确定PTEN拷贝数量的方法

优先权要求

本申请要求于2020年1月7日提交的临时US 62/957,913的优先权，其内容通过引用以其全文特此并入。

背景技术

PTEN（10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物）是一种肿瘤抑制因子，其在多种人类癌症中发生突变或缺失，包括乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、脑癌、皮肤癌、甲状腺癌、肺癌、膀胱癌和结肠癌，以及黑色素瘤、胶质母细胞瘤和淋巴瘤。事实上，PTEN是癌症中最常见的突变肿瘤抑制基因之一。PTEN是一种修饰蛋白质和脂质的磷酸酶。与大多数磷酸酶不同，PTEN的主要底物是通过激活磷酸肌醇3激酶（PI3K）生成的肌醇磷脂。PI3K生成的肌醇磷脂导致Akt、mTOR的下游激活，并最终导致细胞存活和蛋白质翻译。因此，PTEN是PI3K/Akt信号传导的重要负调节因子，并且在肿瘤抑制中起关键作用。在肿瘤发展期间，PTEN发生突变和缺失，使其酶活性失活，从而导致细胞增殖增加和细胞死亡减少。PTEN突变在癌症中的流行强调了识别PTEN基因变化情况的重要性。

PTEN拷贝数量的减少可反映PTEN表达和/或酶活性的丧失。大多数确定PTEN拷贝数量的方法一次仅考虑一个基因座，因此可能无法准确反映除了所研究基因座以外的其他基因座的缺失。相应地，需要确定PTEN拷贝数量的改进的方法。

发明内容

在一个方面，确定来自受试者的样品中PTEN拷贝数量的方法包括：通过数字PCR同时扩增三个或更多个PTEN基因座和两个或更多个参考基因；计算PTEN扩增与参考基因扩增的比率；以及基于该比率确定该样品的PTEN拷贝数量。

PTEN扩增的比率可以是以下比率：所有PTEN拷贝的浓度除以扩增的PTEN基因座的数量与所有参考基因拷贝的浓度除以扩增的参考基因的数量的比率。

PTEN扩增的比率可以是以下比率：单个PTEN基因座的拷贝的浓度与单个参考基因的拷贝的浓度的比率。在一些实施例中，该方法进一步包括确定以下比率：每种单个PTEN基因座的拷贝的浓度与每种单个参考基因的拷贝的浓度的比率。

PTEN拷贝数量可以是该比率的两倍。

该三个或更多个PTEN基因座可以包括内含子2、内含子3和内含子6中的至少两个。该三个或更多个PTEN基因座可以包括内含子2、内含子3和内含子6，以及任选地一个或多个另外的PTEN基因座。

在一些实施例中，该方法可以进一步包括确定以下比率：第一参考基因的拷贝的浓度与第二参考基因的拷贝的浓度的比率。

在一些实施例中，该方法可以进一步包括用非肿瘤来源的相应样品稀释一部分样品。

样品可以包括新鲜冷冻的肿瘤组织。样品可以包括无细胞DNA。样品可以包括福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤或疑似肿瘤组织。

参考基因可以包括B3GNT2、ERCC3、OR5T1、RUFY2和CC2D1B中的至少一个。

根据说明书和附图并且根据权利要求书，其他特征、目标和优点将是清楚的。

附图说明

图1A.1 ng输入时的类群形成的实例。图底部的每个圆圈代表含有唯一参考基因基因座的液滴，在此测定中，存在两个靶向的参考基因基因座。图左侧的三个圆圈中的每一个代表含有PTEN基因座的液滴。圆圈外的液滴含有来自多于一个基因座的靶标。

图1B.更高输入（大约5 ng）时的类群形成的实例。

具体实施方式

本文描述了通过同时测量样品中的多于一个（例如两个或更多个）PTEN基因座来确定PTEN拷贝数量的方法。通过同时测量多个PTEN基因座，本发明方法正确识别可能在其他情况下会被忽视的PTEN缺失情况，并且本发明方法可以更精确地对PTEN缺失程度进行量化。这些方法也适用于多种样品来源，包括新鲜冷冻的组织、无细胞DNA和福尔马林固定的石蜡包埋的（FFPE）组织样品。

