一种一日龄种鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法

技术领域

本发明涉及禽病学分子学诊断技术领域，具体为一种一日龄种鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法。

背景技术

种鸭垂直传播疾病是指种鸭所带有的某种疾病其病原体可经卵黄、种蛋、蛋表等直接传播给后代孵化鸭苗，垂直传播病原均可以水平传播，造成鸭苗早期感染发病，引发鸭苗早期的大面漆感染，造成鸭苗生长出现问题，甚至发病死亡，给养鸭业造成巨大的经济损失。

鸭苗一般常见的垂传细菌性疾病有沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌，垂传病毒病包括禽流感病毒、鸭呼肠孤病毒、鸭坦布苏病毒、鸭细小病毒、鸭肝炎病毒。

种鸭垂直传播病的控制，最重要的就是在于早期的检测、预防，因此针对早期鸭苗垂传疾病进行检测非常重要，鸭苗早期样品采集是鸭苗质量检测的重要环节，关系到检测的准确率与时效性，现有的检测方法，没有办法做到早期的检测、预防，只能在发生大规模感染时，确定病因，协助进行治疗。

发明内容

本发明提供的发明目的在于提供一种一日龄种鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法。该一日龄种鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法，为了改善现有鸭苗早期的检测手段，针对带病种鸭进行早期控制，而提供一种一日龄种鸭常见垂直传播病原的病料采集及检测方法，本发明的雏鸭的病料采集及检测方法，病料采集方法包括：采集血液、卵黄囊、肝脏、泄殖腔棉拭子等，对种鸭垂传病原的样品采集，通过对采集的样品进行PCR检测，可检测雏鸭是否感染常见垂直传播病原，本发明简单方便、特异性强，通过对雏鸭的常见垂直传播病原的检测，有利于种鸭早期的疾病防控和净化。

为了实现上述效果，本发明提供如下技术方案：一种一日龄种鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法，包括以下步骤：

步骤一、雏鸭的颈上部紧靠头的位置采集血氧待用，解剖一日龄种鸭，获取内脏和组织，泄殖腔棉拭子采样；

步骤二、首先利用内脏和组织对沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌进行分离鉴定，同时检测垂直传播病毒；

步骤三、待检雏鸭用消毒液将羽毛打湿，置于剖检台，点燃酒精灯，打开腹腔，灼烧吊菌环，无菌采集肝脏、脑组织，5％血清琼脂培养基划线分离；

步骤四、采集的组织样品进行研磨处理后，对禽流感病毒、呼肠孤病毒、鸭坦布苏病毒、新型鸭细小病毒、鸭肝炎病毒的进行检测，取离心后的上清液提取病毒RNA或DNA，RNA反转录为cDNA后进行PCR扩增，DNA进行PCR扩增可以得到相应病毒的目的片段，随后测序，确定是否感染病毒。

进一步的，根据步骤一中的操作步骤，所述采好的血样要竖立放置，避免受冷和振动，在25-37℃环境中静置10-30min，这样有利于血液凝固和析出血清，否则容易发生溶血，然后放置4℃冰箱不少于4小时，待纤维蛋白收缩后，将血液以3000r/min离心10分钟，取血清作为待检样品。

进一步的，根据步骤一中的操作步骤，所述雏鸭体表进行消毒，从腹部剪开羽毛皮肤，打开腹腔漏出内脏，采集脏器主要有肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、胰腺、脑等组织脏器，未吸收完全的卵黄单独摘除，防止破裂撒体腔内，在样品采集选择上，最好多选取几只病料进行集中混合，防止个体选择上造成漏检，同时根据重点疫病特点，选取针对性病毒含量高的部位进行采集，所采集的组织脏器不宜过大，一般采集2×2cm大小的组织即可，较小的脏器可以全部取出。

进一步的，根据步骤一中的操作步骤，所述通过泄殖腔拭子采样的步骤包括：将无菌拭子用无菌生理盐水湿润后，插入雏鸭泄殖腔内，转动3-5圈，投入无菌离心管中，折断拭杆，使其完全置于管中，盖紧管盖。

进一步的，根据步骤二中的操作步骤，所述肝脏、卵黄取样，无菌镊子取少量肝脏进入增菌液，取上述增菌液分区划线接种于ss培养基上，进行菌落培养，SS培养基出现紫色菌落，即可判定含有沙门氏菌。

