一种红平菇菌丝体的生产方法、生产的红平菇菌丝体及其应用

技术领域

本发明属于生物发酵和食品技术领域，具体涉及一种红平菇菌丝体的生产方法、用该方法生产的红平菇菌丝体以及该红平菇菌丝体的应用。

背景技术

蛋白质是人体必需的营养物质。据联合国预测，2050年地球人口将接近 100亿，人类对蛋白质的需求将持续上升。传统动物蛋白存在占用耕地、生长周期长、易发生疫病、排放温室气体、动物关爱等多种问题。因此，有必要开发动物蛋白可替代产品。该替代产品不仅能提供必需的营养，而且要满足消费者对肉类食品质地和感官的需求。以植物蛋白为主要基料制作的素肉产品，蛋白质含量较高，脂肪含量低，适合于肥胖、高血脂、素食等有特殊需要的消费人群。因此，随着人类环保意识的提升以及对健康和营养的不断追求，植物素肉的开发及研究是潮流驱动的必然。

生产植物素肉的原料主要有大豆蛋白、小麦蛋白、魔芋和食用菌等。大豆蛋白和小麦蛋白容易引起过敏，影响其受众范围。食用菌含有丰富的蛋白质成分，干重时质量分数最高可达25％，与牛肉、猪肉等畜禽产品中蛋白质含量接近(王延圣，等.食用菌蛋白质的应用前景及研究热点分析[J].食品工业科技，2019,40(10)：339-344.)。食用菌生长按照“孢子→菌丝体→子实体→孢子”循环。菌丝体是食用菌的营养器官和幼年时期，其营养成分与子实体相近。食用真菌子实体的萌出和生长属于固体发酵，对环境要求较高，生产周期长、产率低。菌丝体生长通过液体发酵即可大规模实现；与固体发酵相比，具有生产周期短、适合规模化生产、无季节性限制、生产工艺简单、成本低、菌种纯度高、种龄一致、受杂菌污染概率小等优点，而且可以有目的地获得所需的次级代谢产物。大规模生产食用菌菌丝体可以为植物肉提供丰富的原料。

红平菇(Pleurotus djamor)，又名桃红平菇、红侧耳，属于真菌门层菌纲伞菌目侧耳科侧耳属，是近几年从印度引进的优良品种。其味道鲜美，有蟹味，富含蛋白质、氨基酸、矿质元素和维生素。由于红平菇的子实体色泽鲜艳，具有观赏性。因此，早期红平菇的研究主要集中在固体栽培配方优化以及其活性成分研究方面，菌丝体的液体发酵生产及菌丝体应用研究报告较少。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种红平菇菌丝体的生产方法，该方法能够提高红平菇菌丝体的产量和蛋白质含量。本发明还提供利用该方法生产的红平菇菌丝体在制备植物素肉中的应用。

为实现上述技术效果，本发明采用了如下的技术方案：

一种红平菇菌丝体的生产方法，包括菌种活化、种子液制备、接种发酵、固液分离收集菌丝体；其中所述种子液制备和接种发酵采用相同的液体培养基；所述液体培养基的pH＝5.5～6.5，原料中各组分的含量为：

以总糖计的玉米液化清液25～50g/L、硫酸镁0.02～3g/L、硫酸铵0.1～2g/L、磷酸二氢钾0.02～3g/L、尿素0.02～3g/L、高核苷酸酵母粉0.1～3g/L、细菌纤维素0.05～4g/L、V

其中，所述高核苷酸酵母粉中核苷酸的质量百分比含量≥8％；所述细菌纤维素为110-220目筛下物。

优选地，所述液体培养的原料中，各组分的含量为：

以总糖计的玉米液化清液25～50g/L、硫酸镁0.1～1g/L、硫酸铵0.1～0.5g/L、磷酸二氢钾0.1～1g/L、尿素0.1～1g/L份、高核苷酸酵母粉1～2g/L、细菌纤维素1～2g/L、V

优选地，所述玉米液化清液通过如下方法制备：

按照玉米粉和水的质量比1∶1.5～1∶2.8将玉米粉和水混合，调 pH5.5～6.0，基于玉米粉的质量加入α-淀粉酶10～20U/g，80～100℃液化1.5～2 小时，然后降温至常温，进行固液分离，所得清液即为所述玉米清化液。

所述玉米清化液制备中，液化结束后，反应液可以加速降温至室温，也可以自然降温至室温。

通过上述方法制备得到的玉米清液总糖含量为150～200g/L。

所述高核苷酸酵母粉可以通过商业渠道获得，如购买自南京同凯兆业生物技术有限公司。

优选地，所述细菌纤维素为200目筛下物。

优选地，所述细菌纤维素是由木醋杆菌(Acetobacter xylinus)发酵产生，产生的细菌纤维素经碱水反复煮洗至无明显颜色，并用纯水清洗至pH中性，细菌纤维素无明显颜色，然后烘箱烘干或冷冻干燥，粉碎，取110～220目筛下物，优选200目筛下物，即得。