源自血浆的患者样品具有非常低的循环游离DNA（cfDNA）产量。通常，必须将整个DNA样品添加到下一代测序（NGS）文库反应中。此外，相对于正常情况下在血浆样品中发现的cfDNA，源自肿瘤的DNA（ctDNA）通常以更小的比例存在。由于这些会引起混淆的因素，检测血浆中的基因缺失变得非常具有挑战性。利用例如ddPCR等技术进行正交确认有利于确保NGS所检测拷贝数量结果的准确性。

在实施例中，将数字PCR（例如，ddPCR）用于在单个实验中同时扩增多于一个PTEN基因座。然后量化扩增的材料，其中量化指示拷贝数量。值得注意的是，扩增和量化是逐个基因座进行的，因此拷贝数量是在每个基因座处独立测量的。因此，仅影响一个基因座的变化可以与影响多个基因座的那些变化区分开来。

在一些实施例中，将ddPCR用于扩增和量化PTEN基因座。ddPCR允许同时扩增多个基因座，并且独立检测每个基因座。此外，来自同一样品的一个或多个参考基因也与PTEN基因座同时扩增和量化。选择具有已知和稳定拷贝数量的参考基因，从而提供PTEN拷贝数量的变化的比较。此外，测量的一个或多个参考基因的差异可能表明样品具有高度的基因组不稳定性。

在一些实施例中，将扩增材料的量化表示为每单位体积靶标DNA的拷贝的浓度。然后可以比较PTEN基因座的拷贝和参考基因的拷贝的测量浓度，从而得出样品中的PTEN拷贝数量（CN）。

在一些实施例中，将所有PTEN基因座的总浓度与一个或多个参考基因的总浓度进行比较，从而确定PTEN拷贝数量。例如，当使用三个PTEN基因座和两个参考基因时，

PTEN CN = ((PTEN浓度(个拷贝/µL)/3)/(参考基因浓度(个拷贝/µL)/2))*2

在一些实施例中，将每个PTEN基因座的浓度与一个或多个参考基因的浓度进行比较，从而确定PTEN拷贝数量。在一些实施例中，将每个PTEN基因座的浓度与一个或多个参考基因中的每一个的浓度进行比较，从而确定PTEN拷贝数量。这项技术提供了对每个基因座的拷贝数量的独立测量。例如，当使用三个PTEN基因座和两个参考基因时，

PTEN (基因座1) CN = ((PTEN基因座1浓度(个拷贝/µL))/(参考基因1浓度(个拷贝/µL))*2

PTEN (基因座1) CN = ((PTEN基因座1浓度(个拷贝/µL))/(参考基因2浓度(个拷贝/µL))*2

PTEN (基因座2) CN = ((PTEN基因座2浓度(个拷贝/µL))/(参考基因1浓度(个拷贝/µL))*2

PTEN (基因座2) CN = ((PTEN基因座2浓度(个拷贝/µL))/(参考基因2浓度(个拷贝/µL))*2

PTEN (基因座3) CN = ((PTEN基因座3浓度(个拷贝/µL))/(参考基因1浓度(个拷贝/µL))*2

PTEN (基因座3) CN = ((PTEN基因座3浓度(个拷贝/µL))/(参考基因2浓度(个拷贝/µL))*2

例如，作为内部对照，可以将第一参考基因的拷贝浓度与一个或多个另外的参考基因的拷贝浓度进行比较，

((参考基因1浓度(个拷贝/µL))/(参考基因2浓度(个拷贝/µL))*2

参考基因中存在30%或更大变异的样品可能表明基因组不稳定性。在这种情况下，可以使用不同的参考基因重复实验。

在一些实施例中，PTEN基因座可以包括内含子2、内含子3和内含子6。PTEN基因座可以是内含子2、内含子3和内含子6中的两个或更多个。参考基因可以包括B3GNT2、ERCC3、OR5T1、RUFY2和CC2D1B。

