、约90μM至约65mM、约90μM至约60mM、约90μM至约55mM、约90μM至约50mM、约90μM至约45mM、约90μM至约40mM、约90μM至约35mM、约90μM至约30mM、约90μM至约25mM、约90μM至约20mM、约90μM至约15mM、约90μM至约10mM、约90μM至约5mM、约90μM至约2mM、约90μM至约1mM、约90μM至约0.5mM、约90μM至约250μM、约90μM至约100μM、约100μM至约640mM、约100μM至约600mM、约100μM至约550mM、约100μM至约500mM、约100μM至约480mM、约100μM至约460mM、约100μM至约440mM、约100μM至约420mM、约100μM至约400mM、约100μM至约380mM、约100μM至约360mM、约100μM至约340mM、约100μM至约320mM、约100μM至约300mM、约100μM至约280mM、约100μM至约260mM、约100μM至约240mM、约100μM至约220mM、约100μM至约200mM、约100μM至约180mM、约100μM至约160mM、约100μM至约140mM、约100μM至约120mM、约100μM至约100mM、约100μM至约95mM、约100μM至约90mM、约100μM至约85mM、约100μM至约80mM、约100μM至约75mM、约100μM至约70mM、约100μM至约65mM、约100μM至约60mM、约100μM至约55mM、约100μM至约50mM、约100μM至约45mM、约100μM至约40mM、约100μM至约35mM、约100μM至约30mM、约100μM至约25mM、约100μM至约20mM、约100μM至约15mM、约100μM至约10mM、约100μM至约5mM、约100μM至约2mM、约100μM至约1mM、约100μM至约0.5mM、约100μM至约250μM、约250μM至约640mM、约250μM至约600mM、约250μM至约550mM、约250μM至约500mM、约250μM至约480mM、约250μM至约460mM、约250μM至约440mM、约250μM至约420mM、约250μM至约400mM、约250μM至约380mM、约250μM至约360mM、约250μM至约340mM、约250μM至约320mM、约250μM至约300mM、约250μM至约280mM、约250μM至约260mM、约250μM至约240mM、约250μM至约220mM、约250μM至约200mM、约250μM至约180mM、约250μM至约160mM、约250μM至约140mM、约250μM至约120mM、约250μM至约100mM、约250μM至约95mM、约250μM至约90mM、约250μM至约85mM、约250μM至约80mM、约250μM至约75mM、约250μM至约70mM、约250μM至约65mM、约250μM至约60mM、约250μM至约55mM、约250μM至约50mM、约250μM至约45mM、约250μM至约40mM、约250μM至约35mM、约250μM至约30mM、约250μM至约25mM、约250μM至约20mM、约250μM至约15mM、约250μM至约10mM、约250μM至约5mM、约250μM至约2mM、约250μM至约1mM、约250μM至约0.5mM、约0.5mM至约640mM、约0.5mM至约600mM、约0.5mM至约550mM、约0.5mM至约500mM、约0.5mM至约480mM、约0.5mM至约460mM、约0.5mM至约440mM、约0.5mM至约420mM、约0.5mM至约400mM、约0.5mM至约380mM、约0.5mM至约360mM、约0.5mM至约340mM、约0.5mM至约320mM、约0.5mM至约300mM、约0.5mM至约280mM、约0.5mM至约260mM、约0.5mM至约240mM、约0.5mM至约220mM、约0.5mM至约200mM、约0.5mM至约180mM、约0.5mM至约160mM、约0.5mM至约140mM、约0.5mM至约120mM、约0.5mM至约100mM、约0.5mM至约95mM、约0.5mM至约90mM、约0.5mM至约85mM、约0.5mM至约80mM、约0.5mM至约75mM、约0.5mM至约70mM、约0.5mM至约65mM、约0.5mM至约60mM、约0.5mM至约55mM、约0.5mM至约50mM、约0.5mM至约45mM、约0.5mM至约40mM、约0.5mM至约35mM、约0.5mM至约30mM、约0.5mM至约25mM、约0.5mM至约20mM、约0.5mM至约15mM、约0.5mM至约10mM、约0.5mM至约5mM、约0.5mM至约2mM、约0.5mM至约1mM、约1mM至约640mM、约1mM至约600mM、约1mM至约550mM、约1mM至约500mM、约1mM至约480mM、约1mM至约460mM、约1mM至约440mM、约1mM至约420mM、约1mM至约400mM、约1mM至约380mM、约1mM至约360mM、约1mM至约340mM、约1mM至约320mM、约1mM至约300mM、约1mM至约280mM、约1mM至约260mM、约1mM至约240mM、约1mM至约220mM、约1mM至约200mM、约1mM至约180mM、约1mM至约160mM、约1mM至约140mM、约1mM至约120mM、约1mM至约100mM、约1mM至约95mM、约1mM至约90mM、约1mM至约85mM、约1mM至约80mM、约1mM至约75mM、约1mM至约70mM、约1mM至约65mM、约1mM至约60mM、约1mM至约55mM、约1mM至约50mM、约1mM至约45mM、约1mM至约40mM、约1mM至约35mM、约1mM至约30mM、约1mM至约25mM、约1mM至约20mM、约1mM至约15mM、约1mM至约10mM、约1mM至约5mM、约1mM至约2mM、约2mM至约640mM、约2mM至约600mM、约2mM至约550mM、约2mM至约500mM、约2mM至约480mM、约2mM至约460mM、约2mM至约440mM、约2mM至约420mM、约2mM至约400mM、约2mM至约380mM、约2mM至约360mM、约2mM至约340mM、约2mM至约320mM、约2mM至约300mM、约2mM至约280mM、约2mM至约260mM、约2mM至约240mM、约2mM至约220mM、约2mM至约200mM、约2mM至约180mM、约2mM至约160mM、约2mM至约140mM、约2mM至约120mM、约2mM至约100mM、约2mM至约95mM、约2mM至约90mM、约2mM至约85mM、约2mM至约80mM、约2mM至约75mM、约2mM至约70mM、约2mM至约65mM、约2mM至约60mM、约2mM至约55mM、约2mM至约50mM、约2mM至约45mM、约2mM至约40mM、约2mM至约35mM、约2mM至约30mM、约2mM至约25mM、约2mM至约20mM、约2mM至约15mM、约2mM至约10mM、约2mM至约5mM、约5mM至约640mM、约5mM至约600mM、约5mM至约550mM、约5mM至约500mM、约5mM至约480mM、约5mM至约460mM、约5mM至约440mM、约5mM至约420mM、约5mM至约400mM、约5mM至约380mM、约5mM至约360mM、约5mM至约340mM、约5mM至约320mM、约5mM至约300mM、约5mM至约280mM、约5mM至约260mM、约5mM至约240mM、约5mM至约220mM、约5mM至约200mM、约5mM至约180mM、约5mM至约160mM、约5mM至约140mM、约5mM至约120mM、约5mM至约100mM、约5mM至约95mM、约5mM至约90mM、约5mM至约85mM、约5mM至约80mM、约5mM至约75mM、约5mM至约70mM、约5mM至约65mM、约5mM至约60mM、约5mM至约55mM、约5mM至约50mM、约5mM至约45mM、约5mM至约40mM、约5mM至约35mM、约5mM至约30mM、约5mM至约25mM、约5mM至约20mM、约5mM至约15mM、约5mM至约10mM、约10mM至约640mM、约10mM至约600mM、约10mM至约550mM、约10mM至约500mM、约10mM至约480mM、约10mM至约460mM、约10mM至约440mM、约10mM至约420mM、约10mM至约400mM、约10mM至约380mM、约10mM至约360mM、约10mM至约340mM、约10mM至约320mM、约10mM至约300mM、约10mM至约280mM、约10mM至约260mM、约10mM至约240mM、约10mM至约220mM、约10mM至约200mM、约10mM至约180mM、约10mM至约160mM、约10mM至约140mM、约10mM至约120mM、约10mM至约100mM、约10mM至约95mM、约10mM至约90mM、约10mM至约85mM、约10mM至约80mM、约10mM至约75mM、约10mM至约70mM、约10mM至约65mM、约10mM至约60mM、约10mM至约55mM、约10mM至约50mM、约10mM至约45mM、约10mM至约40mM、约10mM至约35mM、约10mM至约30mM、约10mM至约25mM、约10mM至约20mM、约10mM至约15mM、约15mM至约640mM、约15mM至约600mM、约15mM至约550mM、约15mM至约500mM、约15mM至约480mM、约15mM至约460mM、约15mM至约440mM、约15mM至约420mM、约15mM至约400mM、约15mM至约380mM、约15mM至约360mM、约15mM至约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400mM、约360mM至约380mM、约380mM至约640mM、约380mM至约600mM、约380mM至约550mM、约380mM至约500mM、约380mM至约480mM、约380mM至约460mM、约380mM至约440mM、约380mM至约420mM、约380mM至约400mM、约400mM至约640mM、约400mM至约600mM、约400mM至约550mM、约400mM至约500mM、约400mM至约480mM、约400mM至约460mM、约400mM至约440mM、约400mM至约420mM、约420mM至约640mM、约420mM至约600mM、约420mM至约550mM、约420mM至约500mM、约420mM至约480mM、约420mM至约460mM、约420mM至约440mM、约440mM至约640mM、约440mM至约600mM、约440mM至约550mM、约440mM至约500mM、约440mM至约480mM、约440mM至约460mM、约460mM至约640mM、约460mM至约600mM、约460mM至约550mM、约460mM至约500mM、约460mM至约480mM、约480mM至约640mM、约480mM至约600mM、约480mM至约550mM、约480mM至约500mM、约500mM至约640mM、约500mM至约600mM、约500mM至约550mM、约550mM至约640mM、约550mM至约600mM、或约600mM至约640mM)亚牛磺酸(或其亚牛磺酸前体(例如，L-半胱氨酸、L-半胱氨酸盐、s-羧甲基半胱氨酸、半胱胺或半胱氨酸亚磺酸)或亚牛磺酸分解产物(例如，5-谷氨酰-牛磺酸、牛磺胆酸盐和脒基牛磺酸))，以及任选的一种或多种(例如，两种、三种或四种)运铁蛋白(例如，脱铁运铁蛋白、全铁运铁蛋白或它们的组合)(例如，约1μg/mL至约500μg/mL运铁蛋白(例如，人脱铁运铁蛋白、人全铁运铁蛋白或它们的组合)或本文所述的该范围的任何子范围),胰岛素(例如，约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素(例如，重组人胰岛素)或本文所述的该范围的任何子范围)、SCF(例如，约1ng/mL至约500ng/mL SCF(例如，重组人SCF)或本文所述的该范围的任何子范围)，以及EPO或EPO模拟肽(例如，约1ng/mL至约500ng/mL EPO(例如，重组人EPO)或EPO模拟肽(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性EPO模拟肽)，或本文所述的该范围的任何子范围)。在本文所述的任何第三培养基的一些实施方案中，第三培养基包含伊思柯夫改良杜氏培养基(IMDM)。在本文所述的任何第三培养基的一些实施方案中，第三培养基包含约0.1％v/v至约10％v/v(例如，约0.1％v/v至约9.5％v/v、约0.1％v/v至约9.0％v/v、约0.1％v/v至约8.5％v/v、约0.1％v/v至约8.0％v/v、约0.1％v/v至约7.5％v/v、约0.1％v/v至约7.0％v/v、约0.1％v/v至约6.5％v/v、约0.1％v/v至约6.0％v/v、约0.1％v/v至约5.5％v/v、约0.1％v/v至约5.0％v/v、约0.1％v/v至约4.5％v/v、约0.1％v/v至约4.0％v/v、约0.1％v/v至约3.5％v/v、约0.1％v/v至约3.0％v/v、约0.1％v/v至约2.5％v/v、约0.1％v/v至约2.0％v/v、约0.1％v/v至约1.5％v/v、约0.1％v/v至约1.0％v/v、约0.5％v/v至约1.0％v/v、约0.5％v/v至约9.5％v/v、约0.5％v/v至约9.0％v/v、约0.5％v/v至约8.5％v/v、约0.5％v/v至约8.0％v/v、约0.5％v/v至约7.5％v/v、约0.5％v/v至约7.0％v/v、约0.5％v/v至约6.5％v/v、约0.5％v/v至约6.0％v/v、约0.5％v/v至约5.5％v/v、约0.5％v/v至约5.0％v/v、约0.5％v/v至约4.5％v/v、约0.5％v/v至约4.0％v/v、约0.5％v/v至约3.5％v/v、约0.5％v/v至约3.0％v/v、约0.5％v/v至约2.5％v/v、约0.5％v/v至约2.0％v/v、约0.5％v/v至约1.5％v/v、约0.5％v/v至约1.0％v/v、约1.0％v/v至约10％v/v、约1.0％v/v至约9.5％v/v、约1.0％v/v至约9.0％v/v、约1.0％v/v至约8.5％v/v、约1.0％v/v至约8.0％v/v、约1.0％v/v至约7.5％v/v、约1.0％v/v至约7.0％v/v、约1.0％v/v至约6.5％v/v、约1.0％v/v至约6.0％v/v、约1.0％v/v至约5.5％v/v、约1.0％v/v至约5.0％v/v、约1.0％v/v至约4.5％v/v、约1.0％v/v至约4.0％v/v、约1.0％v/v至约3.5％v/v、约1.0％v/v至约3.0％v/v、约1.0％v/v至约2.5％v/v、约1.0％v/v至约2.0％v/v、约1.0％v/v至约1.5％v/v、约1.5％v/v至约10％v/v、约1.5％v/v至约9.5％v/v、约1.5％v/v至约9.0％v/v、约1.5％v/v至约8.5％v/v、约1.5％v/v至约8.0％v/v、约1.5％v/v至约7.5％v/v、约1.5％v/v至约7.0％v/v、约1.5％v/v至约6.5％v/v、约1.5％v/v至约6.0％v/v、约1.5％v/v至约5.5％v/v、约1.5％v/v至约5.0％v/v、约1.5％v/v至约4.5％v/v、约1.5％v/v至约4.0％v/v、约1.5％v/v至约3.5％v/v、约1.5％v/v至约3.0％v/v、约1.5％v/v至约2.5％v/v、约1.5％v/v至约2.0％v/v、约2.0％v/v至约10％v/v、约2.0％v/v至约9.5％v/v、约2.0％v/v至约9.0％v/v、约2.0％v/v至约8.5％v/v、约2.0％v/v至约8.000％v/v、约2.0％v/v至约7.5％v/v、约2.0％v/v至约7.0％v/v、约2.0％v/v至约6.5％v/v、约2.0％v/v至约6.0％v/v、约2.0％v/v至约5.5％v/v、约2.0％v/v至约5.0％v/v、约2.0％v/v至约4.5％v/v、约2.0％v/v至约4.0％v/v、约2.0％v/v至约3.5％v/v、约2.0％v/v至约3.0％v/v、约2.0％v/v至约2.5％v/v、约2.5％v/v至约10％v/v、约2.5％v/v至约9.5％v/v、约2.5％v/v至约9.0％v/v、约2.5％v/v至约8.5％v/v、约2.5％v/v至约8.0％v/v、约2.5％v/v至约7.5％v/v、约2.5％v/v至约7.0％v/v、约2.5％v/v至约6.5％v/v、约2.5％v/v至约6.0％v/v、约2.5％v/v至约5.5％v/v、约2.5％v/v至约5.0％v/v、约2.5％v/v至约4.5％v/v、约2.5％v/v至约4.0％v/v、约2.5％v/v至约3.5％v/v、约2.5％v/v至约3.0％v/v、约3.0％v/v至约10％v/v、约3.0％v/v至约9.5％v/v、约3.0％v/v至约9.0％v/v、约3.0％v/v至约8.5％v/v、约3.0％v/v至约8.0％v/v、约3.0％v/v至约7.5％v/v、约3.0％v/v至约7.0％v/v、约3.0％v/v至约6.5％v/v、约3.0％v/v至约6.0％v/v、约3.0％v/v至约5.5％v/v、约3.0％v/v至约5.0％v/v、约3.0％v/v至约4.5％v/v、约3.0％v/v至约4.0％v/v、约3.0％v/v至约3.5％v/v、约3.5％v/v至约10％v/v、约3.5％v/v至约9.5％v/v、约3.5％v/v至约9.0％v/v、约3.5％v/v至约8.5％v/v、约3.5％v/v至约8.0％v/v、约3.5％v/v至约7.5％v/v、约3.5％v/v至约7.0％v/v、约3.5％v/v至约6.5％v/v、约3.5％v/v至约6.0％v/v、约3.5％v/v至约5.5％v/v、约3.5％v/v至约5.0％v/v、约3.5％v/v至约4.5％v/v、约3.5％v/v至约4.0％v/v、约4.0％v/v至约10％v/v、约4.0％v/v至约9.5％v/v、约4.0％v/v至约9.0％v/v、约4.0％v/v至约8.5％v/v、约4.0％v/v至约8.0％v/v、约4.0％v/v至约7.5％v/v、约4.0％v/v至约7.0％v/v、约4.0％v/v至约6.5％v/v、约4.0％v/v至约6.0％v/v、约4.0％v/v至约5.5％v/v、约4.0％v/v至约5％v/v、约4.0％v/v至约4.5％v/v、约4.5％v/v至约10％v/v、约4.5％v/v至约9.5％v/v、约4.5％v/v至约9.0％v/v、约4.5％v/v至约8.5％v/v、约4.5％v/v至约8.0％v/v、约4.5％v/v至约7.5％v/v、约4.5％v/v至约7.0％v/v、约4.5％v/v至约6.5％v/v、约4.5％v/v至约6.0％v/v、约4.5％v/v至约5.5％v/v、约4.5％v/v至约5.0％v/v、约5.0％v/v至约10％v/v、约5.0％v/v至约9.5％v/v、约5.0％v/v至约9.0％v/v、约5.0％v/v至约8.5％v/v、约5.0％v/v至约8.0％v/v、约5.0％v/v至约7.5％v/v、约5.0％v/v至约7.0％v/v、约5.0％v/v至约6.5％v/v、约5.0％v/v至约6.0％v/v、约5.0％v/v至约5.5％v/v、约5.5％v/v至约10％v/v、约5.5％v/v至约9.5％v/v、约5.5％v/v至约9.0％v/v、约5.5％v/v至约8.5％v/v、约5.5％v/v至约8.0％v/v、约5.5％v/v至约7.5％v/v、约5.5％v/v至约7.0％v/v、约5.5％v/v至约6.5％v/v、约5.5％v/v至约6.0％v/v、约6.0％v/v至约10％v/v、约6.0％v/v至约9.5％v/v、约6.0％v/v至约9.0％v/v、约6.0％v/v至约8.5％v/v、约6.0％v/v至约8.0％v/v、约6.0％v/v至约7.5％v/v、约6.0％v/v至约7.000％v/v、约6.0％v/v至约6.5％v/v、约6.5％v/v至约10％v/v、约6.5％v/v至约9.5％v/v、约6.5％v/v至约9.0％v/v、约6.5％v/v至约8.5％v/v、约6.5％v/v至约8.0％v/v、约6.5％v/v至约7.5％v/v、约6.5％v/v至约7.0％v/v、约7.0％v/v至约10％v/v、约7.0％v/v至约9.5％v/v、约7.0％v/v至约9.0％v/v、约7.0％v/v至约8.5％v/v、约7.0％v/v至约8.0％v/v、约7.0％v/v至约7.5％v/v、约7.5％v/v至约10％v/v、约7.5％v/v至约9.5％v/v、约7.5％v/v至约9.0％v/v、约7.5％v/v至约8.5％v/v、约7.5％v/v至约8.0％v/v、约8.0％v/v至约10％v/v、约8.0％v/v至约9.5％v/v、约8.0％v/v至约9.0％v/v、约8.000％v/v至约8.5％v/v、约8.5％v/v至约10％v/v、约8.5％v/v至约9.5％v/v、约8.5％v/v至约9.0％v/v、约9.0％v/v至约10％v/v、约9.0％v/v至约9.5％v/v、或约9.5％v/v至约10％v/v)血清(例如，人AB血清)。在一些实施方案中，第三培养基包含0.1％v/v至约5％v/v(例如，约0.1％v/v至约4.5％v/v、约0.1％v/v至约4.0％v/v、约0.1％v/v至约3.5％v/v、约0.1％v/v至约3.0％v/v、约0.1％v/v至约2.5％v/v、约0.1％v/v至约2.0％v/v、约0.1％v/v至约1.5％v/v、约0.1％v/v至约1.0％v/v、约0.1％v/v至约0.5％v/v、约0.5％v/v至约5％v/v、约0.5％v/v至约4.5％v/v、约0.5％v/v至约4.0％v/v、约0.5％v/v至约3.5％v/v、约0.5％v/v至约3.0％v/v、约0.5％v/v至约2.5％v/v、约0.5％v/v至约2.0％v/v、约0.5％v/v至约1.5％v/v、约0.5％v/v至约1.0％v/v、约1.0％v/v至约5％v/v、约1.0％v/v至约4.5％v/v、约1.0％v/v至约4.0％v/v、约1.0％v/v至约3.5％v/v、约1.0％v/v至约3.0％v/v、约1.0％v/v至约2.5％v/v、约1.0％v/v至约2.0％v/v、约1.0％v/v至约1.5％v/v、约1.5％v/v至约5％v/v、约1.5％v/v至约4.5％v/v、约1.5％v/v至约4.0％v/v、约1.5％v/v至约3.5％v/v、约1.5％v/v至约3.0％v/v、约1.5％v/v至约2.5％v/v、约1.5％v/v至约2.0％v/v、约2.0％v/v至约5％v/v、约2.0％v/v至约4.5％v/v、约2.0％v/v至约4.0％v/v、约2.0％v/v至约3.5％v/v、约2.0％v/v至约3.0％v/v、约2.0％v/v至约2.5％v/v、约2.5％v/v至约5％v/v、约2.5％v/v至约4.5％v/v、约2.5％v/v至约4.0％v/v、约2.5％v/v至约3.5％v/v、约2.5％v/v至约3.0％v/v、约3.0％v/v至约5％v/v、约3.0％v/v至约4.5％v/v、约3.0％v/v至约4.0％v/v、约3.0％v/v至约3.5％v/v、约3.5％v/v至约5％v/v、约3.5％v/v至约4.5％v/v、约3.5％v/v至约4.0％v/v、约4.0％v/v至约5％v/v、约4.0％v/v至约4.5％v/v、或约4.5％v/v至约5％v/v)人血浆。在一些实施方案中，第三培养基包含约1U/mL至约5U/mL(例如，约1U/mL至约4U/mL、约1U/mL至约3U/mL、约1U/mL至约2U/mL、约2U/mL至约5U/mL、约2U/mL至约4U/mL、约2U/mL至约3U/mL、约3U/mL至约5U/mL、约3U/mL至约4U/mL、或约4U/mL至约5U/mL)肝素。在一些实施方案中，第三培养基包含约0.1％w/v至约3％w/v(例如，约0.1％w/v至约2.5％w/v、约0.1％w/v至约2.0％w/v、约0.1％w/v至约1.5％w/v、约0.1％w/v至约1.0％w/v、约0.1％w/v至约0.5％w/v、约0.5％w/v至约3％w/v、约0.5％w/v至约2.5％w/v、约0.5％w/v至约2.0％w/v、约0.5％w/v至约1.5％w/v、约0.5％w/v至约1.0％w/v、约1.0％w/v至约3％w/v、约1.0％w/v至约2.5％w/v、约1.0％w/v至约2.0％w/v、约1.0％w/v至约1.5％w/v、约1.5％w/v至约3％w/v、约1.5％w/v至约2.5％w/v、约1.5％w/v至约2.0％w/v、约2.0％w/v至约3％w/v、约2.0％w/v至约2.5％w/v、或约2.5％w/v至约3％w/v)的泊洛沙姆-188(P188)。

在本文所述的任何第三培养基的一些实施方案中，第三培养基包含约1mM至约8mM(例如，约1mM至约7mM、约1mM至约6mM、约1mM至约5mM、约1mM至约4mM、约1mM至约3mM、约1mM至约2mM、约2mM至约8mM、约2mM至约7mM、约2mM至约6mM、约2mM至约5mM、约2mM至约4mM、约2mM至约3mM、约3mM至约8mM、约3mM至约7mM、约3mM至约6mM、约3mM至约5mM、约3mM至约4mM、约4mM至约8mM、约4mM至约7mM、约4mM至约6mM、约4mM至约5mM、约5mM至约8mM、约5mM至约7mM、约5mM至约6mM、约6mM至约8mM、约6mM至约7mM、或约7mM至约8mM)的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。