进一步的，根据步骤三中的操作步骤，所述无菌采集肝脏、脑组织，5％血清琼脂培养基划线分离，5％血清营养培养基平板上生长出均匀一致的菌落，表面光滑，呈水滴状，稍隆起，圆形，边缘整齐，45度角对光观察可见淡蓝色荧光，血清型鉴定：将纯化后的鸭疫里默氏杆菌用无菌PBS吹下，吹下来的菌落呈乳白色，分别取25μL菌液与1、2、6、7、10型等阳性血清混合，对应血清型在玻片上出现颗粒状凝集。

进一步的，根据步骤四中的操作步骤，所述鸭呼肠孤病毒的检测方法包括：采集的组织样品进行研磨处理后，取离心后的上清液提取病毒RNA，并反转录为cDNA后进行PCR扩增，扩增引物为：

XREO-P1:ACCTCAGGATATCGCTGAAACT；

XREO-P2:CTCCATCCCTGCAGCACATGTAAAG；

目的片段为580bp，扩增程序为50℃30min，94℃5min，95℃30s，54℃30s，72℃80s，72℃8min；

结果判定：鸭呼肠孤病毒RT-PCR扩增可以得到相对应目的条带大小的片段，则判定相应的病料为阳性。

进一步的，根据步骤四中的操作步骤，所述鸭坦布苏病毒的检测方法包括：采集的组织样品进行研磨处理后，取离心后的上清液提取病毒RNA，并反转录为cDNA后进行PCR扩增，扩增引物为：

CAP3:ATGTCTAACAAAAAACCAGG；

CAP4:CAGCCCAGCAACTATCG；

目的片段为363bp，扩增程序为50℃30min，94℃5min，95℃30s，54℃30s，72℃80s，72℃5min；

结果判定：坦布苏病毒RT-PCR扩增可以得到363bp大小的片段，并经测序得知属于鸭坦布苏病毒，则判定相应的病料为鸭坦布苏阳性。

进一步的，根据步骤四中的操作步骤，所述新型鸭细小病毒的检测方法包括：采集的组织样品进行研磨处理后，取离心后的上清液提取病毒DNA，进进行PCR扩增，扩增引物为：

MZJ－细小s：GTGGTCGCAGGTCCGTAGA；

MZJ－细小x:CCAACAGAGCAGCAAAGA；

目的片段为363bp，扩增程序为94℃3min，95℃15s，54℃15s，72℃80s，72℃5min；

结果判定：新型鸭细小病毒PCR扩增可以得到363bp目的片段，并经测序分析后属于新型鸭细小病毒，则判定相应的病料为阳性。

进一步的，根据步骤四中的操作步骤，所述病毒的检测方法包括：采集的组织样品进行研磨处理后，取离心后的上清液提取病毒RNA，并反转录为cDNA后进行PCR扩增，扩增引物为：

鸭肝炎病毒引物序列：

DH1-3：GACTGTGCAACACGCTTCAAC；

DH1-4：AATCTACTTCATCCCCAGACTG；

目的片段为473bp，扩增程序为51℃30min，94℃5min，95℃15s，54℃30s，72℃80s，72℃10min；

DH3-3：TGTGTATCTTATGAGCAGGCCA；

DH3-4：AGCCCAACACGGCAAGCAC；

目的片段为646bp，扩增程序为52℃30min，94℃5min，95℃30s，54℃30s，72℃80s，72℃8min；

结果判定：鸭肝炎病毒RT-PCR扩增Ⅰ型可以得到473bp大小的片段，Ⅲ型可以得到646bp大小的片段，扩增到目的片段则判定相应的病料为阳性。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

该一日龄种鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法，为了改善现有鸭苗早期的检测手段，针对带病种鸭进行早期控制，而提供一种一日龄种鸭常见垂直传播病原的病料采集及检测方法，本发明的雏鸭的病料采集及检测方法，病料采集方法包括：采集血液、卵黄囊、肝脏、泄殖腔棉拭子等，对种鸭垂传病原的样品采集，通过对采集的样品进行PCR检测，可检测雏鸭是否感染常见垂直传播病原，本发明简单方便、特异性强，通过对雏鸭的常见垂直传播病原的检测，有利于种鸭早期的疾病防控和净化。

附图说明

图1为本发明一种一日龄种鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法的流程示意图；

图2为本发明一种一日龄种鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法的沙门氏菌显紫色培养基示意图；

