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法律状态
2022-08-30
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q 1/6895 专利申请号:2022104846362 申请日:20220506
实质审查的生效
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及用于一种用于葡萄转色肥最佳施用时期判断的引物组及其应用。
背景技术
根据《中国农业统计年鉴》统计数据，截止到2019年，我国葡萄栽培面积已经达到了726.20公顷，仅次于柑橘、苹果、梨，居于第四位。葡萄是施肥需求量较大的果树，不合理使用化肥不仅会造成化肥浪费，还会造成环境污染。因此，葡萄生产需要精确的施肥。精准施肥不仅可以节约肥料，平衡土壤养分，还可以减少环境污染，增加葡萄产量。
葡萄作为钾质植物，史祥宾对‘红地球’全年需钾量进行测定得出每生产1000kg果实需从土壤中吸收4.0～7.2kg的氧化钾。葡萄果实是重要的钾库，在整个生长过程中，果实的钾含量逐渐增加，在着色期至成熟期达到最大值
基因表达可以反应出植物的真实的生长和代谢状态。另外基因表达早于作物的特定形态变化，可以进一步预测营养需求。近几年，葡萄全基因测序的完成促进了在葡萄生产中的应用，如王剑等利用葡萄氮代谢基因的表达评价不同氮肥肥效。葡萄生长发育会受到许多因素的影响，而基因表达可以准确反应葡萄所处的状态，可以用于葡萄精准施肥的判定依据，减少肥料使用和肥料浪费，更好地保护环境和土壤。
检索暂未发现利用基因的表达来判断葡萄转色肥的喷施时间。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种判断葡萄转色肥最佳喷施时期的引物组，建立分子方法预测葡萄转色肥喷施时期；
本发明第二个问题是提供上述引物组在判断葡萄转色肥最佳喷施时期的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种用于葡萄转色肥最佳施用时期判断的引物组，包括如下两对引物：
(1)检测基因VvKUP1的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示；
(2)检测基因VvKUP2的引物对：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示；
本发明还保护一种用于葡萄转色肥最佳施用时期判断的检测试剂盒，包括前文所述的引物组。
本发明还保护前述引物组、前述试剂盒在叶面喷施葡萄转色肥施用时期的应用。
本发明还保护一种用于葡萄转色肥最佳施用时期判断的方法，包括如下步骤：
(1)取葡萄叶片，提取RNA，并反转录为cDNA，以SEQ ID NO：1～2、SEQ ID NO：3～4为引物，荧光定量PCR扩增VvKUP1基因、VvKUP2基因；
(2)若VvKUP1基因的表达趋势由下降转为上升，VvKUP2基因的表达趋势由下降转为上升，根施转色肥。
作为本申请的优选技术方案，所述转色肥为硫酸钾。
作为本申请的优选技术方案，所述方法可适用于葡萄成年树，不限特定品种。
优选的，所述的葡萄为‘夏黑’品种。
本发明还保护一种用于葡萄转色肥最佳施用时期判断的引物组的筛选方法，包括如下步骤：
(1)葡萄转色肥施肥处理：在葡萄膨果后(After Post-Expansion，APE)4d(APE4)、8d(APE8)、12d(APE12)、16d(APE16)选取发育基本一致的植株，在葡萄根部周围20cm处沟施硫酸钾肥料；在APE-4(膨果结束前4天)、APE0(膨果结束时)、APE4、APE8、APE12、APE16喷施之前采集第8～9节位的成熟叶片，并用液氮处理，放﹣80℃冰箱；
(2)样品总RNA提取：提取步骤(1)中所采样品的总RNA，并反转录为cDNA；
(3)标记基因初筛：选择VvKUP1、VvKUP2钾吸收相关的基因用于生物标记的开发；
(4)标记基因对应的特征表达信号分析：综合VvKUP1、VvKUP2基因的RT-qPCR结果，选择在不同地区转色肥最佳喷施时期具有相似表达模式的基因为判断转色肥喷施的marker基因，这一基因在此时的表达模式为转色肥喷施时期的特征表达信号。
优选的，总RNA提取：采用改良3％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取葡萄叶片总RNA；总RNA反转录为cDNA(互补脱氧核糖核酸)：以提取的总RNA(DNA酶处理)逆转录产物(cDNA)为荧光定量PCR模板。
更优选的，荧光定量PCR反应：以反转的cDNA为模版，使用SYBR Green I(Toyobo)试剂，用内参基因相应的特异引物在Applied