在一些实施方案中，第三培养基包含约1μg/mL至约500μg/mL、约1μg/mL至约450μg/mL、约1μg/mL至约400μg/mL、约1μg/mL至约350μg/mL、约1μg/mL至约300μg/mL、约1μg/mL至约250μg/mL、约1μg/mL至约200μg/mL、约1μg/mL至约180μg/mL、约1μg/mL至约160μg/mL、约1μg/mL至约140μg/mL、约1μg/mL至约120μg/mL、约1μg/mL至约100μg/mL、约1μg/mL至约80μg/mL、约1μg/mL至约60μg/mL、约1μg/mL至约40μg/mL、约1μg/mL至约20μg/mL、约1μg/mL至约10μg/mL、约1μg/mL至约5μg/mL、5μg/mL至约500μg/mL、约5μg/mL至约450μg/mL、约5μg/mL至约400μg/mL、约5μg/mL至约350μg/mL、约5μg/mL至约300μg/mL、约5μg/mL至约250μg/mL、约5μg/mL至约200μg/mL、约5μg/mL至约180μg/mL、约5μg/mL至约160μg/mL、约5μg/mL至约140μg/mL、约5μg/mL至约120μg/mL、约5μg/mL至约100μg/mL、约5μg/mL至约80μg/mL、约5μg/mL至约60μg/mL、约5μg/mL至约40μg/mL、约5μg/mL至约20μg/mL、约5μg/mL至约10μg/mL、10μg/mL至约500μg/mL、约10μg/mL至约450μg/mL、约10μg/mL至约400μg/mL、约10μg/mL至约350μg/mL、约10μg/mL至约300μg/mL、约10μg/mL至约250μg/mL、约10μg/mL至约200μg/mL、约10μg/mL至约180μg/mL、约10μg/mL至约160μg/mL、约10μg/mL至约140μg/mL、约10μg/mL至约120μg/mL、约10μg/mL至约100μg/mL、约10μg/mL至约80μg/mL、约10μg/mL至约60μg/mL、约10μg/mL至约40μg/mL、约10μg/mL至约20μg/mL、20μg/mL至约500μg/mL、约20μg/mL至约450μg/mL、约20μg/mL至约400μg/mL、约20μg/mL至约350μg/mL、约20μg/mL至约300μg/mL、约20μg/mL至约250μg/mL、约20μg/mL至约200μg/mL、约20μg/mL至约180μg/mL、约20μg/mL至约160μg/mL、约20μg/mL至约140μg/mL、约20μg/mL至约120μg/mL、约20μg/mL至约100μg/mL、约20μg/mL至约80μg/mL、约20μg/mL至约60μg/mL、约20μg/mL至约40μg/mL、40μg/mL至约500μg/mL、约40μg/mL至约450μg/mL、约40μg/mL至约400μg/mL、约40μg/mL至约350μg/mL、约40μg/mL至约300μg/mL、约40μg/mL至约250μg/mL、约40μg/mL至约200μg/mL、约40μg/mL至约180μg/mL、约40μg/mL至约160μg/mL、约40μg/mL至约140μg/mL、约40μg/mL至约120μg/mL、约40μg/mL至约100μg/mL、约40μg/mL至约80μg/mL、约40μg/mL至约60μg/mL、60μg/mL至约500μg/mL、约60μg/mL至约450μg/mL、约60μg/mL至约400μg/mL、约60μg/mL至约350μg/mL、约60μg/mL至约300μg/mL、约60μg/mL至约250μg/mL、约60μg/mL至约200μg/mL、约60μg/mL至约180μg/mL、约60μg/mL至约160μg/mL、约60μg/mL至约140μg/mL、约60μg/mL至约120μg/mL、约60μg/mL至约100μg/mL、约60μg/mL至约80μg/mL、80μg/mL至约500μg/mL、约80μg/mL至约450μg/mL、约80μg/mL至约400μg/mL、约80μg/mL至约350μg/mL、约80μg/mL至约300μg/mL、约80μg/mL至约250μg/mL、约80μg/mL至约200μg/mL、约80μg/mL至约180μg/mL、约80μg/mL至约160μg/mL、约80μg/mL至约140μg/mL、约80μg/mL至约120μg/mL、约80μg/mL至约100μg/mL、100μg/mL至约500μg/mL、约100μg/mL至约450μg/mL、约100μg/mL至约400μg/mL、约100μg/mL至约350μg/mL、约100μg/mL至约300μg/mL、约100μg/mL至约250μg/mL、约100μg/mL至约200μg/mL、约100μg/mL至约180μg/mL、约100μg/mL至约160μg/mL、约100μg/mL至约140μg/mL、约100μg/mL至约120μg/mL、120μg/mL至约500μg/mL、约120μg/mL至约450μg/mL、约120μg/mL至约400μg/mL、约120μg/mL至约350μg/mL、约120μg/mL至约300μg/mL、约120μg/mL至约250μg/mL、约120μg/mL至约200μg/mL、约120μg/mL至约180μg/mL、约120μg/mL至约160μg/mL、约120μg/mL至约140μg/mL、140μg/mL至约500μg/mL、约140μg/mL至约450μg/mL、约140μg/mL至约400μg/mL、约140μg/mL至约350μg/mL、约140μg/mL至约300μg/mL、约140μg/mL至约250μg/mL、约140μg/mL至约200μg/mL、约140μg/mL至约180μg/mL、约140μg/mL至约160μg/mL、160μg/mL至约500μg/mL、约160μg/mL至约450μg/mL、约160μg/mL至约400μg/mL、约160μg/mL至约350μg/mL、约160μg/mL至约300μg/mL、约160μg/mL至约250μg/mL、约160μg/mL至约200μg/mL、约160μg/mL至约180μg/mL、180μg/mL至约500μg/mL、约180μg/mL至约450μg/mL、约180μg/mL至约400μg/mL、约180μg/mL至约350μg/mL、约180μg/mL至约300μg/mL、约180μg/mL至约250μg/mL、约180μg/mL至约200μg/mL、200μg/mL至约500μg/mL、约200μg/mL至约450μg/mL、约200μg/mL至约400μg/mL、约200μg/mL至约350μg/mL、约200μg/mL至约300μg/mL、约200μg/mL至约250μg/mL、250μg/mL至约500μg/mL、约250μg/mL至约450μg/mL、约250μg/mL至约400μg/mL、约250μg/mL至约350μg/mL、约250μg/mL至约300μg/mL、300μg/mL至约500μg/mL、约300μg/mL至约450μg/mL、约300μg/mL至约400μg/mL、约300μg/mL至约350μg/mL、350μg/mL至约500μg/mL、约350μg/mL至约450μg/mL、约350μg/mL至约400μg/mL、400μg/mL至约500μg/mL、约400μg/mL至约450μg/mL或450μg/mL至约500μg/mL的运铁蛋白(例如，人脱铁运铁蛋白、人全铁运铁蛋白或它们的组合)。

在一些实施方案中，第三培养基包含约1ng/mL至约1μg/mL、约1ng/mL至约900ng/mL、约1ng/mL至约800ng/mL、约1ng/mL至约700ng/mL、约1ng/mL至约600ng/mL、约1ng/mL至约500ng/mL、约1ng/mL至约450ng/mL、约1ng/mL至约400ng/mL、约1ng/mL至约350ng/mL、约1ng/mL至约300ng/mL、约1ng/mL至约250ng/mL、约1ng/mL至约200ng/mL、约1ng/mL至约150ng/mL、约1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约50ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、约5ng/mL至约1μg/mL、约5ng/mL至约900ng/mL、约5ng/mL至约800ng/mL、约5ng/mL至约700ng/mL、约5ng/mL至约600ng/mL、约5ng/mL至约500ng/mL、约5ng/mL至约450ng/mL、约5ng/mL至约400ng/mL、约5ng/mL至约350ng/mL、约5ng/mL至约300ng/mL、约5ng/mL至约250ng/mL、约5ng/mL至约200ng/mL、约5ng/mL至约150ng/mL、约5ng/mL至约100ng/mL、约5ng/mL至约50ng/mL、约5ng/mL至约20ng/mL、约20ng/mL至约1μg/mL、约20ng/mL至约900ng/mL、约20ng/mL至约800ng/mL、约20ng/mL至约700ng/mL、约20ng/mL至约600ng/mL、约20ng/mL至约500ng/mL、约20ng/mL至约450ng/mL、约20ng/mL至约400ng/mL、约20ng/mL至约350ng/mL、约20ng/mL至约300ng/mL、约20ng/mL至约250ng/mL、约20ng/mL至约200ng/mL、约20ng/mL至约150ng/mL、约20ng/mL至约100ng/mL、约20ng/mL至约50ng/mL、约50ng/mL至约1μg/mL、约50ng/mL至约900ng/mL、约50ng/mL至约800ng/mL、约50ng/mL至约700ng/mL、约50ng/mL至约600ng/mL、约50ng/mL至约500ng/mL、约50ng/mL至约450ng/mL、约50ng/mL至约400ng/mL、约50ng/mL至约350ng/mL、约50ng/mL至约300ng/mL、约50ng/mL至约250ng/mL、约50ng/mL至约200ng/mL、约50ng/mL至约150ng/mL、约50ng/mL至约100ng/mL、约100ng/mL至约1μg/mL、约100ng/mL至约900ng/mL、约100ng/mL至约800ng/mL、约100ng/mL至约700ng/mL、约100ng/mL至约600ng/mL、约100ng/mL至约500ng/mL、约100ng/mL至约450ng/mL、约100ng/mL至约400ng/mL、约100ng/mL至约350ng/mL、约100ng/mL至约300ng/mL、约100ng/mL至约250ng/mL、约100ng/mL至约200ng/mL、约100ng/mL至约150ng/mL、约150ng/mL至约1μg/mL、约150ng/mL至约900ng/mL、约150ng/mL至约800ng/mL、约150ng/mL至约700ng/mL、约150ng/mL至约600ng/mL、约150ng/mL至约500ng/mL、约150ng/mL至约450ng/mL、约150ng/mL至约400ng/mL、约150ng/mL至约350ng/mL、约150ng/mL至约300ng/mL、约150ng/mL至约250ng/mL、约150ng/mL至约200ng/mL、约200ng/mL至约1μg/mL、约200ng/mL至约900ng/mL、约200ng/mL至约800ng/mL、约200ng/mL至约700ng/mL、约200ng/mL至约600ng/mL、约200ng/mL至约500ng/mL、约200ng/mL至约450ng/mL、约200ng/mL至约400ng/mL、约200ng/mL至约350ng/mL、约200ng/mL至约300ng/mL、约200ng/mL至约250ng/mL、约250ng/mL至约1μg/mL、约250ng/mL至约900ng/mL、约250ng/mL至约800ng/mL、约250ng/mL至约700ng/mL、约250ng/mL至约600ng/mL、约250ng/mL至约500ng/mL、约250ng/mL至约450ng/mL、约250ng/mL至约400ng/mL、约250ng/mL至约350ng/mL、约250ng/mL至约300ng/mL、约300ng/mL至约1μg/mL、约300ng/mL至约900ng/mL、约300ng/mL至约800ng/mL、约300ng/mL至约700ng/mL、约300ng/mL至约600ng/mL、约300ng/mL至约500ng/mL、约300ng/mL至约450ng/mL、约300ng/mL至约400ng/mL、约300ng/mL至约350ng/mL、约350ng/mL至约1μg/mL、约350ng/mL至约900ng/mL、约350ng/mL至约800ng/mL、约350ng/mL至约700ng/mL、约350ng/mL至约600ng/mL、约350ng/mL至约500ng/mL、约350ng/mL至约450ng/mL、约350ng/mL至约400ng/mL、约400ng/mL至约1μg/mL、约400ng/mL至约900ng/mL、约400ng/mL至约800ng/mL、约400ng/mL至约700ng/mL、约400ng/mL至约600ng/mL、约400ng/mL至约500ng/mL、约400ng/mL至约450ng/mL、约450ng/mL至约1μg/mL、约450ng/mL至约900ng/mL、约450ng/mL至约800ng/mL、约450ng/mL至约700ng/mL、约450ng/mL至约600ng/mL、约450ng/mL至约500ng/mL、约500ng/mL至约1μg/mL、约500ng/mL至约900ng/mL、约500ng/mL至约800ng/mL、约500ng/mL至约700ng/mL、约500ng/mL至约600ng/mL、约600ng/mL至约1μg/mL、约600ng/mL至约900ng/mL、约600ng/mL至约800ng/mL、约600ng/mL至约700ng/mL、约700ng/mL至约1μg/mL、约700ng/mL至约900ng/mL、约700ng/mL至约800ng/mL、约800ng/mL至约1μg/mL、约800ng/mL至约900ng/mL、约900ng/mL至约1μg/mL的SCF(例如，重组人SCF)。

在一些实施方案中，第三培养基包含约1ng/mL至约500ng/mL、约1ng/mL至约480ng/mL、约1ng/mL至约460ng/mL、约1ng/mL至约440ng/mL、约1ng/mL至约420ng/mL、约1ng/mL至约400ng/mL、约1ng/mL至约380ng/mL、约1ng/mL至约360ng/mL、约1ng/mL至约340ng/mL、约1ng/mL至约320ng/mL、约1ng/mL至约300ng/mL、约1ng/mL至约280ng/mL、约1ng/mL至约260ng/mL、约1ng/mL至约240ng/mL、约1ng/mL至约220ng/mL、约1ng/mL至约200ng/mL、约1ng/mL至约180ng/mL、约1ng/mL至约160ng/mL、约1ng/mL至约140ng/mL、约1ng/mL至约120ng/mL、约1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约80ng/mL、约1ng/mL至约60ng/mL、约1ng/mL至约40ng/mL、约1ng/mL至约30ng/mL、约1ng/mL至约25ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、5ng/mL至约500ng/mL、约5ng/mL至约480ng/mL、约5ng/mL至约460ng/mL、约5ng/mL至约440ng/mL、约5ng/mL至约420ng/mL、约5ng/mL至约400ng/mL、约5ng/mL至约380ng/mL、约5ng/mL至约360ng/mL、约5ng/mL至约340ng/mL、约5ng/mL至约320ng/mL、约5ng/mL至约300ng/mL、约5ng/mL至约280ng/mL、约5ng/mL至约260ng/mL、约5ng/mL至约240ng/mL、约5ng/mL至约220ng/mL、约5ng/mL至约200ng/mL、约5ng/mL至约180ng/mL、约5ng/mL至约160ng/mL、约5ng/mL至约140ng/mL、约5ng/mL至约120ng/mL、约5ng/mL至约100ng/mL、约5ng/mL至约80ng/mL、约5ng/mL至约60ng/mL、约5ng/mL至约40ng/mL、约5ng/mL至约30ng/mL、约5ng/mL至约25ng/mL、约5ng/mL至约20ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、10ng/mL至约500ng/mL、约10ng/mL至约480ng/mL、约10ng/mL至约460ng/mL、约10ng/mL至约440ng/mL、约10ng/mL至约420ng/mL、约10ng/mL至约400ng/mL、约10ng/mL至约380ng/mL、约10ng/mL至约360ng/mL、约10ng/mL至约340ng/mL、约10ng/mL至约320ng/mL、约10ng/mL至约300ng/mL、约10ng/mL至约280ng/mL、约10ng/mL至约260ng/mL、约10ng/mL至约240ng/mL、约10ng/mL至约220ng/mL、约10ng/mL至约200ng/mL、约10ng/mL至约180ng/mL、约10ng/mL至约160ng/mL、约10ng/mL至约140ng/mL、约10ng/mL至约120ng/mL、约10ng/mL至约100ng/mL、约10ng/mL至约80ng/mL、约10ng/mL至约60ng/mL、约10ng/mL至约40ng/mL、约10ng/mL至约30ng/mL、约10ng/mL至约25ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约10ng/mL至约15ng/mL、15ng/mL至约500ng/mL、约15ng/mL至约480ng/mL、约15ng/mL至约460ng/mL、约15ng/mL至约440ng/mL、约15ng/mL至约420ng/mL、约15ng/mL至约400ng/mL、约15ng/mL至约380ng/mL、约15ng/mL至约360ng/mL、约15ng/mL至约340ng/mL、约15ng/mL至约320ng/mL、约15ng/mL至约300ng/mL、约15ng/mL至约280ng/mL、约15ng/mL至约260ng/mL、约15ng/mL至约240ng/mL、约15ng/mL至约220ng/mL、约15ng/mL至约200ng/mL、约15ng/mL至约180ng/mL、约15ng/mL至约160ng/mL、约15ng/mL至约140ng/mL、约15ng/mL至约120ng/mL、约15ng/mL至约100ng/mL、约15ng/mL至约80ng/mL、约15ng/mL至约60ng/mL、约15ng/mL至约40ng/mL、约15ng/mL至约30ng/mL、约15ng/mL至约25ng/mL、约15ng/mL至约20ng/mL、20ng/mL至约500ng/mL、约20ng/mL至约480ng/mL、约20ng/mL至约460ng/mL、约20ng/mL至约440ng/mL、约20ng/mL至约420ng/mL、约20ng/mL至约400ng/mL、约20ng/mL至约380ng/mL、约20ng/mL至约360ng/mL、约20ng/mL至约340ng/mL、约20ng/mL至约320ng/mL、约20ng/mL至约300ng/mL、约20ng/mL至约280ng/mL、约20ng/mL至约260ng/mL、约20ng/mL至约240ng/mL、约20ng/mL至约220ng/mL、约20ng/mL至约200ng/mL、约20ng/mL至约180ng/mL、约20ng/mL至约160ng/mL、约20ng/mL至约140ng/mL、约20ng/mL至约120ng/mL、约20ng/mL至约100ng/mL、约20ng/mL至约80ng/mL、约20ng/mL至约60ng/mL、约20ng/mL至约40ng/mL、约20ng/mL至约30ng/mL、约20ng/mL至约25ng/mL、25ng/mL至约500ng/mL、约25ng/mL至约480ng/mL、约25ng/mL至约460ng/mL、约25ng/mL至约440ng/mL、约25ng/mL至约420ng/mL、约25ng/mL至约400ng/mL、约25ng/mL至约380ng/mL、约25ng/mL至约360ng/mL、约25ng/mL至约340ng/mL、约25ng/mL至约320ng/mL、约25ng/mL至约300ng/mL、约25ng/mL至约280ng/mL、约25ng/mL至约260ng/mL、约25ng/mL至约240ng/mL、约25ng/mL至约220ng/mL、约25ng/mL至约200ng/mL、约25ng/mL至约180ng/mL、约25ng/mL至约160ng/mL、约25ng/mL至约140ng/mL、约25ng/mL至约120ng/mL、约25ng/mL至约100ng/mL、约25ng/mL至约80ng/mL、约25ng/mL至约60ng/mL、约25ng/mL至约40ng/mL、约25ng/mL至约30ng/mL、30ng/mL至约500ng/mL、约30ng/mL至约480ng/mL、约30ng/mL至约460ng/mL、约30ng/mL至约440ng/mL、约30ng/mL至约420ng/mL、约30ng/mL至约400ng/mL、约30ng/mL至约380ng/mL、约30ng/mL至约360ng/mL、约30ng/mL至约340ng/mL、约30ng/mL至约320ng/mL、约30ng/mL至约300ng/mL、约30ng/mL至约280ng/mL、约30ng/mL至约260ng/mL、约30ng/mL至约240ng/mL、约30ng/mL至约220ng/mL、约30ng/mL至约200ng/mL、约30ng/mL至约180ng/mL、约30ng/mL至约160ng/mL、约30ng/mL至约140ng/mL、约30ng/mL至约120ng/mL、约30ng/mL至约100ng/mL、约30ng/mL至约80ng/mL、约30ng/mL至约60ng/mL、约30ng/mL至约40ng/mL、40ng/mL至约500ng/mL、约40ng/mL至约480ng/mL、约40ng/mL至约460ng/mL、约40ng/mL至约440ng/mL、约40ng/mL至约420ng/mL、约40ng/mL至约400ng/mL、约40ng/mL至约380ng/mL、约40ng/mL至约360ng/mL、约40ng/mL至约340ng/mL、约40ng/mL至约320ng/mL、约40ng/mL至约300ng/mL、约40ng/mL至约280ng/mL、约40ng/mL至约260ng/mL、约40ng/mL至约240ng/mL、约40ng/mL至约220ng/mL、约40ng/mL至约200ng/mL、约40ng/mL至约180ng/mL、约40ng/mL至约160ng/mL、约40ng/mL至约140ng/mL、约40ng/mL至约120ng/mL、约40ng/mL至约100ng/mL、约40ng/mL至约80ng/mL、约40ng/mL至约60ng/mL、60ng/mL至约500ng/mL、约60ng/mL至约480ng/mL、约60ng/mL至约460ng/mL、约60ng/mL至约440ng/mL、约60ng/mL至约420ng/mL、约60ng/mL至约400ng/mL、约60ng/mL至约380ng/mL、约60ng/mL至约360ng/mL、约60ng/mL至约340ng/mL、约60ng/mL至约320ng/mL、约60ng/mL至约300ng/mL、约60ng/mL至约280ng/mL、约60ng/mL至约260ng/mL、约60ng/mL至约240ng/mL、约60ng/mL至约220ng/mL、约60ng/mL至约200ng/mL、约60ng/mL至约180ng/mL、约60ng/mL至约160ng/mL、约60ng/mL至约140ng/mL、约60ng/mL至约120ng/mL、约60ng/mL至约100ng/mL、约60ng/mL至约80ng/mL、80ng/mL至约500ng/mL、约80ng/mL至约480ng/mL、约80ng/mL至约460ng/mL、约80ng/mL至约440ng/mL、约80ng/mL至约420ng/mL、约80ng/mL至约400ng/mL、约80ng/mL至约380ng/mL、约80ng/mL至约360ng/mL、约80ng/mL至约340ng/mL、约80ng/mL至约320ng/mL、约80ng/mL至约300ng/mL、约80ng/mL至约280ng/mL、约80ng/mL至约260ng/mL、约80ng/mL至约240ng/mL、约80ng/mL至约220ng/mL、约80ng/mL至约200ng/mL、约80ng/mL至约180ng/mL、约80ng/mL至约160ng/mL、约80ng/mL至约140ng/mL、约80ng/mL至约120ng/mL、约80ng/mL至约100ng/mL、100ng/mL至约500ng/mL、约100ng/mL至约480ng/mL、约100ng/mL至约460ng/mL、约100ng/mL至约440ng/mL、约100ng/mL至约420ng/mL、约100ng/mL至约400ng/mL、约100ng/mL至约380ng/mL、约100ng/mL至约360ng/mL、约100ng/mL至约340ng/mL、约100ng/mL至约320ng/mL、约100ng/mL至约300ng/mL、约100ng/mL至约280ng/mL、约100ng/mL至约260ng/mL、约100ng/mL至约240ng/mL、约100ng/mL至约220ng/mL、约100ng/mL至约200ng/mL、约100ng/mL至约180ng/mL、约100ng/mL至约160ng/mL、约100ng/mL至约140ng/mL、约100ng/mL至约120ng/mL、120ng/mL至约500ng/mL、约120ng/mL至约480ng/mL、约120ng/mL至约460ng/mL、约120ng/mL至约440ng/mL、约120ng/mL至约420ng/mL、约120ng/mL至约400ng/mL、约120ng/mL至约380ng/mL、约120ng/mL至约360ng/mL、约120ng/mL至约340ng/mL、约120ng/mL至约320ng/mL、约120ng/mL至约300ng/mL、约120ng/mL至约280ng/mL、约120ng/mL至约260ng/mL、约120ng/mL至约240ng/mL、约120ng/mL至约220ng/mL、约120ng/mL至约200ng/mL、约120ng/mL至约180ng/mL、约120ng/mL至约160ng/mL、约120ng/mL至约140ng/mL、140ng/mL至约500ng/mL、约140ng/mL至约480ng/mL、约140ng/mL至约460ng/mL、约140ng/mL至约440ng/mL、约140ng/mL至约420ng/mL、约140ng/mL至约400ng/mL、约140ng/mL至约380ng/mL、约140ng/mL至约360ng/mL、约140ng/mL至约340ng/mL、约140ng/mL至约320ng/mL、约140ng/mL至约300ng/mL、约140ng/mL至约280ng/mL、约140ng/mL至约260ng/mL、约140ng/mL至约240ng/mL、约140ng/mL至约220ng/mL、约140ng/mL至约200ng/mL、约140ng/mL至约180ng/mL、约140ng/mL至约160ng/mL、160ng/mL至约500ng/mL、约160ng/mL至约480ng/mL、约160ng/mL至约460ng/mL、约160ng/mL至约440ng/mL、约160ng/mL至约420ng/mL、约160ng/mL至约400ng/mL、约160ng/mL至约380ng/mL、约160ng/mL至约360ng/mL、约160ng/mL至约340ng/mL、约160ng/mL至约320ng/mL、约160ng/mL至约300ng/mL、约160ng/mL至约280ng/mL、约160ng/mL至约260ng/mL、约160ng/mL至约240ng/mL、约160ng/mL至约220ng/mL、约160ng/mL至约200ng/mL、约160ng/mL至约180ng/mL、180ng/mL至约500ng/mL、约180ng/mL至约480ng/mL、约180ng/mL至约460ng/mL、约180ng/mL至约440ng/mL、约180ng/mL至约420ng/mL、约180ng/mL至约400ng/mL、约180ng/mL至约380ng/mL、约180ng/mL至约360ng/mL、约180ng/mL至约340ng/mL、约180ng/mL至约320ng/mL、约180ng/mL至约300ng/mL、约180ng/mL至约280ng/mL、约180ng/mL至约260ng/mL、约180ng/mL至约240ng/mL、约180ng/mL至约220ng/mL、约180ng/mL至约200ng/mL、200ng/mL至约500ng/mL、约200ng/mL至约480ng/mL、约200ng/mL至约460ng/mL、约200ng/mL至约440ng/mL、约200ng/mL至约420ng/mL、约200ng/mL至约400ng/mL、约200ng/mL至约380ng/mL、约200ng/mL至约360ng/mL、约200ng/mL至约340ng/mL、约200ng/mL至约320ng/mL、约200ng/mL至约300ng/mL、约200ng/mL至约280ng/mL、约200ng/mL至约260ng/mL、约200ng/mL至约240ng/mL、约200ng/mL至约220ng/mL、220ng/mL至约500ng/mL、约220ng/mL至约480ng/mL、约220ng/mL至约460ng/mL、约220ng/mL至约440ng/mL、约220ng/mL至约420ng/mL、约220ng/mL至约300ng/mL、约220ng/mL至约380ng/mL、约220ng/mL至约360ng/mL、约220ng/mL至约340ng/mL、约220ng/mL至约320ng/mL、约220ng/mL至约400ng/mL、约220ng/mL至约280ng/mL、约220ng/mL至约260ng/mL、约220ng/mL至约240ng/mL、240ng/mL至约500ng/mL、约240ng/mL至约480ng/mL、约240ng/mL至约460ng/mL、约240ng/mL至约440ng/mL、约240ng/mL至约420ng/mL、约240ng/mL至约400ng/mL、约240ng/mL至约380ng/mL、约240ng/mL至约360ng/mL、约240ng/mL至约340ng/mL、约240ng/mL至约320ng/mL、约240ng/mL至约300ng/mL、约240ng/mL至约280ng/mL、约240ng/mL至约260ng/mL、260ng/mL至约500ng/mL、约260ng/mL至约480ng/mL、约260ng/mL至约460ng/mL、约260ng/mL至约440ng/mL、约260ng/mL至约420ng/mL、约260ng/mL至约400ng/mL、约260ng/mL至约380ng/mL、约260ng/mL至约360ng/mL、约260ng/mL至约340ng/mL、约260ng/mL至约320ng/mL、约260ng/mL至约300ng/mL、约260ng/mL至约280ng/mL、280ng/mL至约500ng/mL、约280ng/mL至约480ng/mL、约280ng/mL至约460ng/mL、约280ng/mL至约440ng/mL、约280ng/mL至约420ng/mL、约280ng/mL至约400ng/mL、约280ng/mL至约380ng/mL、约280ng/mL至约360ng/mL、约280ng/mL至约340ng/mL、约280ng/mL至约320ng/mL、约280ng/mL至约300ng/mL、300ng/mL至约500ng/mL、约300ng/mL至约480ng/mL、约300ng/mL至约460ng/mL、约300ng/mL至约440ng/mL、约300ng/mL至约420ng/mL、约300ng/mL至约400ng/mL、约300ng/mL至约380ng/mL、约300ng/mL至约360ng/mL、约300ng/mL至约340ng/mL、约300ng/mL至约320ng/mL、320ng/mL至约500ng/mL、约320ng/mL至约480ng/mL、约320ng/mL至约460ng/mL、约320ng/mL至约440ng/mL、约320ng/mL至约420ng/mL、约320ng/mL至约400ng/mL、约320ng/mL至约380ng/mL、约320ng/mL至约360ng/mL、约320ng/mL至约340ng/mL、340ng/mL至约500ng/mL、约340ng/mL至约480ng/mL、约340ng/mL至约460ng/mL、约340ng/mL至约440ng/mL、约340ng/mL至约420ng/mL、约340ng/mL至约400ng/mL、约340ng/mL至约380ng/mL、约340ng/mL至约360ng/mL、360ng/mL至约500ng/mL、约360ng/mL至约480ng/mL、约360ng/mL至约460ng/mL、约360ng/mL至约440ng/mL、约360ng/mL至约420ng/mL、约360ng/mL至约400ng/mL、约360ng/mL至约380ng/mL、380ng/mL至约500ng/mL、约380ng/mL至约480ng/mL、约380ng/mL至约460ng/mL、约380ng/mL至约440ng/mL、约380ng/mL至约420ng/mL、约380ng/mL至约400ng/mL、400ng/mL至约500ng/mL、约400ng/mL至约480ng/mL、约400ng/mL至约460ng/mL、约400ng/mL至约440ng/mL、约400ng/mL至约420ng/mL、420ng/mL至约500ng/mL、约420ng/mL至约480ng/mL、约420ng/mL至约460ng/mL、约420ng/mL至约440ng/mL、440ng/mL至约500ng/mL、约440ng/mL至约480ng/mL、约440ng/mL至约460ng/mL、约460ng/mL至约500ng/mL、约460ng/mL至约480ng/mL、或约480ng/mL至约500ng/mL的EPO(例如，重组人EPO)或EPO-模拟肽。本文描述了EPO-模拟肽的非限制性实例。EPO-模拟肽的其他实例是本领域已知的。