图3为本发明一种一日龄种鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法的鸭疫里默氏杆菌玻片颗粒状凝示意图；

图4为本发明一种一日龄种鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法的鸭肝病毒阳性电泳示意图，其中M:Marker；1：病料PCR扩增产物；2：阴性对照；3：鸭肝I型阳性对照；

图5为本发明一种一日龄种鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法的鸭疫里默氏杆菌凝集示意图；

图6为本发明一种一日龄种鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法的鸭呼肠孤病毒阳性电泳示意图，其中M:Marker；1:阳性对照；2:阴性对照；3:新型鸭呼肠孤病毒；4:细小病毒；5:鸭肝炎病毒；6:副黏病毒；7:坦布苏病毒；8:鸭瘟病毒；

具体实施方式

本发明提供一种技术方案：请参阅图1，一种一日龄种鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法，包括以下步骤：

步骤一、雏鸭的颈上部紧靠头的位置采集血氧待用，解剖一日龄种鸭，获取内脏和组织，泄殖腔棉拭子采样；

步骤二、首先利用内脏和组织对沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌进行分离鉴定，同时检测垂直传播病毒；

步骤三、待检雏鸭用消毒液将羽毛打湿，置于剖检台，点燃酒精灯，打开腹腔，灼烧吊菌环，无菌采集肝脏、脑组织，5％血清琼脂培养基划线分离；

步骤四、采集的组织样品进行研磨处理后，对禽流感病毒、呼肠孤病毒、鸭坦布苏病毒、新型鸭细小病毒、鸭肝炎病毒的进行检测，取离心后的上清液提取病毒RNA或DNA，RNA反转录为cDNA后进行PCR扩增，DNA进行PCR扩增可以得到相应病毒的目的片段，随后测序，确定是否感染病毒。

具体的，根据步骤一中的操作步骤，采好的血样要竖立放置，避免受冷和振动，在25-37℃环境中静置10-30min，这样有利于血液凝固和析出血清，否则容易发生溶血，然后放置4℃冰箱不少于4小时，待纤维蛋白收缩后，将血液以3000r/min离心10分钟，取血清作为待检样品。

具体的，根据步骤一中的操作步骤，雏鸭体表进行消毒，从腹部剪开羽毛皮肤，打开腹腔漏出内脏，采集脏器主要有肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、胰腺、脑等组织脏器，未吸收完全的卵黄单独摘除，防止破裂撒体腔内，在样品采集选择上，最好多选取几只病料进行集中混合，防止个体选择上造成漏检，同时根据重点疫病特点，选取针对性病毒含量高的部位进行采集，所采集的组织脏器不宜过大，一般采集2×2cm大小的组织即可，较小的脏器可以全部取出。

具体的，根据步骤一中的操作步骤，通过泄殖腔拭子采样的步骤包括：将无菌拭子用无菌生理盐水湿润后，插入雏鸭泄殖腔内，转动3-5圈，投入无菌离心管中，折断拭杆，使其完全置于管中，盖紧管盖。

具体的，根据步骤二中的操作步骤，肝脏、卵黄取样，无菌镊子取少量肝脏进入增菌液，取上述增菌液分区划线接种于ss培养基上，进行菌落培养，SS培养基出现紫色菌落，即可判定含有沙门氏菌。

具体的，根据步骤三中的操作步骤，无菌采集肝脏、脑组织，5％血清琼脂培养基划线分离，5％血清营养培养基平板上生长出均匀一致的菌落，表面光滑，呈水滴状，稍隆起，圆形，边缘整齐，45度角对光观察可见淡蓝色荧光，血清型鉴定：将纯化后的鸭疫里默氏杆菌用无菌PBS吹下，吹下来的菌落呈乳白色，分别取25μL菌液与1、2、6、7、10型等阳性血清混合，对应血清型在玻片上出现颗粒状凝集。

具体的，根据步骤四中的操作步骤，鸭呼肠孤病毒的检测方法包括：采集的组织样品进行研磨处理后，取离心后的上清液提取病毒RNA，并反转录为cDNA后进行PCR扩增，扩增引物为：