优选的，本专利所选择的2个marker基因信息及对应特征信号如下：
有益效果：
(1)本发明是一种基于PCR技术开发用于葡萄转色肥最佳施用时期判断的标记基因的方法，与现有技术不同之处在于：本发明能从分子水平上预测葡萄营养状况，可提前预测葡萄转色肥喷施时期，具有高效、精确等特点，且稳定性好，重复性高。
(2)本发明首次依据2个标记基因的表达变化趋势和比值变化综合判断葡萄转色肥喷施时期，其操作相对简单，成本较低，灵敏度高。
附图说明
图1不同时期喷施转色肥对果转色的影响结果图；A、D：分别为江苏盱眙‘夏黑’果实转色和转色率；B、E：分别为浙江金华‘夏黑’果实转色和转色率；C、F：分别为浙江天台‘夏黑’果实转色和转色率；
图2所示的是可用于转色肥最佳施用时期判断的基因RT-qPCR结果图，其中，
A：江苏盱眙‘夏黑’；B：浙江金华‘夏黑；C：浙江天台‘夏黑’。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
基于PCR技术开发用于葡萄转色肥最佳喷施时期判断的标记基因的方法，具体包括如下步骤：
(1)实验材料取样：三年生‘夏黑’叶片取自江苏盱眙、浙江金华、浙江天台园区葡萄园内。在APE-4(膨果结束前4天)、APE0(膨果结束时)、APE4、APE8、APE12、APE16喷施之前采集第8～9节位的成熟叶片，并用液氮处理，放﹣80℃冰箱；
(2)RNA提取：采用改良3％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取葡萄叶片总RNA；总RNA反转录为cDNA(互补脱氧核糖核酸)：以提取的总RNA(DNA酶处理)逆转录产物(cDNA)为荧光定量PCR模板。
(3)标记基因的选择与引物合成：利用Primer 6.0和Oligo 7软件，遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计实时荧光定量PCR引物，其扩增片段为l00-200bp，实时荧光定量PCR特异引物序列如表2所示。由上海鼎国生物技术有限公司合成(PAGE纯化法)。
表2 3个基因的基因名称、上下游引物。
(4)利用实时荧光定量PCR初步筛选标记基因：在Applied
(5)葡萄转色肥喷施处理：在葡萄膨果后(After Post-Expansion，APE)4d(APE4)、8d(APE8)、12d(APE12)、16d(APE16)选取发育基本一致的植株，在葡萄根部周围20cm处沟施硫酸钾肥料，每处理3次重复。4个处理记为T1(AFS7)、T2(AFS11)、T3(AFS15)和喷施清水的对照CK。在APE4、APE8、APE12、APE16、APE20、APE24、APE28、APE32、APE36观察果实转色情况，并统计转色率。
(5)转色肥最佳施用时期的确定：
通过判断不同时期marke基因的变化，发现江苏盱眙和浙江金华T3处理，浙江天台以T2处理符合maker基因，VvKUP1基因的表达趋势由下降转为上升，VvKUP2基因的表达趋势由下降转为上升。
(6)通过marker基因预测最佳时期的施肥效果：
通过(图1)可得，通过图1A-C，所有处理均促进不同地区‘夏黑’果实提前着色。盱眙和浙江金华都以T3施肥效果最好(图1A、B)，浙江天台以T2施肥效果最好(图1C)，比对照组相比，平均促进果实提前着色大约4天左右。通过图1D-F可以得到，3个地区最佳处理后‘夏黑’果实完全着色也比CK提前大约了4天左右。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种用于葡萄转色肥最佳施用时期判断的引物组及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgctgatgt tggccacttc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccggagaaa agaggcttgt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgaaatcagt gccagtccct 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgaaatcagc cagcctacca 20
机译： 用于同时检测葡萄树中三种病毒的3种引物组以及使用该引物组检测葡萄树中三种病毒的方法
机译： 一种用于蜜蜂病毒疾病诊断的引物组，包括急性蜜蜂麻痹病毒，一种使用该引物组诊断蜜蜂病毒疾病的方法，以及一种诊断试剂盒
机译： 用于检测巴斯德葡萄球菌的引物组和使用该引物组的检测方法