在一些实施方案中，第三培养基包含约0.1μg/mL至约50μg/mL、约0.1μg/mL至约45μg/mL、约0.1μg/mL至约40μg/mL、约0.1μg/mL至约35μg/mL、约0.1μg/mL至约30μg/mL、约0.1μg/mL至约25μg/mL、约0.1μg/mL至约20μg/mL、约0.1μg/mL约15μg/mL、约0.1μg/mL至约10μg/mL、约0.1μg/mL至约5μg/mL、约0.1μg/mL至约2μg/mL、约0.1μg/mL至约1μg/mL、约1μg/mL至约50μg/mL、约1μg/mL至约45μg/mL、约1μg/mL至约40μg/mL、约1μg/mL至约35μg/mL、约1μg/mL至约30μg/mL、约1μg/mL至约25μg/mL、约1μg/mL至约20μg/mL、约1μg/mL约15μg/mL、约1μg/mL至约10μg/mL、约1μg/mL至约5μg/mL、约1μg/mL至约2μg/mL、约2μg/mL至约50μg/mL、约2μg/mL至约45μg/mL、约2μg/mL至约40μg/mL、约2μg/mL至约35μg/mL、约2μg/mL至约30μg/mL、约2μg/mL至约25μg/mL、约2μg/mL至约20μg/mL、约2μg/mL约15μg/mL、约2μg/mL至约10μg/mL、约2μg/mL至约5μg/mL、约5μg/mL至约50μg/mL、约5μg/mL至约45μg/mL、约5μg/mL至约40μg/mL、约5μg/mL至约35μg/mL、约5μg/mL至约30μg/mL、约5μg/mL至约25μg/mL、约5μg/mL至约20μg/mL、约5μg/mL约15μg/mL、约5μg/mL至约10μg/mL、约10μg/mL至约50μg/mL、约10μg/mL至约45μg/mL、约10μg/mL至约40μg/mL、约10μg/mL至约35μg/mL、约10μg/mL至约30μg/mL、约10μg/mL至约25μg/mL、约10μg/mL至约20μg/mL、约10μg/mL约15μg/mL、约15μg/mL至约50μg/mL、约15μg/mL至约45μg/mL、约15μg/mL至约40μg/mL、约15μg/mL至约35μg/mL、约15μg/mL至约30μg/mL、约15μg/mL至约25μg/mL、约15μg/mL至约20μg/mL、约20μg/mL至约50μg/mL、约20μg/mL至约45μg/mL、约20μg/mL至约40μg/mL、约20μg/mL至约35μg/mL、约20μg/mL至约30μg/mL、约20μg/mL至约25μg/mL、约25μg/mL至约50μg/mL、约25μg/mL至约45μg/mL、约25μg/mL至约40μg/mL、约25μg/mL至约35μg/mL、约25μg/mL至约30μg/mL、约30μg/mL至约50μg/mL、约30μg/mL至约45μg/mL、约30μg/mL至约40μg/mL、约30μg/mL至约35μg/mL、约35μg/mL至约50μg/mL、约35μg/mL至约45μg/mL、约35μg/mL至约40μg/mL、约40μg/mL至约50μg/mL、约40μg/mL至约45μg/mL、或约45μg/mL至约50μg/mL的胰岛素(例如，人胰岛素)。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基可进一步包含0.01g/L至约80g/L(例如，约0.01g/L至约75g/L、约0.01g/L至约70g/L、约0.01g/L至约65g/L、约0.01g/L至约60g/L、约0.01g/L至约55g/L、约0.01g/L至约50g/L、约0.01g/L至约45g/L、约0.01g/L至约40g/L、约0.01g/L至约35g/L、约0.01g/L至约30g/L、约0.01g/L至约25g/L、约0.01g/L至约20g/L、约0.01g/L至约18g/L、约0.01g/L至约16g/L、约0.01g/L至约14g/L、约0.01g/L至约12g/L、约0.01g/L至约10g/L、约0.01g/L至约9.5g/L、约0.01g/L至约9.0g/L、约0.01g/L至约8.5g/L、约0.01g/L至约8.0g/L、约0.01g/L至约7.5g/L、约0.01g/L至约7.0g/L、约0.01g/L至约6.5g/L、约0.01g/L至约6.0g/L、约0.01g/L至约5.5g/L、约0.01g/L至约5.0g/L、约0.01g/L至约4.5g/L、约0.01g/L至约4.0g/L、约0.01g/L至约3.5g/L、约0.01g/L至约3.0g/L、约0.01g/L至约2.5g/L、约0.01g/L至约2.0g/L、约0.01g/L至约1.5g/L、约0.01g/L至约1.0g/L、约0.01g/L至约0.5g/L、约0.01g/L至约0.1g/L、约0.01g/L至约0.05g/L、约0.05g/L至约80g/L、约0.05g/L至约75g/L、约0.05g/L至约70g/L、约0.05g/L至约65g/L、约0.05g/L至约60g/L、约0.05g/L至约55g/L、约0.05g/L至约50g/L、约0.05g/L至约45g/L、约0.05g/L至约40g/L、约0.05g/L至约35g/L、约0.05g/L至约30g/L、约0.05g/L至约25g/L、约0.05g/L至约20g/L、约0.05g/L至约18g/L、约0.05g/L至约16g/L、约0.05g/L至约14g/L、约0.05g/L至约12g/L、约0.05g/L至约10g/L、约0.05g/L至约9.5g/L、约0.05g/L至约9.0g/L、约0.05g/L至约8.5g/L、约0.05g/L至约8.0g/L、约0.05g/L至约7.5g/L、约0.05g/L至约7.0g/L、约0.05g/L至约6.5g/L、约0.05g/L至约6.0g/L、约0.05g/L至约5.5g/L、约0.05g/L至约5.0g/L、约0.05g/L至约4.5g/L、约0.05g/L至约4.0g/L、约0.05g/L至约3.5g/L、约0.05g/L至约3.0g/L、约0.05g/L至约2.5g/L、约0.05g/L至约2.0g/L、约0.05g/L至约1.5g/L、约0.05g/L至约1.0g/L、约0.05g/L至约0.5g/L、约0.05g/L至约0.1g/L、约0.1g/L至约80g/L、约0.1g/L至约75g/L、约0.1g/L至约70g/L、约0.1g/L至约65g/L、约0.1g/L至约60g/L、约0.1g/L至约55g/L、约0.1g/L至约50g/L、约0.1g/L至约45g/L、约0.1g/L至约40g/L、约0.1g/L至约35g/L、约0.1g/L至约30g/L、约0.1g/L至约25g/L、约0.1g/L至约20g/L、约0.1g/L至约18g/L、约0.1g/L至约16g/L、约0.1g/L至约14g/L、约0.1g/L至约12g/L、约0.1g/L至约10g/L、约0.1g/L至约9.5g/L、约0.1g/L至约9.0g/L、约0.1g/L至约8.5g/L、约0.1g/L至约8.0g/L、约0.1g/L至约7.5g/L、约0.1g/L至约7.0g/L、约0.1g/L至约6.5g/L、约0.1g/L至约6.0g/L、约0.1g/L至约5.5g/L、约0.1g/L至约5.0g/L、约0.1g/L至约4.5g/L、约0.1g/L至约4.0g/L、约0.1g/L至约3.5g/L、约0.1g/L至约3.0g/L、约0.1g/L至约2.5g/L、约0.1g/L至约2.0g/L、约0.1g/L至约1.5g/L、约0.1g/L至约1.0g/L、约0.1g/L至约0.5g/L、约0.5g/L至约80g/L、约0.5g/L至约75g/L、约0.5g/L至约70g/L、约0.5g/L至约65g/L、约0.5g/L至约60g/L、约0.5g/L至约55g/L、约0.5g/L至约50g/L、约0.5g/L至约45g/L、约0.5g/L至约40g/L、约0.5g/L至约35g/L、约0.5g/L至约30g/L、约0.5g/L至约25g/L、约0.5g/L至约20g/L、约0.5g/L至约18g/L、约0.5g/L至约16g/L、约0.5g/L至约14g/L、约0.5g/L至约12g/L、约0.5g/L至约10g/L、约0.5g/L至约9.5g/L、约0.5g/L至约9.0g/L、约0.5g/L至约8.5g/L、约0.5g/L至约8.0g/L、约0.5g/L至约7.5g/L、约0.5g/L至约7.0g/L、约0.5g/L至约6.5g/L、约0.5g/L至约6.0g/L、约0.5g/L至约5.5g/L、约0.5g/L至约5.0g/L、约0.5g/L至约4.5g/L、约0.5g/L至约4.0g/L、约0.5g/L至约3.5g/L、约0.5g/L至约3.0g/L、约0.5g/L至约2.5g/L、约0.5g/L至约2.0g/L、约0.5g/L至约1.5g/L、约0.5g/L至约1.0g/L、约1.0g/L至约80g/L、约1.0g/L至约75g/L、约1.0g/L至约70g/L、约1.0g/L至约65g/L、约1.0g/L至约60g/L、约1.0g/L至约55g/L、约1.0g/L至约50g/L、约1.0g/L至约45g/L、约1.0g/L至约40g/L、约1.0g/L至约35g/L、约1.0g/L至约30g/L、约1.0g/L至约25g/L、约1.0g/L至约20g/L、约1.0g/L至约18g/L、约1.0g/L至约16g/L、约1.0g/L至约14g/L、约1.0g/L至约12g/L、约1.0g/L至约10g/L、约1.0g/L至约9.5g/L、约1.0g/L至约9.0g/L、约1.0g/L至约8.5g/L、约1.0g/L至约8.0g/L、约1.0g/L至约7.5g/L、约1.0g/L至约7.0g/L、约1.0g/L至约6.5g/L、约1.0g/L至约6.0g/L、约1.0g/L至约5.5g/L、约1.0g/L至约5.0g/L、约1.0g/L至约4.5g/L、约1.0g/L至约4.0g/L、约1.0g/L至约3.5g/L、约1.0g/L至约3.0g/L、约1.0g/L至约2.5g/L、约1.0g/L至约2.0g/L、约1.0g/L至约1.5g/L、约1.5g/L至约80g/L、约1.5g/L至约75g/L、约1.5g/L至约70g/L、约1.5g/L至约65g/L、约1.5g/L至约60g/L、约1.5g/L至约55g/L、约1.5g/L至约50g/L、约1.5g/L至约45g/L、约1.5g/L至约40g/L、约1.5g/L至约35g/L、约1.5g/L至约30g/L、约1.5g/L至约25g/L、约1.5g/L至约20g/L、约1.5g/L至约18g/L、约1.5g/L至约16g/L、约1.5g/L至约14g/L、约1.5g/L至约12g/L、约1.5g/L至约10g/L、约1.5g/L至约9.5g/L、约1.5g/L至约9.0g/L、约1.5g/L至约8.5g/L、约1.5g/L至约8.0g/L、约1.5g/L至约7.5g/L、约1.5g/L至约7.0g/L、约1.5g/L至约6.5g/L、约1.5g/L至约6.0g/L、约1.5g/L至约5.5g/L、约1.5g/L至约5.0g/L、约1.5g/L至约4.5g/L、约1.5g/L至约4.0g/L、约1.5g/L至约3.5g/L、约1.5g/L至约3.0g/L、约1.5g/L至约2.5g/L、约1.5g/L至约2.0g/L、约2.0g/L至约80g/L、约2.0g/L至约75g/L、约2.0g/L至约70g/L、约2.0g/L至约65g/L、约2.0g/L至约60g/L、约2.0g/L至约55g/L、约2.0g/L至约50g/L、约2.0g/L至约45g/L、约2.0g/L至约40g/L、约2.0g/L至约35g/L、约2.0g/L至约30g/L、约2.0g/L至约25g/L、约2.0g/L至约20g/L、约2.0g/L至约18g/L、约2.0g/L至约16g/L、约2.0g/L至约14g/L、约2.0g/L至约12g/L、约2.0g/L至约10g/L、约2.0g/L至约9.5g/L、约2.0g/L至约9.0g/L、约2.0g/L至约8.5g/L、约2.0g/L至约8.0g/L、约2.0g/L至约7.5g/L、约2.0g/L至约7.0g/L、约2.0g/L至约6.5g/L、约2.0g/L至约6.0g/L、约2.0g/L至约5.5g/L、约2.0g/L至约5.0g/L、约2.0g/L至约4.5g/L、约2.0g/L至约4.0g/L、约2.0g/L至约3.5g/L、约2.0g/L至约3.0g/L、约2.0g/L至约2.5g/L、约2.5g/L至约80g/L、约2.5g/L至约75g/L、约2.5g/L至约70g/L、约2.5g/L至约65g/L、约2.5g/L至约60g/L、约2.5g/L至约55g/L、约2.5g/L至约50g/L、约2.5g/L至约45g/L、约2.5g/L至约40g/L、约2.5g/L至约35g/L、约2.5g/L至约30g/L、约2.5g/L至约25g/L、约2.5g/L至约20g/L、约2.5g/L至约18g/L、约2.5g/L至约16g/L、约2.5g/L至约14g/L、约2.5g/L至约12g/L、约2.5g/L至约10g/L、约2.5g/L至约9.5g/L、约2.5g/L至约9.0g/L、约2.5g/L至约8.5g/L、约2.5g/L至约8.0g/L、约2.5g/L至约7.5g/L、约2.5g/L至约7.0g/L、约2.5g/L至约6.5g/L、约2.5g/L至约6.0g/L、约2.5g/L至约5.5g/L、约2.5g/L至约5.0g/L、约2.5g/L至约4.5g/L、约2.5g/L至约4.0g/L、约2.5g/L至约3.5g/L、约2.5g/L至约3.0g/L、约3.0g/L至约80g/L、约3.0g/L至约75g/L、约3.0g/L至约70g/L、约3.0g/L至约65g/L、约3.0g/L至约60g/L、约3.0g/L至约55g/L、约3.0g/L至约50g/L、约3.0g/L至约45g/L、约3.0g/L至约40g/L、约3.0g/L至约35g/L、约3.0g/L至约30g/L、约3.0g/L至约25g/L、约3.0g/L至约20g/L、约3.0g/L至约18g/L、约3.0g/L至约16g/L、约3.0g/L至约14g/L、约3.0g/L至约12g/L、约3.0g/L至约10g/L、约3.0g/L至约9.5g/L、约3.0g/L至约9.0g/L、约3.0g/L至约8.5g/L、约3.0g/L至约8.0g/L、约3.0g/L至约7.5g/L、约3.0g/L至约7.0g/L、约3.0g/L至约6.5g/L、约3.0g/L至约6.0g/L、约3.0g/L至约5.5g/L、约3.0g/L至约5.0g/L、约3.0g/L至约4.5g/L、约3.0g/L至约4.0g/L、约3.0g/L至约3.5g/L、约3.5g/L至约80g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在一些实施方案中，第三培养基可以是例如化学成分确定的液体培养基、无动物组分的液体培养基、或化学成分确定的无动物组分的液体培养基、和/或无血清液体培养基。

培养步骤D

灌注培养

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(d)包括灌注培养第三细胞培养物(例如，在本文所述的任何示例性生物反应器(例如，灌注生物反应器)中具有本文所述的任何示例性体积的本文所述的任何第三细胞培养物)约5天至约20天(例如，约5天至约19天、约5天至约18天、约5天至约17天、约5天至约16天、约5天至约15天、约5天至约14天、约5天至约13天、约5天至约12天、约5天至约11天、约5天至约10天、约5天至约9天、约5天至约8天、约5天至约7天、约5天至约6天、约6天至约20天、约6天至约19天、约6天至约18天、约6天至约17天、约6天至约16天、约6天至约15天、约6天至约14天、约6天至约13天、约6天至约12天、约6天至约11天、约6天至约10天、约6天至约9天、约6天至约8天、约6天至约7天、约7天至约20天、约7天至约19天、约7天至约18天、约7天至约17天、约7天至约16天、约7天至约15天、约7天至约14天、约7天至约13天、约7天至约12天、约7天至约11天、约7天至约10天、约7天至约9天、约7天至约8天、约8天至约20天、约8天至约19天、约8天至约18天、约8天至约17天、约8天至约16天、约8天至约15天、约8天至约14天、约8天至约13天、约8天至约12天、约8天至约11天、约8天至约10天、约8天至约9天、约9天至约20天、约9天至约19天、约9天至约18天、约9天至约17天、约9天至约16天、约9天至约15天、约9天至约14天、约9天至约13天、约9天至约12天、约9天至约11天、约9天至约10天、约10天至约20天、约10天至约19天、约10天至约18天、约10天至约17天、约10天至约16天、约10天至约15天、约10天至约14天、约10天至约13天、约10天至约12天、约10天至约11天、约11天至约20天、约11天至约19天、约11天至约18天、约11天至约17天、约11天至约16天、约11天至约15天、约11天至约14天、约11天至约13天、约11天至约12天、约12天至约20天、约12天至约19天、约12天至约18天、约12天至约17天、约12天至约16天、约12天至约15天、约12天至约14天、约12天至约13天、约13天至约20天、约13天至约19天、约13天至约18天、约13天至约17天、约13天至约16天、约13天至约15天、约13天至约14天、约14天至约20天、约14天至约19天、约14天至约18天、约14天至约17天、约14天至约16天、约14天至约15天、约15天至约20天、约15天至约19天、约15天至约18天、约15天至约17天、约15天至约16天、约16天至约20天、约16天至约19天、约16天至约18天、约16天至约17天、约17天至约20天、约17天至约19天、约17天至约18天、约18天至约20天、约18天至约19天、或约19天至约20天)，其中在步骤(d)之后，第三培养基包含去核红系细胞群体(例如，本文所述的任何示例性去核红系细胞)。在一些实施方案中，步骤(d)包括以约10W/m

在一些实施方案中，步骤(d)中的灌注培养可使用以下灌注率进行：约0.04nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约4nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约2nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约1nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约0.5nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约0.1nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约4nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约2nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约1nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约0.5nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约4nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约2nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约1nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约4nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约2nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约4nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约35nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约35nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约35nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约35nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约35nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约40nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约40nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约40nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约40nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约45nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约45nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约45nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约50nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约50nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、或约55nL/细胞/天至约60nL/细胞/天。在一些实施方案中，灌注速率随时间推移增加。

在一些实施方案中，步骤(d)中的灌注培养可使用约0.1VVD至约3VVD(或本文所述的该范围的任何子范围)的灌注速率进行。

在一些实施方案中，步骤(d)中的灌注培养包括：(i)在第一时间段内向第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)中添加额外体积的第三培养基(例如，本文所述的任何示例性第三培养基)；以及(ii)在第二时间段内向第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)中添加额外体积的第四培养基(例如，本文所述的任何示例性第四培养基)。

在一些实施方案中，在第一时间段内向第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)中连续地添加(i)中的额外体积的第三培养基(例如，本文所述的任何示例性第三培养基)；和/或在第二时间段内向第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)中连续地添加(ii)中的额外体积的第四培养基(例如，本文所述的任何示例性第四培养基)。

在一些实施方案中，在第一时间段内向第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)中周期性地(例如，每三天一次、每两天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每天五次、每天六次、每天七次、每天八次、每天九次、每天十次、每天十一次或每天十二次)添加(i)中的额外体积的第三培养基(例如，本文所述的任何示例性第三培养基)；和/或(ii)在第二时间段向内第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)中周期性地(例如，每三天一次、每两天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每天五次、每天六次、每天七次、每天八次、每天九次、每天十次、每天十一次或每天十二次)添加(ii)中的额外体积的第四培养基(例如，本文所述的任何示例性第四培养基)。

培养基(例如，本文所述的任何示例性第三或第四培养基)的添加可以机械地进行，例如使用蠕动泵，或手动地(例如，通过无菌移液)进行。

培养基(例如，基本上不含细胞的培养基)的去除可以机械地进行，例如，使用切向流过滤(TFF)或交替流过滤(ATF)，或手动地(例如，通过无菌移液)进行。本文描述了切向流过滤的另外的非限制性方面。

在一些实施方案中，(i)中的第一时间段为约1天至约12天、约1天至约11天、约1天至约10天、约1天至约9天、约1天至约8天、约1天至约7天、约1天至约6天、约1天至约5天、约1天至约4天、约1天至约3天、约1天至约2天、约2天至约12天、约2天至约11天、约2天至约10天、约2天至约9天、约2天至约8天、约2天至约7天、约2天至约6天、约2天至约5天、约2天至约4天、约2天至约3天、约3天至约12天、约3天至约11天、约3天至约10天、约3天至约9天、约3天至约8天、约3天至约7天、约3天至约6天、约3天至约5天、约3天至约4天、约4天至约12天、约4天至约11天、约4天至约10天、约4天至约9天、约4天至约8天、约4天至约7天、约4天至约6天、约4天至约5天、约5天至约12天、约5天至约11天、约5天至约10天、约5天至约9天、约5天至约8天、约5天至约7天、约5天至约6天、约6天至约12天、约6天至约11天、约6天至约10天、约6天至约9天、约6天至约8天、约6天至约7天、约7天至约12天、约7天至约11天、约7天至约10天、约7天至约9天、约7天至约8天、约8天至约12天、约8天至约11天、约8天至约10天、约8天至约9天、约9天至约12天、约9天至约11天、约9天至约10天、约10天至约12天、约10天至约11天、或约11天至约12天。

在一些实施方案中，(ii)中的第二时间段为约1天至约12天、约1天至约11天、约1天至约10天、约1天至约9天、约1天至约8天、约1天至约7天、约1天至约6天、约1天至约5天、约1天至约4天、约1天至约3天、约1天至约2天、约2天至约12天、约2天至约11天、约2天至约10天、约2天至约9天、约2天至约8天、约2天至约7天、约2天至约6天、约2天至约5天、约2天至约4天、约2天至约3天、约3天至约12天、约3天至约11天、约3天至约10天、约3天至约9天、约3天至约8天、约3天至约7天、约3天至约6天、约3天至约5天、约3天至约4天、约4天至约12天、约4天至约11天、约4天至约10天、约4天至约9天、约4天至约8天、约4天至约7天、约4天至约6天、约4天至约5天、约5天至约12天、约5天至约11天、约5天至约10天、约5天至约9天、约5天至约8天、约5天至约7天、约5天至约6天、约6天至约12天、约6天至约11天、约6天至约10天、约6天至约9天、约6天至约8天、约6天至约7天、约7天至约12天、约7天至约11天、约7天至约10天、约7天至约9天、约7天至约8天、约8天至约12天、约8天至约11天、约8天至约10天、约8天至约9天、约9天至约12天、约9天至约11天、约9天至约10天、约10天至约12天、约10天至约11天、或约11天至约12天。

在这些方法的一些实施方案中，第四培养基包含约0.01g/L至约70g/L(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)或约80μM至约560mM(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)牛磺酸(或牛磺酸前体(例如，L-半胱氨酸、L-半胱氨酸盐、半胱胺或半胱氨酸亚磺酸)或牛磺酸分解产物(例如，5-谷氨酰-牛磺酸、牛磺胆酸盐和脒基牛磺酸)和/或0.01g/L至约70g/L(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)或约90μM至约640mM(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)亚牛磺酸(或其亚牛磺酸前体(例如，L-半胱氨酸、L-半胱氨酸盐、s-羧甲基半胱氨酸、半胱胺或半胱氨酸亚磺酸)或亚牛磺酸分解产物(例如，5-谷氨酰-牛磺酸、牛磺胆酸盐和脒基牛磺酸)，以及任选的下列中的一种或多种(例如，一种、两种或三种)：运铁蛋白(例如，脱铁运铁蛋白、全铁运铁蛋白或它们的组合)(例如，约100μg/mL至约2mg/mL运铁蛋白(例如，人脱铁运铁蛋白、人全铁运铁蛋白或它们的组合)或本文所述的该范围的任何子范围)、促红细胞生成素(EPO)或EPO-模拟肽(例如，约1ng/mL至约500ng/mL的EPO(例如，重组人EPO)或EPO-模拟肽或本文所述的该范围的任何子范围，以及胰岛素(例如，约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素或本文所述的该范围的任何子范围)。