XREO-P1:ACCTCAGGATATCGCTGAAACT；

XREO-P2:CTCCATCCCTGCAGCACATGTAAAG；

目的片段为580bp，扩增程序为50℃30min，94℃5min，95℃30s，54℃30s，72℃80s，72℃8min；

结果判定：鸭呼肠孤病毒RT-PCR扩增可以得到相对应目的条带大小的片段，则判定相应的病料为阳性。

具体的，根据步骤四中的操作步骤，鸭坦布苏病毒的检测方法包括：采集的组织样品进行研磨处理后，取离心后的上清液提取病毒RNA，并反转录为cDNA后进行PCR扩增，扩增引物为：

CAP3:ATGTCTAACAAAAAACCAGG；

CAP4:CAGCCCAGCAACTATCG；

目的片段为363bp，扩增程序为50℃30min，94℃5min，95℃30s，54℃30s，72℃80s，72℃5min；

结果判定：坦布苏病毒RT-PCR扩增可以得到363bp大小的片段，并经测序得知属于鸭坦布苏病毒，则判定相应的病料为鸭坦布苏阳性。

具体的，根据步骤四中的操作步骤，新型鸭细小病毒的检测方法包括：采集的组织样品进行研磨处理后，取离心后的上清液提取病毒DNA，进进行PCR扩增，扩增引物为：

MZJ－细小s：GTGGTCGCAGGTCCGTAGA；

MZJ－细小x:CCAACAGAGCAGCAAAGA；

目的片段为363bp，扩增程序为94℃3min，95℃15s，54℃15s，72℃80s，72℃5min；

结果判定：新型鸭细小病毒PCR扩增可以得到363bp目的片段，并经测序分析后属于新型鸭细小病毒，则判定相应的病料为阳性。

具体的，根据步骤四中的操作步骤，病毒的检测方法包括：采集的组织样品进行研磨处理后，取离心后的上清液提取病毒RNA，并反转录为cDNA后进行PCR扩增，扩增引物为：

鸭肝炎病毒引物序列：

DH1-3：GACTGTGCAACACGCTTCAAC；

DH1-4：AATCTACTTCATCCCCAGACTG；

目的片段为473bp，扩增程序为51℃30min，94℃5min，95℃15s，54℃30s，72℃80s，72℃10min；

DH3-3：TGTGTATCTTATGAGCAGGCCA；

DH3-4：AGCCCAACACGGCAAGCAC；

目的片段为646bp，扩增程序为52℃30min，94℃5min，95℃30s，54℃30s，72℃80s，72℃8min；

结果判定：鸭肝炎病毒RT-PCR扩增Ⅰ型可以得到473bp大小的片段，Ⅲ型可以得到646bp大小的片段，扩增到目的片段则判定相应的病料为阳性。

采用本发明的方法采集临床检测样品，进行检测，结果见下表。结果表明，本发明针对性强，对一日龄鸭苗检测准确率高。

临床检测情况：

根据上述表格数据可以得出，当实施实施例时，通过本发明一种一日龄种鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法，该一日龄种鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法，为了改善现有鸭苗早期的检测手段，针对带病种鸭进行早期控制，而提供一种一日龄种鸭常见垂直传播病原的病料采集及检测方法，本发明的雏鸭的病料采集及检测方法，病料采集方法包括：采集血液、卵黄囊、肝脏、泄殖腔棉拭子等，对种鸭垂传病原的样品采集，通过对采集的样品进行PCR检测，可检测雏鸭是否感染常见垂直传播病原，本发明简单方便、特异性强，通过对雏鸭的常见垂直传播病原的检测，有利于种鸭早期的疾病防控和净化。