在一些实施例中，样品为肿瘤来源或疑似肿瘤来源。肿瘤来源或疑似肿瘤来源的样品可以任选地与非肿瘤来源的匹配样品进行比较。

在样品为FFPE组织的一些实施例中，可以使用反映不同水平FFPE损伤（轻度、中度、重度）的对照来比较测试样品。

实例

以下实例是说明性的，并非旨在限制。其他实施例在以下权利要求的范围内。

方法

由于源自癌症患者的样品可能存在基因组不稳定性，因此进行了分析，从而识别不同癌症适应证中的几个稳定基因，用作正常参考。基因组稳定性被描述为源自NGS测试的拷贝数量估计值中的二倍体百分比（显示两个拷贝）。将这些基因按二倍体百分比得分排序，从而提供用于参考基因的最佳候选基因。对几个基因进行了测试，发现它们是适合的候选基因，如表1所示。

表1.用于PTEN拷贝数量测定的参考基因的列表

基因 染色体

ERCC3 2

OR5T1 11

RUFY2 10

B3GNT2 2

CC2D1B 1。

PTEN基因座的选择是通过分析cBio数据库中可用的拷贝数量数据来确定的。简而言之，分析了确诊PTEN丧失患者的数据，用于探针选择。选择PTEN丧失率高的区域。由于在所有患者数据中未发现一个区域被缺失，因此选择了三个不同基因座的组合，从而将测定的临床敏感性最大化。通过比较靶向的PTEN基因座的染色体坐标与数据集中区段文件的染色体坐标，发现这种设计将可能检测到数据集内99.3%（731/736）报告样品中的丧失。

将测试样品稀释至0.2 ng/µL，这将导致总共1 ng输入到反应中。使用泊松统计（Poisson statistics），输入1 ng应给出大多数液滴含有一个靶标的分布。将输入浓度操纵至每个液滴仅含有一个靶标，这理论上将增强类群分离，从而使分析更有效（见图1A和1B）。

图1A示出了1 ng输入时的类群形成的实例，注意到双占据液滴的数量是最小的。每个蓝色圆圈代表含有唯一PTEN基因座的液滴，在此测定中存在三个靶向的PTEN基因座。每个绿色圆圈代表含有唯一参考基因基因座的液滴，在此测定中，存在两个靶向的参考基因基因座。圆圈外的液滴含有来自多于一个基因座的靶标。图1B示出了更高输入（大约5ng）时的类群形成的实例，注意到双占据液滴的数量增加，这可能会使类群的划分混淆。

将表2中列出的组分混合在一起，并且通过涡旋充分混合。正向和反向引物的初始浓度均为9 uM，每个探针的初始浓度均为5 uM。将每个PTEN基因座（FAM通道）或参考基因座（HEX通道）的输入体积差异用于产生信号幅度差异，该信号幅度差异在类群之间产生分离。反应总体积为22 µL，但是液滴生成步骤仅使用20 µL（将剩余2 µL视为死体积）。

表2.PTEN拷贝数量测定的主混合物组分

使用伯乐公司（BIO-RAD）自动液滴发生器进行液滴生成。在此步骤期间，遵循制造商的建议。此步骤的输出为40 µL体积，含有大约20,000个液滴。

在将测试样品已经分成液滴后，进行反应的扩增。表3概述了用于PTEN拷贝数量测定的热循环参数。

表3.PTEN拷贝数量测定的热循环参数

使用伯乐公司QX200液滴读取器对单个液滴进行查询。来自这些读取的数据用于结果调用。

实例1

通过ddPCR，在三个PTEN基因座和两个参考基因（B3GNT2和ERCC3）处测定肿瘤样品（FFPE）。样品在100%浓度下进行测定，并且在用非肿瘤材料稀释时重复。初始肿瘤细胞率为70%。表4总结了结果：

表4：说明性CN确定

*预测的PTEN丧失

**不确定。

实例2

在氟维司群（fulvestrant）和卡帕塞替尼（capivasertib）的I期试验期间，从ER

收集时，通过下一代测序（NGS）分析组织样品的PTEN状态。通过用iCHOR CNA进行低通量全基因组测序（LP-WGS）分析；并且分别通过本文所述的ddPCR，对血浆（ctDNA）样品进行PTEN状态分析。结果汇总在表5中。

表5

*可能不脱落。

表5显示，通过ctDNA LP-WGS对PTEN状态的确定将几名患者误归类为PTEN拷贝中性，这与NGS从组织样品中获得的结果不一致。相比之下，ddPCR方法与组织样品结果均一地一致。肿瘤比例估计值源自LP-WGS数据的iCHOR CNA分析。