在本文所述的任何第四培养基的一些实施方案中，第四培养基包含伊思柯夫改良杜氏培养基(IMDM)。在本文所述的任何第四种培养基的一些实施方案中，第四培养基包含约0.1％v/v至约10％v/v(例如，约0.1％v/v至约9.5％v/v、约0.1％v/v至约9.0％v/v、约0.1％v/v至约8.5％v/v、约0.1％v/v至约8.0％v/v、约0.1％v/v至约7.5％v/v、约0.1％v/v至约7.0％v/v、约0.1％v/v至约6.5％v/v、约0.1％v/v至约6.0％v/v、约0.1％v/v至约5.5％v/v、约0.1％v/v至约5.0％v/v、约0.1％v/v至约4.5％v/v、约0.1％v/v至约4.0％v/v、约0.1％v/v至约3.5％v/v、约0.1％v/v至约3.0％v/v、约0.1％v/v至约2.5％v/v、约0.1％v/v至约2.0％v/v、约0.1％v/v至约1.5％v/v、约0.1％v/v至约1.0％v/v、约0.5％v/v至约1.0％v/v、约0.5％v/v至约10％v/v、约0.5％v/v至约9.5％v/v、约0.5％v/v至约9.0％v/v、约0.5％v/v至约8.5％v/v、约0.5％v/v至约8.0％v/v、约0.5％v/v至约7.5％v/v、约0.5％v/v至约7.0％v/v、约0.5％v/v至约6.5％v/v、约0.5％v/v至约6.0％v/v、约0.5％v/v至约5.5％v/v、约0.5％v/v至约5％v/v、约0.5％v/v至约4.5％v/v、约0.5％v/v至约4.0％v/v、约0.5％v/v至约3.5％v/v、约0.5％v/v至约3.0％v/v、约0.5％v/v至约2.5％v/v、约0.5％v/v至约2.0％v/v、约0.5％v/v至约1.5％v/v、约0.5％v/v至约1.0％v/v、约1.0％v/v至约10％v/v、约1.0％v/v至约9.5％v/v、约1.0％v/v至约9.0％v/v、约1.0％v/v至约8.5％v/v、约1.0％v/v至约8.0％v/v、约1.0％v/v至约7.5％v/v、约1.0％v/v至约7.0％v/v、约1.0％v/v至约6.5％v/v、约1.0％v/v至约6.0％v/v、约1.0％v/v至约5.5％v/v、约1.0％v/v至约5％v/v、约1.0％v/v至约4.5％v/v、约1.0％v/v至约4.0％v/v、约1.0％v/v至约3.5％v/v、约1.0％v/v至约3.0％v/v、约1.0％v/v至约2.5％v/v、约1.0％v/v至约2.0％v/v、约1.0％v/v至约1.5％v/v、约1.5％v/v至约10％v/v、约1.5％v/v至约9.5％v/v、约1.5％v/v至约9.0％v/v、约1.5％v/v至约8.5％v/v、约1.5％v/v至约8.0％v/v、约1.5％v/v至约7.5％v/v、约1.5％v/v至约7.0％v/v、约1.5％v/v至约6.5％v/v、约1.5％v/v至约6.0％v/v、约1.5％v/v至约5.5％v/v、约1.5％v/v至约5％v/v、约1.5％v/v至约4.5％v/v、约1.5％v/v至约4.0％v/v、约1.5％v/v至约3.5％v/v、约1.5％v/v至约3.0％v/v、约1.5％v/v至约2.5％v/v、约1.5％v/v至约2.0％v/v、约2.0％v/v至约10％v/v、约2.0％v/v至约9.5％v/v、约2.0％v/v至约9.0％v/v、约2.0％v/v至约8.5％v/v、约2.0％v/v至约8.000％v/v、约2.0％v/v至约7.5％v/v、约2.0％v/v至约7.0％v/v、约2.0％v/v至约6.5％v/v、约2.0％v/v至约6.0％v/v、约2.0％v/v至约5.5％v/v、约2.0％v/v至约5％v/v、约2.0％v/v至约4.5％v/v、约2.0％v/v至约4.0％v/v、约2.0％v/v至约3.5％v/v、约2.0％v/v至约3.0％v/v、约2.0％v/v至约2.5％v/v、约2.5％v/v至约10％v/v、约2.5％v/v至约9.5％v/v、约2.5％v/v至约9.0％v/v、约2.5％v/v至约8.5％v/v、约2.5％v/v至约8.0％v/v、约2.5％v/v至约7.5％v/v、约2.5％v/v至约7.0％v/v、约2.5％v/v至约6.5％v/v、约2.5％v/v至约6.0％v/v、约2.5％v/v至约5.5％v/v、约2.5％v/v至约5％v/v、约2.5％v/v至约4.5％v/v、约2.5％v/v至约4.0％v/v、约2.5％v/v至约3.5％v/v、约2.5％v/v至约3.0％v/v、约3.0％v/v至约10％v/v、约3.0％v/v至约9.5％v/v、约3.0％v/v至约9.0％v/v、约3.0％v/v至约8.5％v/v、约3.0％v/v至约8.0％v/v、约3.0％v/v至约7.5％v/v、约3.0％v/v至约7.0％v/v、约3.0％v/v至约6.5％v/v、约3.0％v/v至约6.0％v/v、约3.0％v/v至约5.5％v/v、约3.0％v/v至约5％v/v、约3.0％v/v至约4.5％v/v、约3.0％v/v至约4.0％v/v、约3.0％v/v至约3.5％v/v、约3.5％v/v至约10％v/v、约3.5％v/v至约9.5％v/v、约3.5％v/v至约9.0％v/v、约3.5％v/v至约8.5％v/v、约3.5％v/v至约8.0％v/v、约3.5％v/v至约7.5％v/v、约3.5％v/v至约7.0％v/v、约3.5％v/v至约6.5％v/v、约3.5％v/v至约6.0％v/v、约3.5％v/v至约5.5％v/v、约3.5％v/v至约5％v/v、约3.5％v/v至约4.5％v/v、约3.5％v/v至约4.0％v/v、约4.0％v/v至约10％v/v、约4.0％v/v至约9.5％v/v、约4.0％v/v至约9.0％v/v、约4.0％v/v至约8.5％v/v、约4.0％v/v至约8.0％v/v、约4.0％v/v至约7.5％v/v、约4.0％v/v至约7.0％v/v、约4.0％v/v至约6.5％v/v、约4.0％v/v至约6.0％v/v、约4.0％v/v至约5.5％v/v、约4.0％v/v至约5％v/v、约4.0％v/v至约4.5％v/v、约4.5％v/v至约10％v/v、约4.5％v/v至约9.5％v/v、约4.5％v/v至约9.0％v/v、约4.5％v/v至约8.5％v/v、约4.5％v/v至约8.0％v/v、约4.5％v/v至约7.5％v/v、约4.5％v/v至约7.0％v/v、约4.5％v/v至约6.5％v/v、约4.5％v/v至约6.0％v/v、约4.5％v/v至约5.5％v/v、约4.5％v/v至约5.0％v/v、约5.0％v/v至约10％v/v、约5.0％v/v至约9.5％v/v、约5.0％v/v至约9.0％v/v、约5.0％v/v至约8.5％v/v、约5.0％v/v至约8.0％v/v、约5.0％v/v至约7.5％v/v、约5.0％v/v至约7.0％v/v、约5.0％v/v至约6.5％v/v、约5.0％v/v至约6.0％v/v、约5.0％v/v至约5.5％v/v、约5.5％v/v至约10％v/v、约5.5％v/v至约9.5％v/v、约5.5％v/v至约9.0％v/v、约5.5％v/v至约8.5％v/v、约5.5％v/v至约8.0％v/v、约5.5％v/v至约7.5％v/v、约5.5％v/v至约7.0％v/v、约5.5％v/v至约6.5％v/v、约5.5％v/v至约6.0％v/v、约6.0％v/v至约10％v/v、约6.0％v/v至约9.5％v/v、约6.0％v/v至约9.0％v/v、约6.0％v/v至约8.5％v/v、约6.0％v/v至约8.0％v/v、约6.0％v/v至约7.5％v/v、约6.0％v/v至约7.0％v/v、约6.0％v/v至约6.5％v/v、约6.5％v/v至约10％v/v、约6.5％v/v至约9.5％v/v、约6.5％v/v至约9.0％v/v、约6.5％v/v至约8.5％v/v、约6.5％v/v至约8.0％v/v、约6.5％v/v至约7.5％v/v、约6.5％v/v至约7.0％v/v、约7.0％v/v至约10％v/v、约7.0％v/v至约9.5％v/v、约7.0％v/v至约9.0％v/v、约7.0％v/v至约8.5％v/v、约7.0％v/v至约8.0％v/v、约7.0％v/v至约7.5％v/v、约7.5％v/v至约10％v/v、约7.5％v/v至约9.5％v/v、约7.5％v/v至约9.0％v/v、约7.5％v/v至约8.5％v/v、约7.5％v/v至约8.0％v/v、约8.0％v/v至约10％v/v、约8.0％v/v至约9.5％v/v、约8.0％v/v至约9.0％v/v、约8.0％v/v至约8.5％v/v、约8.5％v/v至约10％v/v、约8.5％v/v至约9.5％v/v、约8.5％v/v至约9.0％v/v、约9.0％v/v至约10％v/v、约9.0％v/v至约9.5％v/v、或约9.5％v/v至约10％v/v)血清(例如，人AB血清)。在一些实施方案中，第四培养基包含0.1％v/v至约5％v/v(例如，约0.1％v/v至约4.5％v/v、约0.1％v/v至约4.0％v/v、约0.1％v/v至约3.5％v/v、约0.1％v/v至约3.0％v/v、约0.1％v/v至约2.5％v/v、约0.1％v/v至约2.0％v/v、约0.1％v/v至约1.5％v/v、约0.1％v/v至约1.0％v/v、约0.1％v/v至约0.5％v/v、约0.5％v/v至约5％v/v、约0.5％v/v至约4.5％v/v、约0.5％v/v至约4.0％v/v、约0.5％v/v至约3.5％v/v、约0.5％v/v至约3.0％v/v、约0.5％v/v至约2.5％v/v、约0.5％v/v至约2.0％v/v、约0.5％v/v至约1.5％v/v、约0.5％v/v至约1.0％v/v、约1.0％v/v至约5％v/v、约1.0％v/v至约4.5％v/v、约1.0％v/v至约4.0％v/v、约1.0％v/v至约3.5％v/v、约1.0％v/v至约3.0％v/v、约1.0％v/v至约2.5％v/v、约1.0％v/v至约2.0％v/v、约1.0％v/v至约1.5％v/v、约1.5％v/v至约5％v/v、约1.5％v/v至约4.5％v/v、约1.5％v/v至约4.0％v/v、约1.5％v/v至约3.5％v/v、约1.5％v/v至约3.0％v/v、约1.5％v/v至约2.5％v/v、约1.5％v/v至约2.0％v/v、约2.0％v/v至约5％v/v、约2.0％v/v至约4.5％v/v、约2.0％v/v至约4.0％v/v、约2.0％v/v至约3.5％v/v、约2.0％v/v至约3.0％v/v、约2.0％v/v至约2.5％v/v、约2.5％v/v至约5％v/v、约2.5％v/v至约4.5％v/v、约2.5％v/v至约4.0％v/v、约2.5％v/v至约3.5％v/v、约2.5％v/v至约3.0％v/v、约3.0％v/v至约5％v/v、约3.0％v/v至约4.5％v/v、约3.0％v/v至约4.0％v/v、约3.0％v/v至约3.5％v/v、约3.5％v/v至约5％v/v、约3.5％v/v至约4.5％v/v、约3.5％v/v至约4.0％v/v、约4.0％v/v至约5％v/v、约4.0％v/v至约4.5％v/v、或约4.5％v/v至约5％v/v)人血浆。在一些实施方案中，第四培养基包含约1U/mL至约5U/mL(例如，约1U/mL至约4U/mL、约1U/mL至约3U/mL、约1U/mL至约2U/mL、约2U/mL至约5U/mL、约2U/mL至约4U/mL、约2U/mL至约3U/mL、约3U/mL至约5U/mL、约3U/mL至约4U/mL、或约4U/mL至约5U/mL)肝素。在一些实施方案中，第四培养基包含约0.1％w/v至约3％w/v(例如，约0.1％w/v至约2.5％w/v、约0.1％w/v至约2.0％w/v、约0.1％w/v至约1.5％w/v、约0.1％w/v至约1.0％w/v、约0.1％w/v至约0.5％w/v、约0.5％w/v至约3％w/v、约0.5％w/v至约2.5％w/v、约0.5％w/v至约2.0％w/v、约0.5％w/v至约1.5％w/v、约0.5％w/v至约1.0％w/v、约1.0％w/v至约3％w/v、约1.0％w/v至约2.5％w/v、约1.0％w/v至约2.0％w/v、约1.0％w/v至约1.5％w/v、约1.5％w/v至约3％w/v、约1.5％w/v至约2.5％w/v、约1.5％w/v至约2.0％w/v、约2.0％w/v至约3％w/v、约2.0％w/v至约2.5％w/v、或约2.5％w/v至约3％w/v)的泊洛沙姆-188(P188)。

在一些实施方案中，第四培养基包含约1mM至约8mM(例如，本文所述此范围的任何子范围)的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。

在一些实施方案中，第四培养基包含100μg/mL至约2mg/mL、约100μg/mL至约1.8mg/mL、约100μg/mL至约1.6mg/mL、约100μg/mL至约1.5mg/mL、约100μg/mL至约1.4mg/mL、约100μg/mL至约1.3mg/mL、约100μg/mL至约1.2mg/mL、约100μg/mL至约1.1mg/mL、约100μg/mL至约1.0mg/mL、约100μg/mL至约900μg/mL、约100μg/mL至约800μg/mL、约100μg/mL至约700μg/mL、约100μg/mL至约600μg/mL、约100μg/mL至约500μg/mL、约100μg/mL至约400μg/mL、约100μg/mL至约300μg/mL、约100μg/mL至约200μg/mL、约200μg/mL至约2mg/mL、约200μg/mL至约1.8mg/mL、约200μg/mL至约1.6mg/mL、约200μg/mL至约1.5mg/mL、约200μg/mL至约1.4mg/mL、约200μg/mL至约1.3mg/mL、约200μg/mL至约1.2mg/mL、约200μg/mL至约1.1mg/mL、约200μg/mL至约1.0mg/mL、约200μg/mL至约900μg/mL、约200μg/mL至约800μg/mL、约200μg/mL至约700μg/mL、约200μg/mL至约600μg/mL、约200μg/mL至约500μg/mL、约200μg/mL至约400μg/mL、约200μg/mL至约300μg/mL、约300μg/mL至约2mg/mL、约300μg/mL至约1.8mg/mL、约300μg/mL至约1.6mg/mL、约300μg/mL至约1.5mg/mL、约300μg/mL至约1.4mg/mL、约300μg/mL至约1.3mg/mL、约300μg/mL至约1.2mg/mL、约300μg/mL至约1.1mg/mL、约300μg/mL至约1.0mg/mL、约300μg/mL至约900μg/mL、约300μg/mL至约800μg/mL、约300μg/mL至约700μg/mL、约300μg/mL至约600μg/mL、约300μg/mL至约500μg/mL、约300μg/mL至约400μg/mL、约400μg/mL至约2mg/mL、约400μg/mL至约1.8mg/mL、约400μg/mL至约1.6mg/mL、约400μg/mL至约1.5mg/mL、约400μg/mL至约1.4mg/mL、约400μg/mL至约1.3mg/mL、约400μg/mL至约1.2mg/mL、约400μg/mL至约1.1mg/mL、约400μg/mL至约1.0mg/mL、约400μg/mL至约900μg/mL、约400μg/mL至约800μg/mL、约400μg/mL至约700μg/mL、约400μg/mL至约600μg/mL、约400μg/mL至约500μg/mL、约500μg/mL至约2mg/mL、约500μg/mL至约1.8mg/mL、约500μg/mL至约1.6mg/mL、500μg/mL至约1.5mg/mL、约500μg/mL至约1.4mg/mL、约500μg/mL至约1.3mg/mL、约500μg/mL至约1.2mg/mL、约500μg/mL至约1.1mg/mL、约500μg/mL至约1.0mg/mL、约500μg/mL至约900μg/mL、约500μg/mL至约800μg/mL、约500μg/mL至约700μg/mL、约500μg/mL至约600μg/mL、约600μg/mL至约2mg/mL、约600μg/mL至约1.8mg/mL、约600μg/mL至约1.6mg/mL、约600μg/mL至约1.5mg/mL、约600μg/mL至约1.4mg/mL、约600μg/mL至约1.3mg/mL、约600μg/mL至约1.2mg/mL、约600μg/mL至约1.1mg/mL、约600μg/mL至约1.0mg/mL、约600μg/mL至约900μg/mL、约600μg/mL至约800μg/mL、约600μg/mL至约700μg/mL、约700μg/mL至约2mg/mL、约700μg/mL至约1.8mg/mL、约700μg/mL至约1.6mg/mL、约700μg/mL至约1.5mg/mL、约700μg/mL至约1.4mg/mL、约700μg/mL至约1.3mg/mL、约700μg/mL至约1.2mg/mL、约700μg/mL至约1.1mg/mL、约700μg/mL至约1.0mg/mL、约700μg/mL至约900μg/mL、约700μg/mL至约800μg/mL、约800μg/mL至约2mg/mL、约800μg/mL至约1.8mg/mL、约800μg/mL至约1.6mg/mL、约800μg/mL至约1.5mg/mL、约800μg/mL至约1.4mg/mL、约800μg/mL至约1.3mg/mL、约800μg/mL至约1.2mg/mL、约800μg/mL至约1.1mg/mL、约800μg/mL至约1.0mg/mL、约800μg/mL至约900μg/mL、约900μg/mL至约2mg/mL、约900μg/mL至约1.8mg/mL、约900μg/mL至约1.6mg/mL、约900μg/mL至约1.5mg/mL、约900μg/mL至约1.4mg/mL、约900μg/mL至约1.3mg/mL、约900μg/mL至约1.2mg/mL、约900μg/mL至约1.1mg/mL、约900μg/mL至约1.0mg/mL、约1.0mg/mL至约2mg/mL、约1.0mg/mL至约1.8mg/mL、约1.0mg/mL至约1.6mg/mL、约1.0mg/mL至约1.5mg/mL、约1.0mg/mL至约1.4mg/mL、约1.0mg/mL至约1.3mg/mL、约1.0mg/mL至约1.2mg/mL、约1.0mg/mL至约1.1mg/mL、约1.1mg/mL至约2mg/mL、约1.1mg/mL至约1.8mg/mL、约1.1mg/mL至约1.6mg/mL、约1.1mg/mL至约1.5mg/mL、约1.1mg/mL至约1.4mg/mL、约1.1mg/mL至约1.3mg/mL、约1.1mg/mL至约1.2mg/mL、约1.2mg/mL至约2mg/mL、约1.2mg/mL至约1.8mg/mL、约1.2mg/mL至约1.6mg/mL、约1.2mg/mL至约1.5mg/mL、约1.2mg/mL至约1.4mg/mL、约1.2mg/mL至约1.3mg/mL、约1.3mg/mL至约2mg/mL、约1.3mg/mL至约1.8mg/mL、约1.3mg/mL至约1.6mg/mL、约1.3mg/mL至约1.5mg/mL、约1.3mg/mL至约1.4mg/mL、约1.4mg/mL至约2mg/mL、约1.4mg/mL至约1.8mg/mL、约1.4mg/mL至约1.6mg/mL、约1.4mg/mL至约1.5mg/mL、约1.5mg/mL至约2mg/mL、约1.5mg/mL至约1.8mg/mL、约1.5mg/mL至约1.6mg/mL、约1.6mg/mL至约2mg/mL、约1.6mg/mL至约1.8mg/mL、或约1.8mg/mL至约2mg/mL的运铁蛋白(例如，人脱铁运铁蛋白、人全铁运铁蛋白或它们的组合)。