本发明提供了一种一日龄种鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法，包括以下步骤：步骤一、雏鸭的颈上部紧靠头的位置采集血样待用，解剖一日龄种鸭，获取内脏和组织，泄殖腔棉拭子采样，左手用食指和中指夹住雏鸭的颈上部紧靠头的位置，此时鸡的背部贴手心，爪向外无名指抵住颈中部小拇指自然地托扶雏鸭的身体大拇指的位置在颈的下部压住右侧颈挣脉血管的向心端，防止血管滑动，将雏鸭的右颈静脉用酒精棉球擦拭后，颈静脉明显可见，右手拿住注射器，用大拇指及中指持住注射器管，拿注射器顺颈静脉平行方向从颈静脉中部刺入血管，然后将血抽入注射器，将采集的血液沿管壁慢慢注入离心管，切忌用力过猛起泡或溶血，采好的血样要竖立放置，避免受冷和振动，在25-37℃环境中静置10-30min，这样有利于血液凝固和析出血清，否则容易发生溶血，然后放置4℃冰箱不少于4小时，待纤维蛋白收缩后，将血液以3000r/min离心10分钟，取血清作为待检样品，剖检前，先雏鸭体表进行消毒，从腹部剪开羽毛皮肤，打开腹腔漏出内脏，采集脏器主要有肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、胰腺、脑等组织脏器，未吸收完全的卵黄单独摘除，防止破裂撒体腔内，在样品采集选择上，最好多选取几只病料进行集中混合，防止个体选择上造成漏检，同时根据重点疫病特点，选取针对性病毒含量高的部位进行采集，所采集的组织脏器不宜过大，一般采集2×2cm大小的组织即可，较小的脏器可以全部取出，步骤二、首先利用内脏和组织对沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌进行分离鉴定，同时检测垂直传播病毒，肝脏、卵黄取样：双手用75％酒精棉球擦拭消毒，用酒精对待检雏鸭进行体表消毒，用无菌镊子取少量肝脏，放入3ml的SC增菌液中，置37℃温箱中培养18-24小时；用无菌棉签蘸取卵黄放入3ml的SC增菌液中，置37℃温箱中培养18-24小时，菌落分离：取上述增菌液分区划线接种于ss培养基上，置37℃温箱中培养22-24小时后将无色透明中心黑色的菌落接种于沙门显色培养基上培养，SS培养基：37℃培养12～24h，观察菌落生长可见平板上长有中等大小、圆形、扁平、表面光滑、湿润、边缘整齐的黑色中心菌落，沙门显色培养基：典型沙门氏菌显紫色，步骤三、待检雏鸭用消毒液将羽毛打湿，置于剖检台，点燃酒精灯，打开腹腔，灼烧吊菌环，无菌采集肝脏、脑组织，5％血清琼脂培养基划线分离，血清营养琼脂置于5％CO2培养箱中37℃培养24～36h，SS、麦康凯培养基置于37℃培养箱培养18～24h，5％血清营养培养基平板上生长出均匀一致的菌落，表面光滑，呈水滴状，稍隆起，圆形，边缘整齐，45度角对光观察可见淡蓝色荧光，镜检，挑取单个菌落涂片、革兰氏染色、镜检，结果表明，获得的微生物为革兰氏阴性、不运动的小杆菌，单个或成双排列，初次分离有时会看到丝状排列，细菌变化较大，长1～5um，宽0.2～0.4um，形态与鸭疫里默氏杆菌形态和大小一致，血清型鉴定：将纯化后的鸭疫里默氏杆菌用无菌PBS吹下，吹下来的菌落呈乳白色，分别取25μL菌液与1、2、6、7、10型等阳性血清混合，对应血清型在玻片上出现颗粒状凝集，利用本实施的采样和检测方法，针对种鸭有过浆膜炎发病史的鸭场所孵化的鸭苗进行细菌分离鉴定，共分离3批60只，分离到4只雏鸭有鸭疫里默氏杆菌感染，用本实施例的方式进行采样并检测，可以快速诊断鸭苗浆膜炎是否垂直感染，并为提前采取措施治疗提供技术支持，步骤四、采集的组织样品进行研磨处理后，对禽流感病毒、呼肠孤病毒、鸭坦布苏病毒、新型鸭细小病毒、鸭肝炎病毒的进行检测，取离心后的上清液提取病毒RNA或DNA，RNA反转录为cDNA后进行PCR扩增，DNA进行PCR扩增可以得到相应病毒的目的片段，随后测序，确定是否感染病毒，具体提取步骤参考试剂盒内说明书，检测用试剂盒，应用RT-PCR/PCR对特异性引物进行扩增，产物经1％琼脂糖凝胶电泳后观察，采用本发明的方法采集临床检测样品，进行检测，结果见下表，结果表明，本发明针对性强，对一日龄鸭苗检测准确率高，鸭呼肠孤病毒的检测方法包括：采集的组织样品进行研磨处理后，取离心后的上清液提取病毒RNA，并反转录为cDNA后进行PCR扩增，扩增引物为：