在一些实施方案中，第四培养基包含约1ng/mL至约500ng/mL、约1ng/mL至约480ng/mL、约1ng/mL至约460ng/mL、约1ng/mL至约440ng/mL、约1ng/mL至约420ng/mL、约1ng/mL至约400ng/mL、约1ng/mL至约380ng/mL、约1ng/mL至约360ng/mL、约1ng/mL至约340ng/mL、约1ng/mL至约320ng/mL、约1ng/mL至约300ng/mL、约1ng/mL至约280ng/mL、约1ng/mL至约260ng/mL、约1ng/mL至约240ng/mL、约1ng/mL至约220ng/mL、约1ng/mL至约200ng/mL、约1ng/mL至约180ng/mL、约1ng/mL至约160ng/mL、约1ng/mL至约140ng/mL、约1ng/mL至约120ng/mL、约1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约80ng/mL、约1ng/mL至约60ng/mL、约1ng/mL至约40ng/mL、约1ng/mL至约30ng/mL、约1ng/mL至约25ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、5ng/mL至约500ng/mL、约5ng/mL至约480ng/mL、约5ng/mL至约460ng/mL、约5ng/mL至约440ng/mL、约5ng/mL至约420ng/mL、约5ng/mL至约400ng/mL、约5ng/mL至约380ng/mL、约5ng/mL至约360ng/mL、约5ng/mL至约340ng/mL、约5ng/mL至约320ng/mL、约5ng/mL至约300ng/mL、约5ng/mL至约280ng/mL、约5ng/mL至约260ng/mL、约5ng/mL至约240ng/mL、约5ng/mL至约220ng/mL、约5ng/mL至约200ng/mL、约5ng/mL至约180ng/mL、约5ng/mL至约160ng/mL、约5ng/mL至约140ng/mL、约5ng/mL至约120ng/mL、约5ng/mL至约100ng/mL、约5ng/mL至约80ng/mL、约5ng/mL至约60ng/mL、约5ng/mL至约40ng/mL、约5ng/mL至约30ng/mL、约5ng/mL至约25ng/mL、约5ng/mL至约20ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、10ng/mL至约500ng/mL、约10ng/mL至约480ng/mL、约10ng/mL至约460ng/mL、约10ng/mL至约440ng/mL、约10ng/mL至约420ng/mL、约10ng/mL至约400ng/mL、约10ng/mL至约380ng/mL、约10ng/mL至约360ng/mL、约10ng/mL至约340ng/mL、约10ng/mL至约320ng/mL、约10ng/mL至约300ng/mL、约10ng/mL至约280ng/mL、约10ng/mL至约260ng/mL、约10ng/mL至约240ng/mL、约10ng/mL至约220ng/mL、约10ng/mL至约200ng/mL、约10ng/mL至约180ng/mL、约10ng/mL至约160ng/mL、约10ng/mL至约140ng/mL、约10ng/mL至约120ng/mL、约10ng/mL至约100ng/mL、约10ng/mL至约80ng/mL、约10ng/mL至约60ng/mL、约10ng/mL至约40ng/mL、约10ng/mL至约30ng/mL、约10ng/mL至约25ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约10ng/mL至约15ng/mL、15ng/mL至约500ng/mL、约15ng/mL至约480ng/mL、约15ng/mL至约460ng/mL、约15ng/mL至约440ng/mL、约15ng/mL至约420ng/mL、约15ng/mL至约400ng/mL、约15ng/mL至约380ng/mL、约15ng/mL至约360ng/mL、约15ng/mL至约340ng/mL、约15ng/mL至约320ng/mL、约15ng/mL至约300ng/mL、约15ng/mL至约280ng/mL、约15ng/mL至约260ng/mL、约15ng/mL至约240ng/mL、约15ng/mL至约220ng/mL、约15ng/mL至约200ng/mL、约15ng/mL至约180ng/mL、约15ng/mL至约160ng/mL、约15ng/mL至约140ng/mL、约15ng/mL至约120ng/mL、约15ng/mL至约100ng/mL、约15ng/mL至约80ng/mL、约15ng/mL至约60ng/mL、约15ng/mL至约40ng/mL、约15ng/mL至约30ng/mL、约15ng/mL至约25ng/mL、约15ng/mL至约20ng/mL、20ng/mL至约500ng/mL、约20ng/mL至约480ng/mL、约20ng/mL至约460ng/mL、约20ng/mL至约440ng/mL、约20ng/mL至约420ng/mL、约20ng/mL至约400ng/mL、约20ng/mL至约380ng/mL、约20ng/mL至约360ng/mL、约20ng/mL至约340ng/mL、约20ng/mL至约320ng/mL、约20ng/mL至约300ng/mL、约20ng/mL至约280ng/mL、约20ng/mL至约260ng/mL、约20ng/mL至约240ng/mL、约20ng/mL至约220ng/mL、约20ng/mL至约200ng/mL、约20ng/mL至约180ng/mL、约20ng/mL至约160ng/mL、约20ng/mL至约140ng/mL、约20ng/mL至约120ng/mL、约20ng/mL至约100ng/mL、约20ng/mL至约80ng/mL、约20ng/mL至约60ng/mL、约20ng/mL至约40ng/mL、约20ng/mL至约30ng/mL、约20ng/mL至约25ng/mL、25ng/mL至约500ng/mL、约25ng/mL至约480ng/mL、约25ng/mL至约460ng/mL、约25ng/mL至约440ng/mL、约25ng/mL至约420ng/mL、约25ng/mL至约400ng/mL、约25ng/mL至约380ng/mL、约25ng/mL至约360ng/mL、约25ng/mL至约340ng/mL、约25ng/mL至约320ng/mL、约25ng/mL至约300ng/mL、约25ng/mL至约280ng/mL、约25ng/mL至约260ng/mL、约25ng/mL至约240ng/mL、约25ng/mL至约220ng/mL、约25ng/mL至约200ng/mL、约25ng/mL至约180ng/mL、约25ng/mL至约160ng/mL、约25ng/mL至约140ng/mL、约25ng/mL至约120ng/mL、约25ng/mL至约100ng/mL、约25ng/mL至约80ng/mL、约25ng/mL至约60ng/mL、约25ng/mL至约40ng/mL、约25ng/mL至约30ng/mL、30ng/mL至约500ng/mL、约30ng/mL至约480ng/mL、约30ng/mL至约460ng/mL、约30ng/mL至约440ng/mL、约30ng/mL至约420ng/mL、约30ng/mL至约400ng/mL、约30ng/mL至约380ng/mL、约30ng/mL至约360ng/mL、约30ng/mL至约340ng/mL、约30ng/mL至约320ng/mL、约30ng/mL至约300ng/mL、约30ng/mL至约280ng/mL、约30ng/mL至约260ng/mL、约30ng/mL至约240ng/mL、约30ng/mL至约220ng/mL、约30ng/mL至约200ng/mL、约30ng/mL至约180ng/mL、约30ng/mL至约160ng/mL、约30ng/mL至约140ng/mL、约30ng/mL至约120ng/mL、约30ng/mL至约100ng/mL、约30ng/mL至约80ng/mL、约30ng/mL至约60ng/mL、约30ng/mL至约40ng/mL、40ng/mL至约500ng/mL、约40ng/mL至约480ng/mL、约40ng/mL至约460ng/mL、约40ng/mL至约440ng/mL、约40ng/mL至约420ng/mL、约40ng/mL至约400ng/mL、约40ng/mL至约380ng/mL、约40ng/mL至约360ng/mL、约40ng/mL至约340ng/mL、约40ng/mL至约320ng/mL、约40ng/mL至约300ng/mL、约40ng/mL至约280ng/mL、约40ng/mL至约260ng/mL、约40ng/mL至约240ng/mL、约40ng/mL至约220ng/mL、约40ng/mL至约200ng/mL、约40ng/mL至约180ng/mL、约40ng/mL至约160ng/mL、约40ng/mL至约140ng/mL、约40ng/mL至约120ng/mL、约40ng/mL至约100ng/mL、约40ng/mL至约80ng/mL、约40ng/mL至约60ng/mL、60ng/mL至约500ng/mL、约60ng/mL至约480ng/mL、约60ng/mL至约460ng/mL、约60ng/mL至约440ng/mL、约60ng/mL至约420ng/mL、约60ng/mL至约400ng/mL、约60ng/mL至约380ng/mL、约60ng/mL至约360ng/mL、约60ng/mL至约340ng/mL、约60ng/mL至约320ng/mL、约60ng/mL至约300ng/mL、约60ng/mL至约280ng/mL、约60ng/mL至约260ng/mL、约60ng/mL至约240ng/mL、约60ng/mL至约220ng/mL、约60ng/mL至约200ng/mL、约60ng/mL至约180ng/mL、约60ng/mL至约160ng/mL、约60ng/mL至约140ng/mL、约60ng/mL至约120ng/mL、约60ng/mL至约100ng/mL、约60ng/mL至约80ng/mL、80ng/mL至约500ng/mL、约80ng/mL至约480ng/mL、约80ng/mL至约460ng/mL、约80ng/mL至约440ng/mL、约80ng/mL至约420ng/mL、约80ng/mL至约400ng/mL、约80ng/mL至约380ng/mL、约80ng/mL至约360ng/mL、约80ng/mL至约340ng/mL、约80ng/mL至约320ng/mL、约80ng/mL至约300ng/mL、约80ng/mL至约280ng/mL、约80ng/mL至约260ng/mL、约80ng/mL至约240ng/mL、约80ng/mL至约220ng/mL、约80ng/mL至约200ng/mL、约80ng/mL至约180ng/mL、约80ng/mL至约160ng/mL、约80ng/mL至约140ng/mL、约80ng/mL至约120ng/mL、约80ng/mL至约100ng/mL、100ng/mL至约500ng/mL、约100ng/mL至约480ng/mL、约100ng/mL至约460ng/mL、约100ng/mL至约440ng/mL、约100ng/mL至约420ng/mL、约100ng/mL至约400ng/mL、约100ng/mL至约380ng/mL、约100ng/mL至约360ng/mL、约100ng/mL至约340ng/mL、约100ng/mL至约320ng/mL、约100ng/mL至约300ng/mL、约100ng/mL至约280ng/mL、约100ng/mL至约260ng/mL、约100ng/mL至约240ng/mL、约100ng/mL至约220ng/mL、约100ng/mL至约200ng/mL、约100ng/mL至约180ng/mL、约100ng/mL至约160ng/mL、约100ng/mL至约140ng/mL、约100ng/mL至约120ng/mL、120ng/mL至约500ng/mL、约120ng/mL至约480ng/mL、约120ng/mL至约460ng/mL、约120ng/mL至约440ng/mL、约120ng/mL至约420ng/mL、约120ng/mL至约400ng/mL、约120ng/mL至约380ng/mL、约120ng/mL至约360ng/mL、约120ng/mL至约340ng/mL、约120ng/mL至约320ng/mL、约120ng/mL至约300ng/mL、约120ng/mL至约280ng/mL、约120ng/mL至约260ng/mL、约120ng/mL至约240ng/mL、约120ng/mL至约220ng/mL、约120ng/mL至约200ng/mL、约120ng/mL至约180ng/mL、约120ng/mL至约160ng/mL、约120ng/mL至约140ng/mL、140ng/mL至约500ng/mL、约140ng/mL至约480ng/mL、约140ng/mL至约460ng/mL、约140ng/mL至约440ng/mL、约140ng/mL至约420ng/mL、约140ng/mL至约400ng/mL、约140ng/mL至约380ng/mL、约140ng/mL至约360ng/mL、约140ng/mL至约340ng/mL、约140ng/mL至约320ng/mL、约140ng/mL至约300ng/mL、约140ng/mL至约280ng/mL、约140ng/mL至约260ng/mL、约140ng/mL至约240ng/mL、约140ng/mL至约220ng/mL、约140ng/mL至约200ng/mL、约140ng/mL至约180ng/mL、约140ng/mL至约160ng/mL、160ng/mL至约500ng/mL、约160ng/mL至约480ng/mL、约160ng/mL至约460ng/mL、约160ng/mL至约440ng/mL、约160ng/mL至约420ng/mL、约160ng/mL至约400ng/mL、约160ng/mL至约380ng/mL、约160ng/mL至约360ng/mL、约160ng/mL至约340ng/mL、约160ng/mL至约320ng/mL、约160ng/mL至约300ng/mL、约160ng/mL至约280ng/mL、约160ng/mL至约260ng/mL、约160ng/mL至约240ng/mL、约160ng/mL至约220ng/mL、约160ng/mL至约200ng/mL、约160ng/mL至约180ng/mL、180ng/mL至约500ng/mL、约180ng/mL至约480ng/mL、约180ng/mL至约460ng/mL、约180ng/mL至约440ng/mL、约180ng/mL至约420ng/mL、约180ng/mL至约400ng/mL、约180ng/mL至约380ng/mL、约180ng/mL至约360ng/mL、约180ng/mL至约340ng/mL、约180ng/mL至约320ng/mL、约180ng/mL至约300ng/mL、约180ng/mL至约280ng/mL、约180ng/mL至约260ng/mL、约180ng/mL至约240ng/mL、约180ng/mL至约220ng/mL、约180ng/mL至约200ng/mL、200ng/mL至约500ng/mL、约200ng/mL至约480ng/mL、约200ng/mL至约460ng/mL、约200ng/mL至约440ng/mL、约200ng/mL至约420ng/mL、约200ng/mL至约400ng/mL、约200ng/mL至约380ng/mL、约200ng/mL至约360ng/mL、约200ng/mL至约340ng/mL、约200ng/mL至约320ng/mL、约200ng/mL至约300ng/mL、约200ng/mL至约280ng/mL、约200ng/mL至约260ng/mL、约200ng/mL至约240ng/mL、约200ng/mL至约220ng/mL、220ng/mL至约500ng/mL、约220ng/mL至约480ng/mL、约220ng/mL至约460ng/mL、约220ng/mL至约440ng/mL、约220ng/mL至约420ng/mL、约220ng/mL至约300ng/mL、约220ng/mL至约380ng/mL、约220ng/mL至约360ng/mL、约220ng/mL至约340ng/mL、约220ng/mL至约320ng/mL、约220ng/mL至约400ng/mL、约220ng/mL至约280ng/mL、约220ng/mL至约260ng/mL、约220ng/mL至约240ng/mL、240ng/mL至约500ng/mL、约240ng/mL至约480ng/mL、约240ng/mL至约460ng/mL、约240ng/mL至约440ng/mL、约240ng/mL至约420ng/mL、约240ng/mL至约400ng/mL、约240ng/mL至约380ng/mL、约240ng/mL至约360ng/mL、约240ng/mL至约340ng/mL、约240ng/mL至约320ng/mL、约240ng/mL至约300ng/mL、约240ng/mL至约280ng/mL、约240ng/mL至约260ng/mL、260ng/mL至约500ng/mL、约260ng/mL至约480ng/mL、约260ng/mL至约460ng/mL、约260ng/mL至约440ng/mL、约260ng/mL至约420ng/mL、约260ng/mL至约400ng/mL、约260ng/mL至约380ng/mL、约260ng/mL至约360ng/mL、约260ng/mL至约340ng/mL、约260ng/mL至约320ng/mL、约260ng/mL至约300ng/mL、约260ng/mL至约280ng/mL、280ng/mL至约500ng/mL、约280ng/mL至约480ng/mL、约280ng/mL至约460ng/mL、约280ng/mL至约440ng/mL、约280ng/mL至约420ng/mL、约280ng/mL至约400ng/mL、约280ng/mL至约380ng/mL、约280ng/mL至约360ng/mL、约280ng/mL至约340ng/mL、约280ng/mL至约320ng/mL、约280ng/mL至约300ng/mL、300ng/mL至约500ng/mL、约300ng/mL至约480ng/mL、约300ng/mL至约460ng/mL、约300ng/mL至约440ng/mL、约300ng/mL至约420ng/mL、约300ng/mL至约400ng/mL、约300ng/mL至约380ng/mL、约300ng/mL至约360ng/mL、约300ng/mL至约340ng/mL、约300ng/mL至约320ng/mL、320ng/mL至约500ng/mL、约320ng/mL至约480ng/mL、约320ng/mL至约460ng/mL、约320ng/mL至约440ng/mL、约320ng/mL至约420ng/mL、约320ng/mL至约400ng/mL、约320ng/mL至约380ng/mL、约320ng/mL至约360ng/mL、约320ng/mL至约340ng/mL、340ng/mL至约500ng/mL、约340ng/mL至约480ng/mL、约340ng/mL至约460ng/mL、约340ng/mL至约440ng/mL、约340ng/mL至约420ng/mL、约340ng/mL至约400ng/mL、约340ng/mL至约380ng/mL、约340ng/mL至约360ng/mL、360ng/mL至约500ng/mL、约360ng/mL至约480ng/mL、约360ng/mL至约460ng/mL、约360ng/mL至约440ng/mL、约360ng/mL至约420ng/mL、约360ng/mL至约400ng/mL、约360ng/mL至约380ng/mL、380ng/mL至约500ng/mL、约380ng/mL至约480ng/mL、约380ng/mL至约460ng/mL、约380ng/mL至约440ng/mL、约380ng/mL至约420ng/mL、约380ng/mL至约400ng/mL、400ng/mL至约500ng/mL、约400ng/mL至约480ng/mL、约400ng/mL至约460ng/mL、约400ng/mL至约440ng/mL、约400ng/mL至约420ng/mL、420ng/mL至约500ng/mL、约420ng/mL至约480ng/mL、约420ng/mL至约460ng/mL、约420ng/mL至约440ng/mL、440ng/mL至约500ng/mL、约440ng/mL至约480ng/mL、约440ng/mL至约460ng/mL、约460ng/mL至约500ng/mL、约460ng/mL至约480ng/mL、或约480ng/mL至约500ng/mL的EPO(例如，重组人EPO)或EPO-模拟肽。本文描述了EPO-模拟肽的非限制性实例。EPO-模拟肽的其他实例是本领域已知的。

在一些实施方案中，第四培养基包含约0.1μg/mL至约50μg/mL、约0.1μg/mL至约45μg/mL、约0.1μg/mL至约40μg/mL、约0.1μg/mL至约35μg/mL、约0.1μg/mL至约30μg/mL、约0.1μg/mL至约25μg/mL、约0.1μg/mL至约20μg/mL、约0.1μg/mL约15μg/mL、约0.1μg/mL至约10μg/mL、约0.1μg/mL至约5μg/mL、约0.1μg/mL至约2μg/mL、约0.1μg/mL至约1μg/mL、约1μg/mL至约50μg/mL、约1μg/mL至约45μg/mL、约1μg/mL至约40μg/mL、约1μg/mL至约35μg/mL、约1μg/mL至约30μg/mL、约1μg/mL至约25μg/mL、约1μg/mL至约20μg/mL、约1μg/mL约15μg/mL、约1μg/mL至约10μg/mL、约1μg/mL至约5μg/mL、约1μg/mL至约2μg/mL、约2μg/mL至约50μg/mL、约2μg/mL至约45μg/mL、约2μg/mL至约40μg/mL、约2μg/mL至约35μg/mL、约2μg/mL至约30μg/mL、约2μg/mL至约25μg/mL、约2μg/mL至约20μg/mL、约2μg/mL约15μg/mL、约2μg/mL至约10μg/mL、约2μg/mL至约5μg/mL、约5μg/mL至约50μg/mL、约5μg/mL至约45μg/mL、约5μg/mL至约40μg/mL、约5μg/mL至约35μg/mL、约5μg/mL至约30μg/mL、约5μg/mL至约25μg/mL、约5μg/mL至约20μg/mL、约5μg/mL约15μg/mL、约5μg/mL至约10μg/mL、约10μg/mL至约50μg/mL、约10μg/mL至约45μg/mL、约10μg/mL至约40μg/mL、约10μg/mL至约35μg/mL、约10μg/mL至约30μg/mL、约10μg/mL至约25μg/mL、约10μg/mL至约20μg/mL、约10μg/mL约15μg/mL、约15μg/mL至约50μg/mL、约15μg/mL至约45μg/mL、约15μg/mL至约40μg/mL、约15μg/mL至约35μg/mL、约15μg/mL至约30μg/mL、约15μg/mL至约25μg/mL、约15μg/mL至约20μg/mL、约20μg/mL至约50μg/mL、约20μg/mL至约45μg/mL、约20μg/mL至约40μg/mL、约20μg/mL至约35μg/mL、约20μg/mL至约30μg/mL、约20μg/mL至约25μg/mL、约25μg/mL至约50μg/mL、约25μg/mL至约45μg/mL、约25μg/mL至约40μg/mL、约25μg/mL至约35μg/mL、约25μg/mL至约30μg/mL、约30μg/mL至约50μg/mL、约30μg/mL至约45μg/mL、约30μg/mL至约40μg/mL、约30μg/mL至约35μg/mL、约35μg/mL至约50μg/mL、约35μg/mL至约45μg/mL、约35μg/mL至约40μg/mL、约40μg/mL至约50μg/mL、约40μg/mL至约45μg/mL、或约45μg/mL至约50μg/mL的胰岛素(例如，人胰岛素)。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第四培养基可以进一步包含0.01g/L至约80g/L(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)或约50μM至约445mM(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)的肌-肌醇(或肌-肌醇前体(例如，D-葡萄糖-6-磷酸或肌醇-D-磷酸)或肌-肌醇分解产物(例如，葡糖醛酸))。

在一些实施方案中，灌注培养包括使用切向过滤(例如切向流过滤(TFF)或交替切向过滤(ATF))。在一些实施方案中，切向过滤(例如TFF或ATF)包括使用平均孔尺寸为约10nm至约6.0μM(或本文所述的该范围的任何子范围)的一个或多个过滤器。

在一些实施方案中，第四培养基可以是例如化学成分确定的液体培养基、无动物组分的液体培养基、或化学成分确定的无动物组分的液体培养基、和/或无血清液体培养基。

在一些实施方案中，一旦第一细胞培养物达到特定靶细胞密度，例如1.0x10

在一些实施方案中，步骤(d)的灌注培养进行约8天至约15天、约8天至约14天、约8天至约13天、约8天至约12天、约8天至约11天、约8天至约10天、约8天至约9天、约9天至约15天、约9天至约14天、约9天至约13天、约9天至约12天、约9天至约11天、约9天至约10天、约10天至约15天、约10天至约14天、约10天至约13天、约10天至约12天、约10天至约11天、约11天至约15天、约11天至约14天、约11天至约13天、约11天至约12天、约12天至约15天、约12天至约14天、约12天至约13天、约13天至约15天、约13天至约14天、或约14天至约15天。

在一些实施方案中，步骤(d)产生的细胞密度为约5x10

分批或补料分批培养

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(d)包括将第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物，在本文所述的具有本文所述的任何示例性体积的任何示例性摇瓶、摇管、培养袋或生物反应器中)分批或补料分批培养约5天至约20天(例如，约5天至约19天、约5天至约18天、约5天至约17天、约5天至约16天、约5天至约15天、约5天至约14天、约5天至约13天、约5天至约12天、约5天至约11天、约5天至约10天、约5天至约9天、约5天至约8天、约5天至约7天、约5天至约6天、约6天至约20天、约6天至约19天、约6天至约18天、约6天至约17天、约6天至约16天、约6天至约15天、约6天至约14天、约6天至约13天、约6天至约12天、约6天至约11天、约6天至约10天、约6天至约9天、约6天至约8天、约6天至约7天、约7天至约20天、约7天至约19天、约7天至约18天、约7天至约17天、约7天至约16天、约7天至约15天、约7天至约14天、约7天至约13天、约7天至约12天、约7天至约11天、约7天至约10天、约7天至约9天、约7天至约8天、约8天至约20天、约8天至约19天、约8天至约18天、约8天至约17天、约8天至约16天、约8天至约15天、约8天至约14天、约8天至约13天、约8天至约12天、约8天至约11天、约8天至约10天、约8天至约9天、约9天至约20天、约9天至约19天、约9天至约18天、约9天至约17天、约9天至约16天、约9天至约15天、约9天至约14天、约9天至约13天、约9天至约12天、约9天至约11天、约9天至约10天、约10天至约20天、约10天至约19天、约10天至约18天、约10天至约17天、约10天至约16天、约10天至约15天、约10天至约14天、约10天至约13天、约10天至约12天、约10天至约11天、约11天至约20天、约11天至约19天、约11天至约18天、约11天至约17天、约11天至约16天、约11天至约15天、约11天至约14天、约11天至约13天、约11天至约12天、约12天至约20天、约12天至约19天、约12天至约18天、约12天至约17天、约12天至约16天、约12天至约15天、约12天至约14天、约12天至约13天、约13天至约20天、约13天至约19天、约13天至约18天、约13天至约17天、约13天至约16天、约13天至约15天、约13天至约14天、约14天至约20天、约14天至约19天、约14天至约18天、约14天至约17天、约14天至约16天、约14天至约15天、约15天至约20天、约15天至约19天、约15天至约18天、约15天至约17天、约15天至约16天、约16天至约20天、约16天至约19天、约16天至约18天、约16天至约17天、约17天至约20天、约17天至约19天、约17天至约18天、约18天至约20天、约18天至约19天、或约19天至约20天)，其中在步骤(d)之后，第三培养基包含去核红系细胞群体(例如，本文所述的任何示例性去核红系细胞)。

在一些实施方案中，步骤(d)包括对放置在生物反应器(例如，具有本文所述的任何示例性体积的本文所述的任何示例性生物反应器)中的第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)进行分批或补料分批培养。在此类实施方案中，步骤(d)包括在生物反应器中在P/V值为约10W/m

在一些实施方案中，步骤(d)包括对放置在摇瓶(例如，具有本文所述的任何示例性体积的本文所述的任何示例性摇瓶)中的第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)进行分批或补料分批培养。在此类实施方案中，步骤(d)包括在摇瓶中以约0.1xg至约50xg(例如，本文所述的该范围的任何子范围)温育第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)。

在一些实施方案中，步骤(d)包括对放置在摇管(例如，具有本文所述的任何示例性体积的本文所述的任何示例性摇管(例如，圆锥形容器))中的第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)进行分批或补料分批培养。在此类实施方案中，步骤(d)包括在摇管中以约0.1xg至约50xg(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)温育第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)。

在一些实施方案中，步骤(d)包括对放置在培养袋(例如，具有本文所述的任何示例性体积的本文所述的任何示例性培养袋)中的第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)进行分批或补料分批培养。在此类实施方案中，步骤(d)包括在培养袋中以10个摇动循环/分钟至约50个摇动循环/分钟(或本文所述的该范围的任何子范围)的摇动速率温育第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)。

在一些实施方案中，步骤(d)包括对第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)进行补料分批培养。

在一些实施方案中，步骤(d)包括对第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)进行补料分批培养。在一些实施方案中，步骤(d)中的补料分批培养包括随时间推移向第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)中添加额外体积的第三培养基(例如，本文所述的任何示例性第四培养基)和/或第四培养基(例如，本文所述的任何示例性第四培养基)。在一些实施方案中，随时间推移向第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)中连续地添加额外体积的第三培养基(例如，本文所述的任何示例性第三培养基)和/或第四培养基(例如，本文所述的任何示例性第四培养基)。在一些实施方案中，随时间推移向第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)中周期性地(例如，每三天一次、每两天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每天五次、每天六次、每天七次、每天八次、每天九次、每天十次、每天十一次或每天十二次)添加额外体积的第三培养基(例如，本文所述的任何示例性第四培养基)。在一些实施方案中，将约0.1x至约10x(例如，约0.1x至约9.5x、约0.1x至约9.0x、约0.1x至约8.5x、约0.1x至约8.0x、约0.1x至约7.5x、约0.1x至约7.0x、约0.1x至约6.5x、约0.1x至约6.0x、约0.1x至约5.5x、约0.1x至约5.0x、约0.1x至约4.5x、约0.1x至约4.0x、约0.1x至约3.5x、约0.1x至约3.0x、约0.1x至约2.5x、约0.1x至约2.0x、约0.1x至约1.5x、约0.1x至约1.0x、约0.1x至约0.5x、约0.1x至约0.3x、约0.1x至约0.2x、约0.2x至约10x、约0.2x至约9.5x、约0.2x至约9.0x、约0.2x至约8.5x、约0.2x至约8.0x、约0.2x至约7.5x、约0.2x至约7.0x、约0.2x至约6.5x、约0.2x至约6.0x、约0.2x至约5.5x、约0.2x至约5.0x、约0.2x至约4.5x、约0.2x至约4.0x、约0.2x至约3.5x、约0.2x至约3.0x、约0.2x至约2.5x、约0.2x至约2.0x、约0.2x至约1.5x、约0.2x至约1.0x、约0.2x至约0.5x、约0.2x至约0.3x、约0.3x至约10x、约0.3x至约9.5x、约0.3x至约9.0x、约0.3x至约8.5x、约0.3x至约8.0x、约0.3x至约7.5x、约0.3x至约7.0x、约0.3x至约6.5x、约0.3x至约6.0x、约0.3x至约5.5x、约0.3x至约5.0x、约0.3x至约4.5x、约0.3x至约4.0x、约0.3x至约3.5x、约0.3x至约3.0x、约0.3x至约2.5x、约0.3x至约2.0x、约0.3x至约1.5x、约0.3x至约1.0x、约0.3x至约0.5x、约0.5x至约10x、约0.5x至约9.5x、约0.5x至约9.0x、约0.5x至约8.5x、约0.5x至约8.0x、约0.5x至约7.5x、约0.5x至约7.0x、约0.5x至约6.5x、约0.5x至约6.0x、约0.5x至约5.5x、约0.5x至约5.0x、约0.5x至约4.5x、约0.5x至约4.0x、约0.5x至约3.5x、约0.5x至约3.0x、约0.5x至约2.5x、约0.5x至约2.0x、约0.5x至约1.5x、约0.5x至约1.0x、约1.0x至约10x、约1.0x至约9.5x、约1.0x至约9.0x、约1.0x至约8.5x、约1.0x至约8.0x、约1.0x至约7.5x、约1.0x至约7.0x、约1.0x至约6.5x、约1.0x至约6.0x、约1.0x至约5.5x、约1.0x至约5.0x、约1.0x至约4.5x、约1.0x至约4.0x、约1.0x至约3.5x、约1.0x至约3.0x、约1.0x至约2.5x、约1.0x至约2.0x、约1.0x至约1.5x、约1.5x至约10x、约1.5x至约9.5x、约1.5x至约9.0x、约1.5x至约8.5x、约1.5x至约8.0x、约1.5x至约7.5x、约1.5x至约7.0x、约1.5x至约6.5x、约1.5x至约6.0x、约1.5x至约5.5x、约1.5x至约5.0x、约1.5x至约4.5x、约1.5x至约4.0x、约1.5x至约3.5x、约1.5x至约3.0x、约1.5x至约2.5x、约1.5x至约2.0x、约2.0x至约10x、约2.0x至约9.5x、约2.0x至约9.0x、约2.0x至约8.5x、约2.0x至约8.0x、约2.0x至约7.5x、约2.0x至约7.0x、约2.0x至约6.5x、约2.0x至约6.0x、约2.0x至约5.5x、约2.0x至约5.0x、约2.0x至约4.5x、约2.0x至约4.0x、约2.0x至约3.5x、约2.0x至约3.0x、约2.0x至约2.5x、约2.5x至约10x、约2.5x至约9.5x、约2.5x至约9.0x、约2.5x至约8.5x、约2.5x至约8.0x、约2.5x至约7.5x、约2.5x至约7.0x、约2.5x至约6.5x、约2.5x至约6.0x、约2.5x至约5.5x、约2.5x至约5.0x、约2.5x至约4.5x、约2.5x至约4.0x、约2.5x至约3.5x、约2.5x至约3.0x、约3.0x至约10x、约3.0x至约9.5x、约3.0x至约9.0x、约3.0x至约8.5x、约3.0x至约8.0x、约3.0x至约7.5x、约3.0x至约7.0x、约3.0x至约6.5x、约3.0x至约6.0x、约3.0x至约5.5x、约3.0x至约5.0x、约3.0x至约4.5x、约3.0x至约4.0x、约3.0x至约3.5x、约3.5x至约10x、约3.5x至约9.5x、约3.5x至约9.0x、约3.5x至约8.5x、约3.5x至约8.0x、约3.5x至约7.5x、约3.5x至约7.0x、约3.5x至约6.5x、约3.5x至约6.0x、约3.5x至约5.5x、约3.5x至约5.0x、约3.5x至约4.5x、约3.5x至约4.0x、约4.0x至约10x、约4.0x至约9.5x、约4.0x至约9.0x、约4.0x至约8.5x、约4.0x至约8.0x、约4.0x至约7.5x、约4.0x至约7.0x、约4.0x至约6.5x、约4.0x至约6.0x、约4.0x至约5.5x、约4.0x至约5.0x、约4.0x至约4.5x、约4.5x至约10x、约4.5x至约9.5x、约4.5x至约9.0x、约4.5x至约8.5x、约4.5x至约8.0x、约4.5x至约7.5x、约4.5x至约7.0x、约4.5x至约6.5x、约4.5x至约6.0x、约4.5x至约5.5x、约4.5x至约5.0x、约5.0x至约10x、约5.0x至约9.5x、约5.0x至约9.0x、约5.0x至约8.5x、约5.0x至约8.0x、约5.0x至约7.5x、约5.0x至约7.0x、约5.0x至约6.5x、约5.0x至约6.0x、约5.0x至约5.5x、约5.5x至约10x、约5.5x至约9.5x、约5.5x至约9.0x、约5.5x至约8.5x、约5.5x至约8.0x、约5.5x至约7.5x、约5.5x至约7.0x、约5.5x至约6.5x、约5.5x至约6.0x、约6.0x至约10x、约6.0x至约9.5x、约6.0x至约9.0x、约6.0x至约8.5x、约6.0x至约8.0x、约6.0x至约7.5x、约6.0x至约7.0x、约6.0x至约6.5x、约6.5x至约10x、约6.5x至约9.5x、约6.5x至约9.0x、约6.5x至约8.5x、约6.5x至约8.0x、约6.5x至约7.5x、约6.5x至约7.0x、约7.0x至约10x、约7.0x至约9.5x、约7.0x至约9.0x、约7.0x至约8.5x、约7.0x至约8.0x、约7.0x至约7.5x、约7.5x至约10x、约7.5x至约9.5x、约7.5x至约9.0x、约7.5x至约8.5x、约7.5x至约8.0x、约8.0x至约10x、约8.0x至约9.5x、约8.0x至约9.0x、约8.0x至约8.5x、约8.5x至约10x、约8.5x至约9.5x、约8.5x至约9.0x、约9.0x至约10x、约9.0x至约9.5x、或约9.5x至约10x)体积的第三细胞培养物在步骤(c)后立即以每24小时的增量添加。在一些实施方案中，一旦第三细胞培养物达到特定靶细胞密度，例如约1.0x10