XREO-P1:ACCTCAGGATATCGCTGAAACT；

XREO-P2:CTCCATCCCTGCAGCACATGTAAAG；

目的片段为580bp，扩增程序为50℃30min，94℃5min，95℃30s，54℃30s，72℃80s，72℃8min；

结果判定：鸭呼肠孤病毒RT-PCR扩增可以得到相对应目的条带大小的片段，则判定相应的病料为阳性，

鸭坦布苏病毒的检测方法包括：采集的组织样品进行研磨处理后，取离心后的上清液提取病毒RNA，并反转录为cDNA后进行PCR扩增，扩增引物为：

CAP3:ATGTCTAACAAAAAACCAGG；

CAP4:CAGCCCAGCAACTATCG；

目的片段为363bp，扩增程序为50℃30min，94℃5min，95℃30s，54℃30s，72℃80s，72℃5min；

结果判定：坦布苏病毒RT-PCR扩增可以得到363bp大小的片段，并经测序得知属于鸭坦布苏病毒，则判定相应的病料为鸭坦布苏阳性，

新型鸭细小病毒的检测方法包括：采集的组织样品进行研磨处理后，取离心后的上清液提取病毒DNA，进进行PCR扩增，扩增引物为：

MZJ－细小s：GTGGTCGCAGGTCCGTAGA；

MZJ－细小x:CCAACAGAGCAGCAAAGA；

目的片段为363bp，扩增程序为94℃3min，95℃15s，54℃15s，72℃80s，72℃5min；

结果判定：新型鸭细小病毒PCR扩增可以得到363bp目的片段，并经测序分析后属于新型鸭细小病毒，则判定相应的病料为阳性，

鸭肝炎病毒的检测方法包括：采集的组织样品进行研磨处理后，取离心后的上清液提取病毒RNA，并反转录为cDNA后进行PCR扩增，扩增引物为：

鸭肝炎病毒引物序列：

DH1-3：GACTGTGCAACACGCTTCAAC；

DH1-4：AATCTACTTCATCCCCAGACTG；

目的片段为473bp，扩增程序为51℃30min，94℃5min，95℃15s，54℃30s，72℃80s，72℃10min；

DH3-3：TGTGTATCTTATGAGCAGGCCA；

DH3-4：AGCCCAACACGGCAAGCAC；

目的片段为646bp，扩增程序为52℃30min，94℃5min，95℃30s，54℃30s，72℃80s，72℃8min；

结果判定：鸭肝炎病毒RT-PCR扩增Ⅰ型可以得到473bp大小的片段，Ⅲ型可以得到646bp大小的片段，扩增到目的片段则判定相应的病料为阳性，对1日龄鸭苗进行鸭肝1型病毒检测，阳性对照为鸭肝1型活疫苗，购自成熟的疫苗生产公司，阴性对照为纯化水，鸭肝炎病毒是单链RNA，鉴定用RT-PCR的方法，

鸭肝炎病毒扩增引物为：

上游引物5：GACTGTGCAACACGCTTCAAC；

下游引物5：AATCTACTTCATCCCCAGACTG；

采集雏鸭的内脏组织肝脏和脾脏，剪碎后按1∶3比例加入无菌PBS溶液，充分研磨制备组织悬液，反复冻融3次后3000r/min离心10min，取上清液用于病毒核酸的提取，检测用试剂盒，应用RT-PCR对特异性引物进行扩增，产物经1％琼脂糖凝胶电泳后观察，扩增出一条473bp的条带，参照图1所示，雏鸭样品和阳性对照出现一条473bp目的条带；阴性对照未出现条带，利用本实施的采样和检测方法，前后对12批引种批次一日龄雏鸭进行了RT-PCR检测，检出鸭肝1型病毒阳性1份，针对阳性带毒鸭进行治疗控制了鸭肝疾病的发生。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 一种一日龄种鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法

山东和康源生物育种股份有限公司（第一申请人）；宁阳正和生物育种有限公司；山东宁阳和樱种鸭有限公司

<120> 一种一日龄种鸭常见垂传播病原的病料采集及检测方法

<130> 2022.4.21

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acccaggaac gcgaaac 17

<210> 2

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cccacccgca gcacagaaag 20

<210> 3

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcaacaaaa aaccagg 17

<210> 4

<211> 15

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cagcccagca acacg 15

<210> 5

<211> 15

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gggcgcaggc cgaga 15

<210> 6

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccaacagagc agcaaaga 18

<210> 7

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gacggcaaca cgccaac 17

<210> 8

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aacaccaccc cagacg 16

<210> 9

<211> 15

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggacagagca ggcca 15

<210> 10

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agcccaacac ggcaagcac 19

<210> 11

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gacggcaaca cgccaac 17

<210> 12

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aacaccaccc cagacg 16