在一些实施方案中，第三培养基(例如，本文所述的任何示例性第三培养基)包含一种或多种(例如，两种，三种或四种)运铁蛋白(例如，脱铁运铁蛋白、全铁运铁蛋白或它们的组合)(例如，约1μg/mL至约500μg/mL运铁蛋白(例如，人脱铁运铁蛋白、人全铁运铁蛋白或它们的组合)或本文所述的该范围的任何子范围),胰岛素(例如，约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素(例如，重组人胰岛素)或本文所述的该范围的任何子范围)、SCF(例如，约1ng/mL至约500ng/mLSCF(例如，重组人SCF)或本文所述的该范围的任何子范围)，以及EPO或EPO模拟肽(例如，约1ng/mL至约500ng/mLEPO(例如，重组人EPO)或EPO模拟肽(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性EPO模拟肽)，或本文所述的该范围的任何子范围)。在本文所述的任何第三培养基的一些实施方案中，第三培养基包含约0.1％v/v至约10％v/v(例如，本文所述的该范围的任何子范围)血清(例如，人AB血清)。在本文所述的任何第三培养基的一些实施方案中，第三培养基包含约1mM至约8mM(例如，本文所述的该范围的任何子范围)ofL-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。

在一些实施方案中，步骤(d)中的补料分批培养包括：(i)在第一时间段内向第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)中添加额外体积的第三培养基(例如，本文所述的任何示例性第三培养基)；以及(ii)在第二时间段内向第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)中添加额外体积的第四培养基(例如，本文所述的任何示例性第四培养基)。

在一些实施方案中，在第一时间段内向第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)中连续地添加(i)中的额外体积的第三培养基(例如，本文所述的任何示例性第三培养基)；和/或在第二时间段内向第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)中连续地添加(ii)中的额外体积的第四培养基(例如，本文所述的任何示例性第四培养基)。

在一些实施方案中，在第一时间段内向第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)中周期性地(例如，每三天一次、每两天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每天五次、每天六次、每天七次、每天八次、每天九次、每天十次、每天十一次或每天十二次)添加(i)中的额外体积的第三培养基(例如，本文所述的任何示例性第三培养基)；和/或(ii)在第二时间段向内第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)中周期性地(例如，每三天一次、每两天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每天五次、每天六次、每天七次、每天八次、每天九次、每天十次、每天十一次或每天十二次)添加(ii)中的额外体积的第四培养基(例如，本文所述的任何示例性第四培养基)。

培养基(例如，本文所述的任何示例性第三培养基和/或本文所述的任何示例性第四培养基)的添加可以机械地进行，例如使用蠕动泵，或手动地(例如，通过无菌移液)进行。

在一些实施方案中，(i)中的第一时间段为约1天至约12天、约1天至约11天、约1天至约10天、约1天至约9天、约1天至约8天、约1天至约7天、约1天至约6天、约1天至约5天、约1天至约4天、约1天至约3天、约1天至约2天、约2天至约12天、约2天至约11天、约2天至约10天、约2天至约9天、约2天至约8天、约2天至约7天、约2天至约6天、约2天至约5天、约2天至约4天、约2天至约3天、约3天至约12天、约3天至约11天、约3天至约10天、约3天至约9天、约3天至约8天、约3天至约7天、约3天至约6天、约3天至约5天、约3天至约4天、约4天至约12天、约4天至约11天、约4天至约10天、约4天至约9天、约4天至约8天、约4天至约7天、约4天至约6天、约4天至约5天、约5天至约12天、约5天至约11天、约5天至约10天、约5天至约9天、约5天至约8天、约5天至约7天、约5天至约6天、约6天至约12天、约6天至约11天、约6天至约10天、约6天至约9天、约6天至约8天、约6天至约7天、约7天至约12天、约7天至约11天、约7天至约10天、约7天至约9天、约7天至约8天、约8天至约12天、约8天至约11天、约8天至约10天、约8天至约9天、约9天至约12天、约9天至约11天、约9天至约10天、约10天至约12天、约10天至约11天、或约11天至约12天。

在一些实施方案中，(ii)中的第二时间段为约1天至约12天、约1天至约11天、约1天至约10天、约1天至约9天、约1天至约8天、约1天至约7天、约1天至约6天、约1天至约5天、约1天至约4天、约1天至约3天、约1天至约2天、约2天至约12天、约2天至约11天、约2天至约10天、约2天至约9天、约2天至约8天、约2天至约7天、约2天至约6天、约2天至约5天、约2天至约4天、约2天至约3天、约3天至约12天、约3天至约11天、约3天至约10天、约3天至约9天、约3天至约8天、约3天至约7天、约3天至约6天、约3天至约5天、约3天至约4天、约4天至约12天、约4天至约11天、约4天至约10天、约4天至约9天、约4天至约8天、约4天至约7天、约4天至约6天、约4天至约5天、约5天至约12天、约5天至约11天、约5天至约10天、约5天至约9天、约5天至约8天、约5天至约7天、约5天至约6天、约6天至约12天、约6天至约11天、约6天至约10天、约6天至约9天、约6天至约8天、约6天至约7天、约7天至约12天、约7天至约11天、约7天至约10天、约7天至约9天、约7天至约8天、约8天至约12天、约8天至约11天、约8天至约10天、约8天至约9天、约9天至约12天、约9天至约11天、约9天至约10天、约10天至约12天、约10天至约11天、或约11天至约12天。

在这些方法的一些实施方案中，第四培养基(例如，本文所述的任何示例性第四培养基)包含下列中的一种或多种(例如，一种，两种或三种)：运铁蛋白(例如，脱铁运铁蛋白、全铁运铁蛋白或它们的组合)(例如，约100μg/mL至约2mg/mL运铁蛋白(例如，人脱铁运铁蛋白、人全铁运铁蛋白或它们的组合)或本文所述的该范围的任何子范围)、促红细胞生成素(EPO)或EPO-模拟肽(例如，本文所述的任何示例性EPO-模拟肽)(例如，约1ng/mL至约500ng/mL的EPO(例如，重组人EPO)或EPO-模拟肽或本文所述的该范围的任何子范围)，以及胰岛素(例如，约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素或本文所述的该范围的任何子范围)。在本文所述的任何第四种培养基的一些实施方案中，第四培养基包含约0.1％v/v至约10％v/v(例如，本文所述的该范围的任何子范围)血清(例如，人AB血清)。在本文所述的任何第四种培养基的一些实施方案中，第四培养基包含约1mM至约8mM(例如，本文所述的该范围的任何子范围)的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-谷氨酰胺或它们的组合。

在一些实施方案中，步骤(d)的分批或补料分批培养进行约8天至约15天、约8天至约14天、约8天至约13天、约8天至约12天、约8天至约11天、约8天至约10天、约8天至约9天、约9天至约15天、约9天至约14天、约9天至约13天、约9天至约12天、约9天至约11天、约9天至约10天、约10天至约15天、约10天至约14天、约10天至约13天、约10天至约12天、约10天至约11天、约11天至约15天、约11天至约14天、约11天至约13天、约11天至约12天、约12天至约15天、约12天至约14天、约12天至约13天、约13天至约15天、约13天至约14天、或约14天至约15天。

在一些实施方案中，步骤(d)产生的细胞密度为约5x10

去核红系细胞

在一些实施方案中，本文所述的去核红系细胞(例如，人去核红系细胞)对一种或多种次要血型抗原呈阴性(即，不包括)，例如Le(a

在一些实施方案中，本文所述的去核红系细胞(例如，人去核红系细胞)表现出与分离的、未培养的、不含外源蛋白质(例如，本文所述或本领域已知的任何外源蛋白质)的去核红系细胞基本相同的渗透膜脆性。在一些实施方案中，去核红系细胞群体在0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％NaCl时具有小于50％细胞裂解的渗透脆性。在一些实施方案中，使用WO2015/073587的实施例59中所述的方法(其描述内容以引用的方式并入本文)测定渗透脆性。

在一些实施方案中，去核红系细胞(例如，人去核红系细胞)具有与野生型、未处理的去核红系细胞大致相同的直径或体积。在一些实施方案中，去核红系细胞群体(例如，人去核红系细胞)的平均直径为约4、5、6、7、8、9、10、11或12微米、或约4.0至约12.0微米、约4.0至约11.5微米、约4.0至约11.0微米、约4.0至约10.5微米、约4.0至约10微米、约4.0至约9.5微米、约4.0至约9.0微米、约4.0至约8.5微米、约4.0至约8.0微米、约4.0至约7.5微米、约4.0至约7.0微米、约4.0至约6.5微米、约4.0至约6.0微米、约4.0至约5.5微米、约4.0至约5.0微米、约4.0至约4.5微米、约4.5至约12.0微米、约4.5至约11.5微米、约4.5至约11.0微米、约4.5至约10.5微米、约4.5至约10.0微米、约4.5至约9.5微米、约4.5至约9.0微米、约4.5至约8.5微米、约4.5至约8.0微米、约4.5至约7.5微米、约4.5至约7.0微米、约4.5至约6.5微米、约4.5至约6.0微米、约4.5至约5.5微米、约4.5至约5.0微米、约5.0至约12.0微米、约5.0至约11.5微米、约5.0至约11.0微米、约5.0至约10.5微米、约5.0至约10.0微米、约5.0至约9.5微米、约5.0至约9.0微米、约5.0至约8.5微米、约5.0至约8.0微米、约5.0至约7.5微米、约5.0至约7.0微米、约5.0至约6.5微米、约5.0至约6.0微米、约5.0至约5.5微米、约5.5至约12.0微米、约5.5至约11.5微米、约5.5至约11.0微米、约5.5至约10.5微米、约5.5至约10.0微米、约5.5至约9.5微米、约5.5至约9.0微米、约5.5至约8.5微米、约5.5至约8.0微米、约5.5至约7.5微米、约5.5至约7.0微米、约5.5至约6.5微米、约5.5至约6.0微米、约6.0至约12.0微米、约6.0至约11.5微米、约6.0至约11.0微米、约6.0至约10.5微米、约6.0至约10.0微米、约6.0至约9.5微米、约6.0至约9.0微米、约6.0至约8.5微米、约6.0至约8.0微米、约6.0至约7.5微米、约6.0至约7.0微米、约6.0至约6.5微米、约6.5至约12.0微米、约6.5至约11.5微米、约6.5至约11.0微米、约6.5至约10.5微米、约6.5至约10.0微米、约6.5至约9.5微米、约6.5至约9.0微米、约6.5至约8.5微米、约6.5至约8.0微米、约6.5至约7.5微米、约6.5至约7.0微米、约7.0至约12.0微米、约7.0至约11.5微米、约7.0至约11.0微米、约7.0至约10.5微米、约7.0至约10.0微米、约7.0至约9.5微米、约7.0至约9.0微米、约7.0至约8.5微米、约7.0至约8.0微米、约7.0至约7.5微米、约7.5至约12.0微米、约7.5至约11.5微米、约7.5至约11.0微米、约7.5至约10.5微米、约7.5至约10.0微米、约7.5至约9.5微米、约7.5至约9.0微米、约7.5至约8.5微米、约7.5至约8.0微米、约8.0至约12.0微米、约8.0至约11.5微米、约8.0至约11.0微米、约8.0至约10.5微米、约8.0至约10.0微米、约8.0至约9.5微米、约8.0至约9.0微米、约8.0至约8.5微米、约8.5至约12.0微米、约8.5至约11.5微米、约8.5至约11.0微米、约8.5至约10.5微米、约8.5至约10.0微米、约8.5至约9.5微米、约8.5至约9.0微米、约9.0至约12.0微米、约9.0至约11.5微米、约9.0至约11.0微米、约9.0至约10.5微米、约9.0至约10.0微米、约9.0至约9.5微米、约9.5至约12.0微米、约9.5至约11.5微米、约9.5至约11.0微米、约9.5至约10.5微米、约9.5至约10.0微米、约10.0至约12.0微米、约10.0至约11.5微米、约10.0至约11.0微米、约10.0至约10.5微米、约10.5至约12.0微米、约10.5至约11.5微米、约10.5至约11.0微米、约11.0至约12.0微米、约11.0至约11.5微米、或约11.5至约12.0微米，并且任选地，群体的标准偏差小于1、2或3微米。可以例如使用Advia 120血液学系统、Vi-cell

在一些实施方案中，去核红系细胞的平均红细胞容量的体积为约10fL至约175fL、约10fL至约160fL、约10fL至约140fL、约10fL至约120fL、约10fL至约100fL、约10fL至约95fL、约10fL至约90fL、约10fL至约85fL、约10fL至约80fL、约10fL至约75fL、约10fL至约70fL、约10fL至约65fL、约10fL至约60fL、约10fL至约55fL、约10fL至约50fL、约10fL至约45fL、约10fL至约40fL、约10fL至约35fL、约10fL至约30fL、约10fL至约25fL、约10fL至约20fL、约10fL至约15fL、约15fL至约175fL、约15fL至约160fL、约15fL至约140fL、约15fL至约120fL、约15fL至约100fL、约15fL至约95fL、约15fL至约90fL、约15fL至约85fL、约15fL至约80fL、约15fL至约75fL、约15fL至约70fL、约15fL至约65fL、约15fL至约60fL、约15fL至约55fL、约15fL至约50fL、约15fL至约45fL、约15fL至约40fL、约15fL至约35fL、约15fL至约30fL、约15fL至约25fL、约15fL至约20fL、约20fL至约175fL、约20fL至约160fL、约20fL至约140fL、约20fL至约120fL、约20fL至约100fL、约20fL至约95fL、约20fL至约90fL、约20fL至约85fL、约20fL至约80fL、约20fL至约75fL、约20fL至约70fL、约20fL至约65fL、约20fL至约60fL、约20fL至约55fL、约20fL至约50fL、约20fL至约45fL、约20fL至约40fL、约20fL至约35fL、约20fL至约30fL、约20fL至约25fL、约25fL至约175fL、约25fL至约160fL、约25fL至约140fL、约25fL至约120fL、约25fL至约100fL、约25fL至约95fL、约25fL至约90fL、约25fL至约85fL、约25fL至约80fL、约25fL至约75fL、约25fL至约70fL、约25fL至约65fL、约25fL至约60fL、约25fL至约55fL、约25fL至约50fL、约25fL至约45fL、约25fL至约40fL、约25fL至约35fL、约25fL至约30fL、约30fL至约175fL、约30fL至约160fL、约30fL至约140fL、约30fL至约120fL、约30fL至约100fL、约30fL至约95fL、约30fL至约90fL、约30fL至约85fL、约30fL至约80fL、约30fL至约75fL、约30fL至约70fL、约30fL至约65fL、约30fL至约60fL、约30fL至约55fL、约30fL至约50fL、约30fL至约45fL、约30fL至约40fL、约30fL至约35fL、约35fL至约175fL、约35fL至约160fL、约35fL至约140fL、约35fL至约120fL、约35fL至约100fL、约35fL至约95fL、约35fL至约90fL、约35fL至约85fL、约35fL至约80fL、约35fL至约75fL、约35fL至约70fL、约35fL至约65fL、约35fL至约60fL、约35fL至约55fL、约35fL至约50fL、约35fL至约45fL、约35fL至约40fL、约40fL至约175fL、约40fL至约160fL、约40fL至约140fL、约40fL至约120fL、约40fL至约100fL、约40fL至约95fL、约40fL至约90fL、约40fL至约85fL、约40fL至约80fL、约40fL至约75fL、约40fL至约70fL、约40fL至约65fL、约40fL至约60fL、约40fL至约55fL、约40fL至约50fL、约40fL至约45fL、约45fL至约175fL、约45fL至约160fL、约45fL至约140fL、约45fL至约120fL、约45fL至约100fL、约45fL至约95fL、约45fL至约90fL、约45fL至约85fL、约45fL至约80fL、约45fL至约75fL、约45fL至约70fL、约45fL至约65fL、约45fL至约60fL、约45fL至约55fL、约45fL至约50fL、约50fL至约175fL、约50fL至约160fL、约50fL至约140fL、约50fL至约120fL、约50fL至约100fL、约50fL至约95fL、约50fL至约90fL、约50fL至约85fL、约50fL至约80fL、约50fL至约75fL、约50fL至约70fL、约50fL至约65fL、约50fL至约60fL、约50fL至约55fL、约60fL至约175fL、约60fL至约160fL、约60fL至约140fL、约60fL至约120fL、约60fL至约100fL、约60fL至约95fL、约60fL至约90fL、约60fL至约85fL、约60fL至约80fL、约60fL至约75fL、约60fL至约70fL、约60fL至约65fL、约70fL至约175fL、约70fL至约160fL、约70fL至约140fL、约70fL至约120fL、约70fL至约100fL、约70fL至约95fL、约70fL至约90fL、约70fL至约85fL、约70fL至约80fL、约70fL至约75fL、约80fL至约175fL、约80fL至约160fL、约80fL至约140fL、约80fL至约120fL、约80fL至约100fL、约80fL至约95fL、约80fL至约90fL、约80fL至约85fL、约100fL至约175fL、约100fL至约160fL、约100fL至约140fL、约100fL至约120fL、约120fL至约175fL、约120fL至约160fL、约120fL至约140fL、约140fL至约175fL、约140fL至约160fL、或约160fL至约175fL，并且任选地，群体的标准偏差小于50、40、30、20、10、5或2fL。平均红细胞容量可以例如使用血液学分析仪器，例如Coulter计数器、Moxi Z细胞计数器(Orflo)或Sysmex血液学分析仪来测量。

在一些实施方案中，去核红系细胞是人(例如，来源于人供体红系祖细胞)去核红系细胞。

在一些实施方案中，去核红系细胞是工程化人去核红系细胞。在一些实施方案中，工程化去核红系细胞包含单一外源蛋白质(例如，存在于胞质溶胶中或存在于工程化去核红系细胞的膜上的外源蛋白质)(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性外源蛋白质)。

在其他实施方案中，工程化去核红系细胞包含两种或更多种外源蛋白质(例如，本文所述的任何示例性外源蛋白质)。在一些实施方案中，两种或更多种外源蛋白质中的至少一种可存在于工程化去核红系细胞的胞质溶胶中(例如，酶，例如苯丙氨酸氨裂解酶)。例如，在本文提供的任何工程化去核红系细胞的一些实施方案中，外源蛋白质存在于工程化去核红系细胞的胞质溶胶中，并且该细胞表现出增加的(例如，至少5％的增加、至少10％的增加、至少15％的增加、至少20％的增加、至少25％的增加、至少30％的增加、至少35％的增加、至少40％的增加、至少45％的增加、至少50％的增加、至少55％的增加、至少60％的增加、至少65％的增加、至少70％的增加、至少75％的增加、至少80％的增加、至少85％的增加、至少90％的增加、至少95％的增加、至少100％的增加、至少110％的增加、至少120％的增加、至少130％的增加、至少140％的增加、至少150％的增加、至少160％的增加、至少170％的增加、至少180％的增加、至少190％的增加、至少200％的增加、至少210％的增加、至少220％的增加、至少230％的增加、至少240％的增加、至少250％的增加、至少260％的增加、至少270％的增加、至少280％的增加、至少290％的增加或至少300％的增加或约1％的增加至约300％的增加、约1％的增加至约280％的增加、约1％的增加至约260％的增加、约1％的增加至约240％的增加、约1％的增加至约220％的增加、约1％的增加至约200％的增加、约1％的增加至约180％的增加、约1％的增加或约160％的增加、约1％的增加至约140％的增加、约1％的增加至约120％的增加、约1％的增加至约100％的增加、约1％的增加至约95％的增加、约1％的增加至约90％的增加、约1％的增加至约85％的增加、约1％的增加至约80％的增加、约1％的增加至约75％的增加、约1％的增加至约70％的增加、约1％的增加至约65％的增加、约1％的增加至约60％的增加、约1％的增加至约55％的增加、约1％的增加至约50％的增加、约1％的增加至约45％的增加、约1％的增加至约40％的增加、约1％的增加至约35％的增加、约1％的增加至约30％的增加、约1％的增加至约25％的增加、约1％的增加至约20％的增加、约1％的增加至约15％的增加、约1％的增加至约10％的增加、约1％的增加至约5％的增加、约5％至约300％的增加、约5％的增加至约280％的增加、约5％的增加至约260％的增加、约5％的增加至约240％的增加、约5％的增加至约220％的增加、约5％的增加至约200％的增加、约5％的增加至约180％的增加、约5％的增加或约160％的增加、约5％的增加至约140％的增加、约5％的增加至约120％的增加、约5％的增加至约100％的增加、约5％的增加至约95％的增加、约5％的增加至约90％的增加、约5％的增加至约85％的增加、约5％的增加至约80％的增加、约5％的增加至约75％的增加、约5％的增加至约70％的增加、约5％的增加至约65％的增加、约5％的增加至约60％的增加、约5％的增加至约55％的增加、约5％的增加至约50％的增加、约5％的增加至约45％的增加、约5％的增加至约40％的增加、约5％的增加至约35％的增加、约5％的增加至约30％的增加、约5％的增加至约25％的增加、约5％的增加至约20％的增加、约5％的增加至约15％的增加、约5％的增加至约10％的增加、约10％的增加至约300％的增加、约10％的增加至约280％的增加、约10％的增加至约260％的增加、约10％的增加至约240％的增加、约10％的增加至约220％的增加、约10％的增加至约200％的增加、约10％的增加至约180％的增加、约10％的增加或约160％的增加、约10％的增加至约140％的增加、约10％的增加至约120％的增加、约10％的增加至约100％的增加、约10％的增加至约95％的增加、约10％的增加至约90％的增加、约10％的增加至约85％的增加、约10％的增加至约80％的增加、约10％的增加至约75％的增加、约10％的增加至约70％的增加、约10％的增加至约65％的增加、约10％的增加至约60％的增加、约10％的增加至约55％的增加、约10％的增加至约50％的增加、约10％的增加至约45％的增加、约10％的增加至约40％的增加、约10％的增加至约35％的增加、约10％的增加至约30％的增加、约10％的增加至约25％的增加、约10％的增加至约20％的增加、约10％的增加至约15％的增加、约15％的增加至约300％的增加、约15％的增加至约280％的增加、约15％的增加至约260％的增加、约15％的增加至约240％的增加、约15％的增加至约220％的增加、约15％的增加至约200％的增加、约15％的增加至约180％的增加、约15％的增加或约160％的增加、约15％的增加至约140％的增加、约15％的增加至约120％的增加、约15％的增加至约100％的增加、约15％的增加至约95％的增加、约15％的增加至约90％的增加、约15％的增加至约85％的增加、约15％的增加至约80％的增加、约15％的增加至约75％的增加、约15％的增加至约70％的增加、约15％的增加至约65％的增加、约15％的增加至约60％的增加、约15％的增加至约55％的增加、约15％的增加至约50％的增加、约15％的增加至约45％的增加、约15％的增加至约40％的增加、约15％的增加至约35％的增加、约15％的增加至约30％的增加、约15％的增加至约25％的增加、约15％的增加至约20％的增加、约20％的增加至约300％的增加、约20％的增加至约280％的增加、约20％的增加至约260％的增加、约20％的增加至约240％的增加、约20％的增加至约220％的增加、约20％的增加至约200％的增加、约20％的增加至约180％的增加、约20％的增加或约160％的增加、约20％的增加至约140％的增加、约20％的增加至约120％的增加、约20％的增加至约100％的增加、约20％的增加至约95％的增加、约20％的增加至约90％的增加、约20％的增加至约85％的增加、约20％的增加至约80％的增加、约20％的增加至约75％的增加、约20％的增加至约70％的增加、约20％的增加至约65％的增加、约20％的增加至约60％的增加、约20％的增加至约55％的增加、约20％的增加至约50％的增加、约20％的增加至约45％的增加、约20％的增加至约40％的增加、约20％的增加至约35％的增加、约20％的增加至约30％的增加、约20％的增加至约25％的增加、约25％的增加至约300％的增加、约25％的增加至约280％的增加、约25％的增加至约260％的增加、约25％的增加至约240％的增加、约25％的增加至约220％的增加、约25％的增加至约200％的增加、约25％的增加至约180％的增加、约25％的增加或约160％的增加、约25％的增加至约140％的增加、约25％的增加至约120％的增加、约25％的增加至约100％的增加、约25％的增加至约95％的增加、约25％的增加至约90％的增加、约25％的增加至约85％的增加、约25％的增加至约80％的增加、约25％的增加至约75％的增加、约25％的增加至约70％的增加、约25％的增加至约65％的增加、约25％的增加至约60％的增加、约25％的增加至约55％的增加、约25％的增加至约50％的增加、约25％的增加至约45％的增加、约25％的增加至约40％的增加、约25％的增加至约35％的增加、约25％的增加至约30％的增加、约30％的增加至约300％的增加、约30％的增加至约280％的增加、约30％的增加至约260％的增加、约30％的增加至约240％的增加、约30％的增加至约220％的增加、约30％的增加至约200％的增加、约30％的增加至约180％的增加、约30％的增加或约160％的增加、约30％的增加至约140％的增加、约30％的增加至约120％的增加、约30％的增加至约100％的增加、约30％的增加至约95％的增加、约30％的增加至约90％的增加、约30％的增加至约85％的增加、约30％的增加至约80％的增加、约30％的增加至约75％的增加、约30％的增加至约70％的增加、约30％的增加至约65％的增加、约30％的增加至约60％的增加、约30％的增加至约55％的增加、约30％的增加至约50％的增加、约30％的增加至约45％的增加、约30％的增加至约40％的增加、约30％的增加至约35％的增加、约35％的增加至约300％的增加、约35％的增加至约280％的增加、约35％的增加至约260％的增加、约35％的增加至约240％的增加、约35％的增加至约220％的增加、约35％的增加至约200％的增加、约35％的增加至约180％的增加、约35％的增加或约160％的增加、约35％的增加至约140％的增加、约35％的增加至约120％的增加、约35％的增加至约100％的增加、约35％的增加至约95％的增加、约35％的增加至约90％的增加、约35％的增加至约85％的增加、约35％的增加至约80％的增加、约35％的增加至约75％的增加、约35％的增加至约70％的增加、约35％的增加至约65％的增加、约35％的增加至约60％的增加、约35％的增加至约55％的增加、约35％的增加至约50％的增加、约35％的增加至约45％的增加、约35％的增加至约40％的增加、约40％的增加至约300％的增加、约40％的增加至约280％的增加、约40％的增加至约260％的增加、约40％的增加至约240％的增加、约40％的增加至约220％的增加、约40％的增加至约200％的增加、约40％的增加至约180％的增加、约40％的增加或约160％的增加、约40％的增加至约140％的增加、约40％的增加至约120％的增加、约40％的增加至约100％的增加、约40％的增加至约95％的增加、约40％的增加至约90％的增加、约40％的增加至约85％的增加、约40％的增加至约80％的增加、约40％的增加至约75％的增加、约40％的增加至约70％的增加、约40％的增加至约65％的增加、约40％的增加至约60％的增加、约40％的增加至约55％的增加、约40％的增加至约50％的增加、约40％的增加至约45％的增加、约45％的增加至约300％的增加、约45％的增加至约280％的增加、约45％的增加至约260％的增加、约45％的增加至约240％的增加、约45％的增加至约220％的增加、约45％的增加至约200％的增加、约45％的增加至约180％的增加、约45％的增加或约160％的增加、约45％的增加至约140％的增加、约45％的增加至约120％的增加、约45％的增加至约100％的增加、约45％的增加至约95％的增加、约45％的增加至约90％的增加、约45％的增加至约85％的增加、约45％的增加至约80％的增加、约45％的增加至约75％的增加、约45％的增加至约70％的增加、约45％的增加至约65％的增加、约45％的增加至约60％的增加、约45％的增加至约55％的增加、约45％的增加至约50％的增加、约50％的增加至约300％的增加、约50％的增加至约280％的增加、约50％的增加至约260％的增加、约50％的增加至约240％的增加、约50％的增加至约220％的增加、约50％的增加至约200％的增加、约50％的增加至约180％的增加、约50％的增加或约160％的增加、约50％的增加至约140％的增加、约50％的增加至约120％的增加、约50％的增加至约100％的增加、约50％的增加至约95％的增加、约50％的增加至约90％的增加、约50％的增加至约85％的增加、约50％的增加至约80％的增加、约50％的增加至约75％的增加、约50％的增加至约70％的增加、约50％的增加至约65％的增加、约50％的增加至约60％的增加、约50％的增加至约55％的增加、约55％的增加至约300％的增加、约55％的增加至约280％的增加、约55％的增加至约260％的增加、约55％的增加至约240％的增加、约55％的增加至约220％的增加、约55％的增加至约200％的增加、约55％的增加至约180％的增加、约55％的增加或约160％的增加、约55％的增加至约140％的增加、约55％的增加至约120％的增加、约55％的增加至约100％的增加、约55％的增加至约95％的增加、约55％的增加至约90％的增加、约55％的增加至约85％的增加、约55％的增加至约80％的增加、约55％的增加至约75％的增加、约55％的增加至约70％的增加、约55％的增加至约65％的增加、约55％的增加至约60％的增加、约60％的增加至约300％的增加、约60％的增加至约280％的增加、约60％的增加至约260％的增加、约60％的增加至约240％的增加、约60％的增加至约220％的增加、约60％的增加至约200％的增加、约60％的增加至约180％的增加、约60％的增加或约160％的增加、约60％的增加至约140％的增加、约60％的增加至约120％的增加、约60％的增加至约100％的增加、约60％的增加至约95％的增加、约60％的增加至约90％的增加、约60％的增加至约85％的增加、约60％的增加至约80％的增加、约60％的增加至约75％的增加、约60％的增加至约70％的增加、约60％的增加至约65％的增加、约65％的增加至约300％的增加、约65％的增加至约280％的增加、约65％的增加至约260％的增加、约65％的增加至约240％的增加、约65％的增加至约220％的增加、约65％的增加至约200％的增加、约65％的增加至约180％的增加、约65％的增加或约160％的增加、约65％的增加至约140％的增加、约65％的增加至约120％的增加、约65％的增加至约100％的增加、约65％的增加至约95％的增加、约65％的增加至约90％的增加、约65％的增加至约85％的增加、约65％的增加至约80％的增加、约65％的增加至约75％的增加、约65％的增加至约70％的增加、约70％的增加至约300％的增加、约70％的增加至约280％的增加、约70％的增加至约260％的增加、约70％的增加至约240％的增加、约70％的增加至约220％的增加、约70％的增加至约200％的增加、约70％的增加至约180％的增加、约70％的增加或约160％的增加、约70％的增加至约140％的增加、约70％的增加至约120％的增加、约70％的增加至约100％的增加、约70％的增加至约95％的增加、约70％的增加至约90％的增加、约70％的增加至约85％的增加、约70％的增加至约80％的增加、约70％的增加至约75％的增加、约75％的增加至约300％的增加、约75％的增加至约280％的增加、约75％的增加至约260％的增加、约75％的增加至约240％的增加、约75％的增加至约220％的增加、约75％的增加至约200％的增加、约75％的增加至约180％的增加、约75％的增加或约160％的增加、约75％的增加至约140％的增加、约75％的增加至约120％的增加、约75％的增加至约100％的增加、约75％的增加至约95％的增加、约75％的增加至约90％的增加、约75％的增加至约85％的增加、约75％的增加至约80％的增加、约80％的增加至约300％的增加、约80％的增加至约280％的增加、约80％的增加至约260％的增加、约80％的增加至约240％的增加、约80％的增加至约220％的增加、约80％的增加至约200％的增加、约80％的增加至约180％的增加、约80％的增加或约160％的增加、约80％的增加至约140％的增加、约80％的增加至约120％的增加、约80％的增加至约100％的增加、约80％的增加至约95％的增加、约80％的增加至约90％的增加、约80％的增加至约85％的增加、约85％的增加至约300％的增加、约85％的增加至约280％的增加、约85％的增加至约260％的增加、约85％的增加至约240％的增加、约85％的增加至约220％的增加、约85％的增加至约200％的增加、约85％的增加至约180％的增加、约85％的增加或约160％的增加、约85％的增加至约140％的增加、约85％的增加至约120％的增加、约85％的增加至约100％的增加、约85％的增加至约95％的增加、约85％的增加至约90％的增加、约90％的增加至约300％的增加、约90％的增加至约280％的增加、约90％的增加至约260％的增加、约90％的增加至约240％的增加、约90％的增加至约220％的增加、约90％的增加至约200％的增加、约90％的增加至约180％的增加、约90％的增加或约160％的增加、约90％的增加至约140％的增加、约90％的增加至约120％的增加、约90％的增加至约100％的增加、约90％的增加至约95％的增加、约95％的增加至约300％的增加、约95％的增加至约280％的增加、约95％的增加至约260％的增加、约95％的增加至约240％的增加、约95％的增加至约220％的增加、约95％的增加至约200％的增加、约95％的增加至约180％的增加、约95％的增加或约160％的增加、约95％的增加至约140％的增加、约95％的增加至约120％的增加、约95％的增加至约100％的增加、约100％的增加至约300％的增加、约100％的增加至约280％的增加、约100％的增加至约260％的增加、约100％的增加至约240％的增加、约100％的增加至约220％的增加、约100％的增加至约200％的增加、约100％的增加至约180％的增加、约100％的增加或约160％的增加、约100％的增加至约140％的增加、约100％的增加至约120％的增加、约120％的增加至约300％的增加、约120％的增加至约280％的增加、约120％的增加至约260％的增加、约120％的增加至约240％的增加、约120％的增加至约220％的增加、约120％的增加至约200％的增加、约120％的增加至约180％的增加、约120％的增加或约160％的增加、约120％的增加至约140％的增加、约140％的增加至约300％的增加、约140％的增加至约280％的增加、约140％的增加至约260％的增加、约140％的增加至约240％的增加、约140％的增加至约220％的增加、约140％的增加至约200％的增加、约140％的增加至约180％的增加、约140％的增加或约160％的增加、约160％的增加至约300％的增加、约160％的增加至约280％的增加、约160％的增加至约260％的增加、约160％的增加至约240％的增加、约160％的增加至约220％的增加、约160％的增加至约200％的增加、约160％的增加至约180％的增加、约180％的增加至约300％的增加、约180％的增加至约280％的增加、约180％的增加至约260％的增加、约180％的增加至约240％的增加、约180％的增加至约220％的增加、约180％的增加至约200％的增加、约200％的增加至约300％的增加、约200％的增加至约280％的增加、约200％的增加至约260％的增加、约200％的增加至约240％的增加、约200％的增加至约220％的增加、约220％的增加至约300％的增加、约220％的增加至约280％的增加、约220％的增加至约260％的增加、约220％的增加至约240％的增加、约240％的增加至约300％的增加、约240％的增加至约280％的增加、约240％的增加至约260％的增加、约260％的增加至约300％的增加、约260％的增加至约280％的增加或约280％的增加至约300％的增加)的苯丙氨酸降解活性，这是与如下的去核红系细胞相比，所述去核红系细胞不与含有亚牛磺酸(或亚牛磺酸前体或亚牛磺酸分解产物)或牛磺酸(或牛磺酸前体或牛磺酸分解产物)的液体培养基接触，或不含约1.0g/L至约37.5g/L亚牛磺酸(或亚牛磺酸前体或亚牛磺酸分解产物)或约1.0g/L至约37.5g/L牛磺酸(或牛磺酸前体或牛磺酸分解产物)。用于测定苯丙氨酸降解活性的测定的非限制性实例描述于例如Wang等(2008)J.Mol.Biol.380(4):623-35；Moffitt等.(2007)Biochem.46(4):1004-12；和Jaliani等.(2013)Appl.Biochem.Biotechnol.171(7):1805-18；其每一者以引用的方式并入本文。

在一些实施方案中，两种或更多种外源性蛋白中的至少一种可存在于工程化去核红系细胞的膜上(例如，Fc结合分子、细胞因子受体、T细胞活化配体、T细胞受体、免疫抑制分子、MHC分子、APC结合分子、自身抗原、变应原、毒素、靶向剂、受体配体(例如，受体激动剂或受体拮抗剂)或抗体片段)。

除了包含外源蛋白质的工程化红系细胞可用于治疗的相应疾病或病症之外，本文所述的任何工程化红系细胞可包含的一种或多种外源蛋白质的非限制性实施方案列于下表A-D中。可由本文所述的任何红系细胞包含的外源蛋白质的另外的实施方案是本领域已知的。

表A.外源蛋白质的实例

表B.外源蛋白质的实例

表C.外源蛋白质的实例

表D.外源蛋白质的实例

在一些实施方案中，存在于工程化去核红系细胞的膜上的外源蛋白质可以是点击化学反应的产物(例如，可以使用本文所述的任何方法将外源蛋白质缀合到存在于细胞膜上的蛋白(例如，第二外源蛋白质或内源蛋白质))。在一些实施方案中，存在于工程化去核红系细胞的膜上的外源蛋白质可以是使用分选酶的缀合反应的产物(例如，可以使用本文所述的任何方法将外源蛋白质缀合至存在于细胞膜上的蛋白质(例如，第二外源蛋白质或内源蛋白质))。使用分选酶的缀合反应的非限制性实施方案可见于美国专利10,260,038和美国专利公布2016/0082046 A1，两者均以引用的方式并入本文。

本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括将一种或多种外源蛋白质点击缀合至细胞(例如，本文所述的任何细胞，例如，去核红系细胞、工程化去核红系细胞或本文所述的任何红系祖细胞)(例如，使用本文所述的任何方法)。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括低渗加载细胞(例如，本文所述的任何细胞，例如，去核红系细胞、工程化去核红系细胞或本文所述的任何红系祖细胞)(例如，使用本文所述的任何方法)。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括通过物理操纵(例如，使用本文所述的任何方法)加载细胞(例如，本文所述的任何细胞，例如，去核红系细胞、工程化去核红系细胞或本文所述的任何红系祖细胞)。

在一些实施方案中，存在于工程化去核红系细胞的膜上的外源蛋白质可以是脂质锚定蛋白，例如GPI锚、N-肉豆蔻酰化蛋白或S-棕榈酰化蛋白。在一些实施方案中，存在于工程化去核红系细胞的膜上的外源蛋白质可以是跨膜蛋白(例如，单程或多程跨膜蛋白)或外周膜蛋白。在一些实施方案中，存在于工程化去核红系细胞的膜上的外源蛋白质可以是包含跨膜结构域的融合蛋白(例如包含SMIM1或血型糖蛋白A(GPA)的跨膜结构域的融合蛋白)。在一些实施方案中，存在于工程化去核红系细胞的膜上的外源蛋白质不具有任何突出到胞外空间的氨基酸。在一些实施方案中，存在于工程化去核红系细胞的膜上的外源蛋白质不具有任何突出到工程化去核红系细胞的胞质溶胶中的氨基酸。在一些实施方案中，存在于工程化去核红系细胞的膜上的外源蛋白质具有突出到胞外间隙的氨基酸和突出到工程化去核红系细胞的胞质溶胶中的氨基酸。

本文所述的方法还可包括在步骤(a)之前将编码一种或多种重组蛋白的核酸引入红系祖细胞(例如，本文所述的任何示例性红系祖细胞)。工程化去核红系细胞可以通过将编码一种或多种外源蛋白质(例如，本文所述或本领域已知的任何外源蛋白质)的一种或多种核酸(例如，DNA表达载体或mRNA)引入红系祖细胞(例如，本文所述或本领域已知的任何红系祖细胞)中来产生。将DNA表达载体引入红系祖细胞的示例性方法包括但不限于脂质体介导的转移、转化、基因枪、转染和转导，例如病毒介导的基因转移(例如，使用病毒载体进行，所述病毒载体包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒载体和基于逆转录病毒的载体)。将DNA表达载体引入红系祖细胞的其他示例性方法包括使用例如裸DNA、CaPO

在引入编码一种或多种外源蛋白质的一种或多种核酸之前，在允许分化成工程化去核红系细胞的合适条件下，可以任选地培养红系祖细胞。在一些实施方案中，所得工程化去核红系细胞包含与成熟红细胞相关的蛋白质，例如血红蛋白(例如成人血红蛋白和/或胎儿血红蛋白)、血型糖蛋白A和外源蛋白质，其可以通过标准方法(例如蛋白质印迹或FACS分析)进行验证和定量。

在一些实施方案中，可以用编码外源蛋白质的mRNA转染去核红系细胞或红系祖细胞，以产生工程化去核红系细胞。信使RNA可衍生自含有编码外源蛋白质的序列的cDNA质粒构建体的体外转录。例如，编码外源蛋白质的cDNA序列可插入到含有与特异性RNA聚合酶相容的启动子序列的克隆载体中。例如，克隆载体ZAP

编码外源蛋白质的信使RNA可以使用多种方法引入去核红系细胞或红系祖细胞，包括例如脂转染法和电穿孔(van Tandeloo等，Blood 98:49-56,2001)。对于脂质转染，例如，将Opti-MEM(Invitrogen,Carlsbad,Calif.,USA)中的5μg体外转录的mRNA以1:4的比例与阳离子脂质DMRIE-C(Invitrogen)温育5-15分钟。

可选地，可以使用多种其他阳离子脂质或阳离子聚合物用mRNA转染红系祖细胞或去核红系细胞，所述mRNA包括例如DOTAP、多种形式的聚乙烯亚胺和聚L-赖氨酸(Sigma-Aldrich,Saint Louis,Mo.,USA),and Superfect(Qiagen,Inc.,Valencia,Calif.,USA；参见例如Bettinger等，Nucleic Acids Res.29:3882-3891,2001)。将得到的mRNA/脂质复合物与细胞(1–2x10

可选地，可以使用肽介导的RNA递送策略将mRNA转染到红系祖细胞或去核红系细胞中(参见，例如，Bettinger等，Nucleic Acids Res.29:3882-3891,2001)。例如，阳离子脂聚乙烯亚胺2kDa(Sigma-Aldrich,Saint Louis,Mo.,USA)可以与蜂毒肽(melittinpeptide)(Alta Biosciences,Birmingham,UK)结合以增加mRNA转染的效率，特别是在有丝分裂后的原代细胞中。可以使用二硫化物交联剂例如异-双功能交联剂琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯来使蜂毒肽与PEI缀合。体外转录的mRNA与苯六甲酸-PEI预温育5至15分钟以形成RNA/肽/脂质复合物。然后将该复合物添加无血清培养基中的细胞中，在37℃和5％CO

在一些实施方案中，通过将编码一种或多种外源蛋白质(例如，本文所述的任何外源蛋白质或外源蛋白质的任何组合)的核酸(例如，本文所述的任何示例性核酸)引入红系祖细胞中，产生工程化去核红系细胞。在一些实施方案中，外源蛋白质由引入红系祖细胞的DNA编码。在一些实施方案中，外源蛋白质由RNA编码，该RNA被引入红系祖细胞。

在末端分化为去核红系细胞之前，使用多种DNA技术，包括例如瞬时或稳定转染和基因治疗方法，将编码一种或多种外源蛋白质的核酸引入红系祖细胞。

病毒基因转移可用于用编码一种或多种外源蛋白质的核酸转染细胞。许多病毒可用作基因转移载体，包括莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、慢病毒如人免疫缺陷病毒1(HIV1)和泡沫病毒如泡沫病毒(参见，例如，Osten等，HEP 178:177-202,2007)。例如，逆转录病毒可有效地转导哺乳动物细胞，包括人细胞，并整合到染色体中，从而使基因转移稳定。

编码一种或多种外源蛋白质的核酸可转染到红系祖细胞中。例如，转染可以在步骤(b)之后进行。在一些实施方案中，转染可以在第二培养基中进行。合适的载体是莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)载体(Malik等，Blood91:2664-2671,1998)。基于MMLV，一种致癌逆转录病毒的载体，目前用于基因治疗临床试验(Hassle等，News Physiol.Sci.17:87-92,2002)。例如，使用标准分子生物学技术，可以在MMLV载体骨架中产生含有编码外源蛋白质的cDNA的DNA构建体。将构建体转染到包装细胞系例如PA317细胞中，并将病毒上清液用于转染生产细胞例如PG13细胞。将PG13病毒上清液与红系祖细胞温育。外源蛋白质的表达可以使用FACS分析(荧光激活细胞分选)来监测，例如，如果外源蛋白质存在于工程化人去核红系细胞的膜上，则使用针对外源蛋白质的荧光标记抗体。可以使用类似的方法，使得外源蛋白质存在于工程化人去核红系细胞的胞质溶胶中。

任选地，可以使用基于病毒的方法将编码荧光示踪分子例如绿色荧光蛋白(GFP)的核酸转染到红系祖细胞中(Tao等，Stem Cells 25:670-678,2007)。使用包装细胞，例如Phoenix-Eco细胞系(由Orbigen,San Diego,Calif.分销)，包装含有编码增强的绿色荧光蛋白(EGFP)或红色荧光蛋白(例如DsRed-Express)的DNA的生态位逆转录病毒载体。包装细胞系稳定表达正确病毒包装所需的病毒蛋白，包括例如gag、pol和env。来自已脱落病毒颗粒的Phoenix-Eco细胞的上清液用于转导红系祖细胞。在某些情况下，可以在特殊包被的表面上进行转导，例如重组纤连蛋白片段，以提高逆转录病毒介导的基因转移的效率(例如RetroNectin,Takara Bio USA,Madison,Wis.)。将细胞在RetroNectin包被的平板中与逆转录病毒Phoenix-Eco上清液加上合适的辅因子一起温育。第二天可以重复转导。在这种情况下，表达EGFP或DsRed-express的红系祖细胞的百分比可以通过FACS来评估。可用于评估转导效率的其他报道基因包括，例如，β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶和荧光素酶，以及低亲和性神经生长因子受体(LNGFR)和人细胞表面CD24抗原(Bierhuizen等，Leukemia 13:605-613,1999)。

非病毒载体可用于将编码一种或多种外源蛋白质的核酸引入红系祖细胞以产生工程化去核红系细胞。许多递送方法可用于将非病毒载体引入红系祖细胞，包括化学和物理方法。

可以使用合成的大分子，如阳离子脂质和聚合物将编码外源蛋白质的非病毒载体引入红系祖细胞(Papapetrou等，Gene Therapy 12:S118-S130,2005)。阳离子脂质体，例如通过电荷相互作用与DNA形成复合物。带正电荷的DNA/脂质复合物结合到阴性细胞表面，并被细胞通过胞吞作用摄取。所述方法可用于，例如转染造血细胞(参见，例如，Keller等，Gene Therapy 6:931-938,1999。对于红系祖细胞，将质粒DNA(在无血清培养基中，例如OptiMEM(Invitrogen,Carlsbad,Calif.))与阳离子脂质体(在无血清培养基中)，例如可商购的转染试剂Lipofectamine

任选地，阳离子聚合物例如聚乙烯亚胺(PEI)可用于有效转染红系祖细胞，例如造血和脐带血衍生的CD34

可以使用物理方法，如颗粒介导的转染、“基因枪”、生物射弹或颗粒轰击技术(Papapapetrou等，Gene Therapy 12:S118-S130,2005)，将质粒载体引入合适的红系祖细胞。在这种情况下，编码外源蛋白质的DNA被吸附到金颗粒上并通过基因枪施用于细胞。该方法可用于例如转染红系祖细胞，例如衍生自脐带血的造血干细胞(参见例如Verma等，Gene Therapy 5:692-699,1998)。这样，分离脐带血并在磷酸盐缓冲盐水中稀释三倍。使用抗CD34单克隆抗体与包被有二抗的磁微珠和磁分离系统(例如Miltenyi MiniMac System,Auburn,Calif.,USA)的组合来纯化CD34

任选地，可以使用电穿孔法将质粒载体引入红系祖细胞。电穿孔在细胞膜中产生瞬时孔，允许将各种分子引入细胞，包括例如DNA和RNA。这样，如本文所述分离和培养CD34

电穿孔可以使用例如ECM 600电穿孔仪(Genetronics,San Diego,Calif.,USA)进行，电压范围为200V至280V，脉冲长度范围为25毫秒至70毫秒。许多替代的电穿孔仪器是可商购的，并且可以用于该目的(例如Gene Pulser Xcell

电穿孔形式的核转染也可用于转染红系祖细胞。在这种情况下，转染是在细胞类型特异性溶液中使用电参数进行的，所述溶液能够使DNA(或其他试剂)直接转运到细胞核，从而降低细胞质中可能的降解的风险。例如，人CD34细胞Nucleofferroctor

红系祖细胞可以用常规表达载体非病毒转染，所述载体不能在哺乳动物细胞中自我复制，除非其整合到基因组中。可选地，可以用游离型载体转染红系祖细胞，该载体可以作为自主复制的遗传单位而持续存在于宿主细胞核中，而不整合到染色体中(Papapetrou等，Gene Therapy 12:S118-S130,2005)。这些载体利用来源于潜伏感染后通常在细胞中染色体外复制的病毒的遗传元件，所述病毒例如EBV、人多瘤病毒BK、牛乳头瘤病毒-1(BPV-1)、单纯疱疹病毒-1(HSV)和猿猴病毒40(SV40)。哺乳动物人工染色体也可用于非病毒基因转移(Vanderbyl等，Exp.Hematol.33:1470-1476,2005)。

编码一种或多种外源蛋白质的外源核酸可通过本领域已知的标准分子生物学方法，例如限制性消化、重叠延伸PCR和Gibson装配组装到表达载体中。

外源核酸可包含编码通常不存在于例如去核红系细胞的细胞表面上的外源蛋白质的基因，该基因与编码内源或天然膜蛋白的基因融合，使得外源蛋白质在细胞表面上表达。例如，编码外源蛋白质的外源基因可克隆在N末端，跟随1型膜蛋白的前导序列，2型膜蛋白的C末端，或GPI连接的膜蛋白的GPI附着位点的上游。

可以使用标准克隆方法在两个融合基因之间引入柔性氨基酸接头。例如，柔性接头是聚甘氨酸-多丝氨酸接头，例如通常用于从全长抗体产生单链抗体片段的[Gly

在一些实施方案中，提供的方法包括将大核酸(特别是RNA，如mRNA)递送到红系祖细胞中，其通过将红系祖细胞与核酸接触，并在有效将核酸递送到细胞的条件下，如本文所述的条件下，通过电穿孔引入核酸。合适的电穿孔仪包括但不限于Bio-Rad GENE PULSER和GENE PULSER II；Life Technologies NEON；BTX GEMINI系统；和MAXCITE电穿孔仪。这些方法不需要病毒递送或使用病毒载体。合适的核酸包括RNA，例如mRNA。合适的核酸进一步包括DNA，包括转座元件、稳定的附加体、质粒DNA或线性DNA。

细胞系例如K562红白血病细胞的电穿孔条件已经在文献中描述，例如VanTendeloo等，Blood 98(l):49-56,2001。用于本文所述方法的合适电穿孔条件包括用于Life Technologies Neon转染系统：其脉冲电压范围为约500至约2000V、约800至约1800V或约850至约1700V；脉冲宽度范围为约5msec至约50msec，或从约10msec至约40msec；和脉冲数范围为1至2个脉冲、1至3个脉冲、1至4个脉冲或1至5个脉冲。

红系祖细胞电穿孔的特别合适的条件包括，例如，4天：a)脉冲电压1300-1400，脉冲宽度：10-20msec，脉冲数：1-3；b)脉冲电压1400，脉冲宽度：10msec，脉冲数：3；c)脉冲电压1400，脉冲宽度：20msec，脉冲数：1；和d)脉冲电压1300，脉冲宽度：10msec，脉冲数：3。

红系祖细胞电穿孔的特别合适的条件包括，例如，8-9天：a)脉冲电压：1400-1600，脉冲宽度：20，脉冲数：1；b)脉冲电压：1100-1300，脉冲宽度：30，脉冲数：1；c)脉冲电压：1000-1200，脉冲宽度：40，脉冲数：1；d)脉冲电压：1100-1400，脉冲宽度：20，脉冲数：2；e)脉冲电压：950-1150，脉冲宽度：30，脉冲数：2；f)脉冲电压：1300-1600，脉冲宽度：10，脉冲数：3.这些条件通常导致至少约60％或更高(例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少约97％或更高)的转染效率，以及至少约70％或更高(例如至少约75％、80％、85％、90％、95％或至少约97％或更高)的细胞活力。

在分化条件下电穿孔培养的红系祖细胞的特别合适的条件包括，例如12-13天：a)脉冲电压：1500-1700，脉冲宽度：20，脉冲数：1；和b)脉冲电压：1500-1600，脉冲宽度：10，脉冲数：3.这些条件通常导致至少约50％或更高(例如至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少约97％或更高)的转染效率，以及至少约70％或更高(例如至少约75％、80％、85％、90％、95％或至少约97％或更高)的细胞活力。

本领域普通技术人员可容易地调整本文参照Life Technologies Neon系统所公开的条件，以仅用常规实验来适配不同的电穿孔仪和/或不同的电穿孔仪，并且本文所述的具体电穿孔仪不限于所公开的方法。

在一些实施方案中，使用本文所述的电穿孔条件，对培养的红系祖细胞进行第一次电穿孔，然后培养所需的时间段(任选地在分化条件下)，然后进行第二次电穿孔。在一些实施方案中，对培养的红系祖细胞进行第一次电穿孔，然后培养所需的时间(任选地在分化条件下)，然后进行第二次、第三次、第四次、第五次或第六次再电穿孔。任选地，可以改变第一次和第二次、第二次和第三次等电穿孔之间的培养时段。例如，电穿孔之间的时段可以根据需要进行调整，例如，该时段可以是30分钟、1小时、6小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、48小时、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或21天。例如，红系祖细胞可以在第1和2天、第1和3天、第1和4天、第1和5天、第1和6天、第1和7天、第1和8天、第1和9天、第1和10天、第1和11天、第1和12天、第1和13天、第1和14天、第1和15天、或第1和16天进行电穿孔。在另一个实例中，细胞可以在第2天和第3天、第2天和第4天、第2天和第5天、第2天和第6天、第2天和第7天、第2天和第8天、第2天和第9天、第2天和第10天、第2天和第11天、第2天和第12天、第2天和第13天、第2天和第14天、第2天和第15天、或第2天和第16天进行电穿孔。在另一个实例中，红系祖细胞可以在第3和4天、第3和5天、第3和6天、第3和7天、第3和8天、第3和9天、第3和10天、第3和11天、第3和12天、第3和13天、第3和14天、第3和15天、或第3和16天进行电穿孔。在另一个实例中，细胞可以在第4和5天、第4和6天、第4和7天、第4和8天、第4和9天、第4和10天、第4和11天、第4和12天、第4和13天、第4和14天、第4和15天、或第4和16天进行电穿孔。在另一个实例中，细胞可以在第5天和第6天、第5天和第7天、第5天和第8天、第5天和第9天、第5天和第10天、第5天和第11天、第5天和第12天、第5天和第13天、第5天和第14天、第5天和第15天、或第5天和第16天进行电穿孔。在另一个实例中，红系祖细胞可以在第6和7天、第6和8天、第6和9天、第6和10天、第6和11天、第6和12天、第6和13天、第6和14天、第6和15天、或第6和16天进行电穿孔。在另一个实例中，红系祖细胞可以在第7和8天、7和9天、7和10天、7和11天、7和12天、7和13天、7和14天、7和15天、或7和16天进行电穿孔。在另一个实例中，红系祖细胞可以在第8和9天、第8和10天、第8和11天、第8和12天、第8和13天、第8和14天、第8和15天、或第8和16天进行电穿孔。在另一个实例中，红系祖细胞可以在第9和10、9和11、9和12、9和13、9和14、9和15、或9和16天进行电穿孔。在另一个实例中，红系祖细胞可以在第10和11天、第10和12天、第10和13天、第10和14天、第10和15天、或第10和16天进行电穿孔。在另一个实例中，红系祖细胞可以在第11和12天、第11和13天、第11和14天、第11和15天、或第11和16天进行电穿孔。在另一个实例中，红系祖细胞可以在第12和13天、第12和14天、第12和15天、或第12和16天进行电穿孔。在另一个实例中，红系祖细胞可以在第13和14天、第13和15天、或第13和16天进行电穿孔。在另一个实例中，红系祖细胞可以在第14和15天，或第14和16天进行电穿孔。任选地，红系祖细胞可以被电穿孔超过两次，例如三次、四次、五次或六次，并且间隔可以根据需要在细胞分化过程的任何点选择。

在一些实施方案中，使用本文所述的电穿孔条件，在分化的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16天对培养的红系祖细胞进行电穿孔。

在一些实施方案中，工程化去核红系细胞可以是点击缀合的工程化去核红系细胞。催化键形成多肽域可以在例如红系祖细胞上或其中表达，存在于胞质溶胶中或存在于膜上。存在许多催化键形成多肽，包括转肽酶、分选酶和异肽酶，包括源自Spy0128的那些多肽，是分离自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的蛋白质。已经证明，裂解Spy0128的自催化的异肽键形成亚基(CnaB2结构域)产生两个不同的多肽，它们保留了彼此具有特异性的催化活性。该系统中的多肽被称为SpyTag和SpyCatcher。在混合后，SpyTag和SpyCatcher在SpyTag上的Aspl17和SpyCatcher上的Lys31之间经历异肽键形成(Zakeri和Howarth，JACS 132:4526,2010)。该反应与细胞环境相容，并且对蛋白质/肽缀合具有高度特异性(Zakeri等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109:E690-E697,2012)。SpyTag和SpyCatcher已经显示指导弹性蛋白样蛋白的翻译后拓扑修饰。例如，将SpyTag放置到N末端，将SpyCatcher放置到C末端，指导环状弹性蛋白样蛋白的形成(Zhang等，J.Am.Chem.Soc.2013)。

组分SpyTag和SpyCatcher可以互换，使得分子A与SpyTag融合，分子B与SpyCatcher融合的体系功能上等价于分子A与SpyCatcher融合，分子B与SpyTag融合的体系。为了本公开的目的，当使用SpyTag和SpyCatcher时，应当理解互补分子可以在其位置上被取代。

催化键形成多肽，如SpyTag/SpyCatcher系统，可用于将外源蛋白质附着于例如红系祖细胞或去核红系细胞的表面。SpyTag多肽序列可以在红系祖细胞或去核红系细胞的细胞外表面表达。例如，SpyTag多肽可以与1型或3型跨膜蛋白如血型糖蛋白A的N末端融合，与2型跨膜蛋白如Kell的C末端融合，框内插入在细胞外末末端或多程跨膜蛋白如Band 3的细胞外环中，与GPI受体多肽如CD55或CD59融合，与脂质链锚定多肽融合，或与外周膜蛋白融合。外源蛋白质可与SpyCatcher融合。编码SpyCatcher融合物的核酸可以表达并分泌自表达SpyTag融合物的相同的红系祖细胞或去核红系细胞。可选地，编码SpyCatcher融合体的核酸序列可以外源产生，例如在细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或无细胞生产系统中。在SpyTag和SpyCatcher多肽反应时，形成共价键，其将外源蛋白质连接到红系祖细胞或去核红系细胞的表面。

在一个实施方案中，SpyTag多肽可以在红系细胞中在Gatal启动子控制下与血型糖蛋白A的N末端融合表达。融合到SpyCatcher多肽序列的外源蛋白质可以在Gatal启动子的控制下在同一红系细胞中表达。在表达两种融合多肽时，在SpyTag和SpyCatcher多肽之间将形成异肽键，在红系细胞表面和外源蛋白质之间形成共价键。

在另一个实施方案中，SpyTag多肽可以在红系祖细胞或去核红系细胞中在Gatal启动子控制下与血型糖蛋白A的N末端融合表达。融合到SpyCatcher多肽序列上的外源蛋白质可以在合适的哺乳动物细胞表达系统中表达，例如HEK293细胞。在红系祖细胞或去核红系细胞上表达SpyTag融合多肽后，可以使SpyCatcher融合多肽与细胞接触。在合适的反应条件下，在SpyTag和SpyCatcher多肽之间形成异肽键，在红系祖细胞表面或去核红系细胞表面和外源蛋白质之间形成共价键。

催化键形成多肽，如SpyTag/SpyCatcher系统，可用于将外源蛋白质锚定到红系祖细胞或去核红系细胞的胞内空间。SpyTag多肽序列可以通过许多方法在红系祖细胞或去核红系细胞的胞内空间中表达，包括直接表达转基因、与内源胞内蛋白如血红蛋白融合、与内源性细胞表面蛋白的胞内结构域如Band 3、血型糖蛋白A、Kell融合、或与细胞骨架的结构组分融合。SpyTag序列不限于多肽末端，也可以整合到内源多肽的内部序列中，以便多肽的翻译和定位不被干扰。外源蛋白质可与SpyCatcher融合。编码SpyCatcher融合物的核酸序列可以在表达SpyTag融合物的相同的红系祖细胞或去核红系细胞中表达。在SpyTag和SpyCatcher多肽反应时，形成共价键，其作用是将外源蛋白质锚定在红系祖细胞或去核红系细胞的胞内空间中。

在一个实施方案中，红系祖细胞或去核红系细胞包括细胞内融合血红蛋白β的SpyTag。红系祖细胞可以用包括血红蛋白启动子、β珠蛋白基因和SpyTag序列的基因序列进行遗传修饰，以便在翻译后，细胞内β珠蛋白在C末端与SpyTag融合。此外，红系祖细胞或去核红系细胞表达Gatal启动子引导的基因，该基因编码SpyCatcher，驱动外源多肽的表达，从而在翻译后，外源多肽融合到SpyCatcher的N末端。在表达两种融合蛋白时，结合SpyTag的β珠蛋白通过异肽键与结合SpyCatcher的外源多肽在胞内空间连接，使外源多肽锚定于β珠蛋白并在成熟过程中保留。

在另一个实施方案中，SpyTag多肽可以在红系祖细胞或去核红系细胞中表达为与外源蛋白质的融合物。SpyCatcher多肽可以在相同的红系祖细胞或去核红系细胞中表达为与血型糖蛋白A的C末端(细胞内)的融合物。在表达两种融合多肽时，在SpyTag和SpyCatcher多肽之间将形成异肽键，在膜锚定的内源性红系多肽和外源性蛋白之间形成共价键。

其他分子融合可在多肽之间形成，包括直接或间接缀合。多肽可以直接彼此缀合或通过接头间接缀合。连接物可以是肽、聚合物、适体或核酸。聚合物可以是例如天然的、合成的、线性的或支化的。外源蛋白质可包含异源融合蛋白，所述异源融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，其中所述融合蛋白包含彼此直接连接的多肽或在一端或两端具有间插接头序列和/或其他序列的多肽。与接头的缀合可以通过共价键或离子键。

在一些实施方案中，工程化去核红系细胞是已经被低渗加载的人去核红系细胞。对于低渗加载/裂解，将红系祖细胞或去核红系细胞暴露于低离子强度缓冲液，使它们破裂。外源蛋白质分布在细胞内。通过向分离的去核红系细胞沉淀中添加30-50倍体积过量的5mM磷酸盐缓冲液(pH 8)，可以将去核红系细胞或红系祖细胞进行低渗裂解。通过离心分离所得裂解的细胞膜。将裂解的细胞膜的沉淀重悬，并在外源蛋白质存在下在低离子强度缓冲液中温育例如30分钟。可选地，裂解的细胞膜可与外源蛋白质温育少至一分钟或长至几天，这取决于确定有效加载去核红系细胞或红系祖细胞的最佳条件。对于编码一种或多种外源蛋白质(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性外源蛋白质)的核酸的低渗加载，可将核酸悬浮于低渗Tris-HCl溶液(PH 7.0)中并注射到红系祖细胞中。Tris-HCl的浓度可以是约20mmol/l至约150mmol/l，这取决于确定的有效加载去核红系细胞的最佳条件。

可选地，可以用低渗溶液进行控制透析，使细胞膨胀并在细胞膜上产生孔，从而使红系祖细胞或去核红系细胞负载外源蛋白质(参见，例如美国专利4,327,710；5,753,221；6,495,351和10,046,009)。例如，将细胞沉淀重悬于10mM HEPES、140mM NaCl、5mM葡萄糖pH7.4中，并用低离子强度缓冲液透析，所述低离子强度缓冲液含有10mM NaH

分离和配制去核红系细胞

在一些实施方案中，本文提供的方法可进一步包括(e)从步骤(d)中的第三细胞培养物分离工程化去核红系细胞群体。工程化去核红系细胞可以使用本领域已知的方法分离，例如但不限于离心(例如密度梯度离心)、FACS和MACS。在一些实施方案中，本文提供的方法进一步包括(f)配制步骤(e)中分离的工程化去核红系细胞群体。在一些实施方案中，配制工程化去核红系细胞群体可以包括将分离的工程化去核红系细胞群体与一种或多种药学上可接受的缓冲液或赋形剂(例如磷酸盐缓冲盐水)混合。

在一些实施方案中，工程化去核红系细胞群体被配制成适于储存、运输和/或施用细胞给受试者的组合物(例如，药物组合物)。在一些实施方案中，本文提供的方法进一步包括将步骤(f)中配制的工程化去核红系细胞群体施用于有需要的受试者(例如，先前鉴定或诊断为需要工程化去核红系细胞中存在的一种或多种外源蛋白质的受试者，或鉴定为需要输血和/或红细胞增加的受试者)。在这些方法的一些实施方案中，受试者先前已被鉴定或诊断为需要存在于施用的工程化去核红系细胞中的一种或多种外源蛋白质。在这些方法的一些实施方案中，通过静脉内施用于受试者来施用配制的工程化去核红系细胞群体。

组合物

本文还提供了通过本文所述的任何方法产生的去核红系细胞群体。本文还提供了包括通过本文所述的任何方法产生的任何去核红系细胞群体的组合物。本文还提供了通过本文所述的任何方法产生的制剂(例如，药物组合物)。在一些实施方案中，制剂适于静脉内施用至受试者(例如，本文所述的任何受试者)。在本文所述的任何组合物或制剂的一些实施方案中，所述组合物或制剂是本文所述的任何去核红系细胞的剂型。

试剂盒

本文还提供了试剂盒，其包括本文提供的任何组合物、制剂或去核红系细胞群体。本文还提供了包括一个或多个无菌器皿的试剂盒，所述器皿含有本文所述的任何组合物、制剂或去核红系细胞群体(例如，无菌锥形管、无菌培养皿、无菌小瓶(例如硼硅酸盐玻璃小瓶)和无菌塑料袋(邻苯二甲酸二-2-乙基己基酯(DEHP)-增塑聚氯乙烯(PVC)袋，或柠檬酸正丁酰基-三(正己基)-柠檬酸酯(BTHC)-增塑PVC袋)。在一些实施方案中，本文提供的任何试剂盒可以进一步包括用于将本文描述的任何组合物、制剂或去核红系细胞群体施用于有需要的受试者的说明书。

本文所述的试剂盒的一些实施方案包括本文所述的任何组合物、制剂和去核红系细胞群体的合适的单一剂型。例如，本文所述的任何组合物或制剂的单一剂型的体积可为例如约0.5mL至约2L、约0.5mL至约1800mL、约0.5mL至约1500mL、约0.5mL至约1200mL、约0.5mL至约1000mL、约0.5mL至约800mL、约0.5mL至约600mL、约0.5mL至约500mL、约0.5mL至约450mL、约0.5mL至约400mL、约0.5mL至约350mL、约0.5mL至约300mL、约0.5mL至约250mL、约0.5mL至约200mL、约0.5mL至约180mL、约0.5mL至约160mL、约0.5mL至约140mL、约0.5mL至约120mL、约0.5mL至约100mL、约0.5mL至约80mL、约0.5mL至约60mL、约0.5mL至约40mL、约0.5mL至约20mL、约0.5mL至约10mL、约0.5mL至约5mL、约0.5mL至约1.0mL、约1.0mL至约2L、约1.0mL至约1800mL、约1.0mL至约1500mL、约1.0mL至约1200mL、约1.0mL至约1000mL、约1.0mL至约800mL、约1.0mL至约600mL、约1.0mL至约500mL、约1.0mL至约450mL、约1.0mL至约400mL、约1.0mL至约350mL、约1.0mL至约300mL、约1.0mL至约250mL、约1.0mL至约200mL、约1.0mL至约180mL、约1.0mL至约160mL、约1.0mL至约140mL、约1.0mL至约120mL、约1.0mL至约100mL、约1.0mL至约80mL、约1.0mL至约60mL、约1.0mL至约40mL、约1.0mL至约20mL、约1.0mL至约10mL、约1.0mL至约5mL、约5mL至约2L、约5mL至约1800mL、约5mL至约1500mL、约5mL至约1200mL、约5mL至约1000mL、约5mL至约800mL、约5mL至约600mL、约5mL至约1800mL、约5mL至约500mL、约5mL至约450mL、约5mL至约400mL、约5mL至约350mL、约5mL至约300mL、约5mL至约250mL、约5mL至约200mL、约5mL至约180mL、约5mL至约160mL、约5mL至约140mL、约5mL至约120mL、约5mL至约100mL、约5mL至约80mL、约5mL至约60mL、约5mL至约40mL、约5mL至约20mL、约5mL至约10mL、约10mL至约2L、约10mL至约1800mL、约10mL至约1500mL、约10mL至约1200mL、约10mL至约1000mL、约10mL至约800mL、约10mL至约600mL、约10mL至约500mL、约10mL至约450mL、约10mL至约400mL、约10mL至约350mL、约10mL至约300mL、约10mL至约250mL、约10mL至约200mL、约10mL至约180mL、约10mL至约160mL、约10mL至约140mL、约10mL至约120mL、约10mL至约100mL、约10mL至约80mL、约10mL至约60mL、约10mL至约40mL、约10mL至约20mL、约20mL至约2L、约20mL至约1800mL、约20mL至约1500mL、约20mL至约1200mL、约20mL至约1000mL、约20mL至约800mL、约20mL至约600mL、约20mL至约500mL、约20mL至约450mL、约20mL至约400mL、约20mL至约350mL、约20mL至约300mL、约20mL至约250mL、约20mL至约200mL、约20mL至约180mL、约20mL至约160mL、约20mL至约140mL、约20mL至约120mL、约20mL至约100mL、约20mL至约80mL、约20mL至约60mL、约20mL至约40mL、约40mL至约2L、约40mL至约1800mL、约40mL至约1500mL、约40mL至约1200mL、约40mL至约1000mL、约40mL至约800mL、约40mL至约600mL、约40mL至约500mL、约40mL至约450mL、约40mL至约400mL、约40mL至约350mL、约40mL至约300mL、约40mL至约250mL、约40mL至约200mL、约40mL至约180mL、约40mL至约160mL、约40mL至约140mL、约40mL至约120mL、约40mL至约100mL、约40mL至约80mL、约40mL至约60mL、约60mL至约2L、约60mL至约1800mL、约60mL至约1500mL、约60mL至约1200mL、约60mL至约1000mL、约60mL至约800mL、约60mL至约600mL、约60mL至约500mL、约60mL至约450mL、约60mL至约400mL、约60mL至约350mL、约60mL至约300mL、约60mL至约250mL、约60mL至约200mL、约60mL至约180mL、约60mL至约160mL、约60mL至约140mL、约60mL至约120mL、约60mL至约100mL、约60mL至约80mL、约80mL至约2L、约80mL至约1800mL、约80mL至约1500mL、约80mL至约1200mL、约80mL至约1000mL、约80mL至约800mL、约80mL至约600mL、约80mL至约500mL、约80mL至约450mL、约80mL至约400mL、约80mL至约350mL、约80mL至约300mL、约80mL至约250mL、约80mL至约200mL、约80mL至约180mL、约80mL至约160mL、约80mL至约140mL、约80mL至约120mL、约80mL至约100mL、约100mL至约2L、约100mL至约1800mL、约100mL至约1500mL、约100mL至约1200mL、约100mL至约1000mL、约100mL至约800mL、约100mL至约600mL、约100mL至约500mL、约100mL至约450mL、约100mL至约400mL、约100mL至约350mL、约100mL至约300mL、约100mL至约250mL、约100mL至约200mL、约100mL至约180mL、约100mL至约160mL、约100mL至约140mL、约100mL至约120mL、约120mL至约2L、约120mL至约1800mL、约120mL至约1500mL、约120mL至约1200mL、约120mL至约1000mL、约120mL至约800mL、约120mL至约600mL、约120mL至约500mL、约120mL至约450mL、约120mL至约400mL、约120mL至约350mL、约120mL至约300mL、约120mL至约250mL、约120mL至约200mL、约120mL至约180mL、约120mL至约160mL、约120mL至约140mL、约140mL至约2L、约140mL至约1800mL、约140mL至约1500mL、约140mL至约1200mL、约140mL至约1000mL、约140mL至约800mL、约140mL至约600mL、约140mL至约500mL、约140mL至约450mL、约140mL至约400mL、约140mL至约350mL、约140mL至约300mL、约140mL至约250mL、约140mL至约200mL、约140mL至约180mL、约140mL至约160mL、约160mL至约500mL、约160mL至约450mL、约160mL至约400mL、约160mL至约350mL、约160mL至约300mL、约160mL至约250mL、约160mL至约200mL、约160mL至约180mL、约180mL至约2L、约180mL至约1800mL、约180mL至约1500mL、约180mL至约1200mL、约180mL至约1000mL、约180mL至约800mL、约180mL至约600mL、约180mL至约500mL、约180mL至约450mL、约180mL至约400mL、约180mL至约350mL、约180mL至约300mL、约180mL至约250mL、约180mL至约200mL、约200mL至约2L、约200mL至约1800mL、约200mL至约1500mL、约200mL至约1200mL、约200mL至约1000mL、约200mL至约800mL、约200mL至约600mL、约200mL至约500mL、约200mL至约450mL、约200mL至约400mL、约200mL至约350mL、约200mL至约300mL、约200mL至约250mL、约250mL至约2L、约250mL至约1800mL、约250mL至约1500mL、约250mL至约1200mL、约250mL至约1000mL、约250mL至约800mL、约250mL至约600mL、约250mL至约500mL、约250mL至约450mL、约250mL至约400mL、约250mL至约350mL、约250mL至约300mL、约300mL至约2L、约300mL至约1800mL、约300mL至约1500mL、约300mL至约1200mL、约300mL至约1000mL、约300mL至约800mL、约300mL至约600mL、约300mL至约500mL、约300mL至约450mL、约300mL至约400mL、约300mL至约350mL、约350mL至约2L、约350mL至约1800mL、约350mL至约1500mL、约350mL至约1200mL、约350mL至约1000mL、约350mL至约800mL、约350mL至约600mL、约350mL至约500mL、约350mL至约450mL、约350mL至约400mL、约400mL至约2L、约400mL至约1800mL、约400mL至约1500mL、约400mL至约1200mL、约400mL至约1000mL、约400mL至约800mL、约400mL至约600mL、约400mL至约500mL、约400mL至约450mL、约450mL至约2L、约450mL至约1800mL、约450mL至约1500mL、约450mL至约1200mL、约450mL至约1000mL、约450mL至约800mL、约450mL至约600mL、约450mL至约500mL、约500mL至约2L、约500mL至约1800mL、约500mL至约1500mL、约500mL至约1200mL、约500mL至约1000mL、约500mL至约800mL、约500mL至约600mL、约600mL至约2L、约600mL至约1800mL、约600mL至约1500mL、约600mL至约1200mL、约600mL至约1000mL、约600mL至约800mL、约800mL至约2L、约800mL至约1800mL、约800mL至约1500mL、约800mL至约1200mL、约800mL至约1000mL、约1000mL至约2L、约1000mL至约1800mL、约1000mL至约1500mL、约1000mL至约1200mL、约1200mL至约2L、约1200mL至约1800mL、约1200mL至约1500mL、约1500mL至约2L、约1500mL至约1800mL、或约1800mL至约2L。

治疗受试者的方法

本文还提供了治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本文所述的任何组合物、制剂或去核红系细胞群体。在一些实施方案中，施用通过静脉内施用进行。

本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括向受试者施用一种或多种另外的治疗剂。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的治疗剂可以与本文提供的任何组合物基本上同时施用于受试者。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的治疗剂可以在向受试者施用本文所述的任何组合物之前或之后施用于受试者。

实施例

在以下实施例中进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。

实施例1：单独的或与肌-肌醇联用的亚牛磺酸对红系细胞生长和去核的作用

检测了单独的或与肌-肌醇联用的亚牛磺酸对红系祖细胞培养物的作用。人CD34

第三培养基补充有(a)1.0g/L亚牛磺酸，(b)1.0g/L亚牛磺酸和1.0g/L肌-肌醇，或者(c)作为对照，没有添加亚牛磺酸或肌-肌醇。值得注意的是，第一培养基、第二培养基和第三培养基包含含有0.0072g/L肌-肌醇的基础培养基(即IMDM)。在第三阶段期间使用基于荧光激活细胞分选的细胞计数器进行周期性取样和细胞计数。

如图1和图2所示，发现与对照培养条件相比，当将亚牛磺酸单独添加第三细胞培养基中时，显著增加了红系细胞的总细胞密度(图1)以及去核红系细胞密度(图2)。类似地，与对照培养条件相比，用牛磺酸(亚牛磺酸的氧化产物)补充第三培养基也导致了红系细胞的总细胞密度和去核红系细胞密度的显著增加(数据未显示)。此外，与对照培养条件相比，用亚牛磺酸和肌-肌醇补充第三细胞培养基进一步显着增加了红系细胞的总细胞密度(图1)以及去核红系细胞密度(图2)。这些数据表明，单独的和与肌-肌醇联合的亚牛磺酸提高了成熟期红系细胞生长和分裂的能力，并提高了去核红系细胞的产量。

其他实施方案

应当理解，尽管已经结合本发明的详细描述对本发明进行了描述，但是前面的描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求书的范围内。

序列表

<110> Rubius Therapeutics, Inc.

<120> 使用牛磺酸或亚牛磺酸产生去核红系细胞的方法

<130> 47472-0012WO1

<150> 62/930,528

<151> 2019-11-04

<160> 4

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> EPO模拟肽

<400> 1

Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys

1 5 10 15

Pro Gln Gly Gly

20

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> EPO模拟肽

<400> 2

Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys

1 5 10

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 接头

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 4

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 接头

<400> 4

Ala Gly Ser Thr

1