优选地，所述细菌纤维素通过如下方法发酵产生：

1)刮取一环木醋杆菌斜面种子接于灭菌后的种子培养基(葡萄糖20g/L、酵母膏2g/L、蛋白胨2g/L、CaCO

2)糖蜜制备：将甘蔗糖蜜用水稀释至所述甘蔗糖蜜质量的2倍，用硫酸调pH值为2.0，90℃水解30分钟，静置一夜后离心或过滤取上清液再稀释 10倍，调pH值为5.5～6.5；

3)发酵：将步骤1)得到的木醋杆菌种子按10％接种于装有150mL甘蔗糖蜜培养基(步骤2制备得到的糖蜜25g/L，甘油0.5g/L，固含量35％～45％的玉米浆10g/L，硫酸铵0.5g/L，柠檬酸1.0g/L，磷酸氢二钠2.0g/L，硫酸镁0.2g/L)的500mL三角瓶静置发酵8天，发酵温度为28℃，得到发酵液，通过离心或过滤进行固液分离，得到细菌纤维素。

优选地，所述液体培养基通过如下方法制备：

步骤I.准备原料

按照重量份准备原料中的各组分；

步骤II.胡萝卜的处理

将所述重量份的新鲜胡萝卜切块粉碎，与原料中的部分水混合，，匀浆处理，固液分离，取胡萝卜汁备用；

步骤III.液体培养基的配制和定容

将步骤II得到的所述胡萝卜汁和其他原料混合，必要时用水补齐重量，使所述玉米液化清液的总糖含量在所述液体培养基中为25～50g/L，搅拌均匀，调pH5.5～6.5，灭菌，即得。

作为一个优选的实施方案，本发明提供一种红平菇菌丝体的生产方法，包括如下步骤：

步骤1.菌种活化

将低温保藏的红平菇斜面菌种切取小块接入PDA平板中央，进行菌种活化培养，培养条件为25℃恒温培养箱培养7～8天，待菌丝布满整个平板即可；

步骤2.种子液制备

用直径为0.5cm打孔器在培养7～8天的红平菇菌丝平板上打取4～5块菌块，接入装有本发明所述红平菇液体培养基的摇瓶中，摇瓶规格为500mL，装液量150±10mL，25℃恒温培养箱150rpm震荡培养6天，即得到红平菇种子液；

步骤3.接种发酵

将步骤2得到的所述红平菇种子液按照接种量5～20％，利用火焰接种法接入预先加入本发明所述液体培养基的红平菇发酵罐，参数设置为：装液量为50％，以制备所述液体培养基原料中的玉米液化清液所用玉米粉的质量为基准添加糖化酶20～100U/g，搅拌速度150～300rpm，温度25℃，溶氧50％以上，压力0.05～0.1Mpa，培养发酵至糖浓度降至1g/L以下且菌丝体形态完整；

步骤4.固液分离收集菌丝体

通过离心和/或过滤处理步骤3得到的发酵液，分离得到的菌丝体备用。

优选地，所述步骤3，采用反复间歇式发酵，具体操作为：

每批次发酵终点时，排出占发酵液总体积40％～80％(v/v)的发酵液，补充本发明所述液体培养基至设定的装液量，按照步骤3中所述参数进行发酵。

本发明的第二个目的在于提供一种按照上述生产方法制备得到的红平菇菌丝体。

本发明的第三个目的在于提供所述红平菇菌丝体在制备植物素肉中的应用。

具体地，所述应用是指本发明所述红平菇菌丝体与拉丝蛋白混合，挤压成型，干燥，得到所述植物素肉。

本发明还提供一种植物素肉的制备方法，包括如下步骤：

步骤A.红平菇菌丝体前处理

用水对按照本发明前述方法制备得到的所述红平菇菌丝体进行清洗2～5 次至无明显培养基成分，5000r/min离心10min，称重，加入菌丝体湿重5～50 倍的水，1000～2500r/min转速下，优选2000r/minx转速下搅拌匀浆至菌丝体没有明显球状形态，离心和/或过滤，收集菌丝体，得到匀浆后的红平菇菌丝体，称重，备用；其中，所述匀浆后的红平菇菌丝体含水量为89～92％；

步骤B.拉丝蛋白前处理

将商品化成品拉丝蛋白完全浸泡在水中，至复水率不低于120～190％；对复水后的拉丝蛋白进行拆丝，使拆丝均一、无硬芯、无大块异物，丝宽不大于0.5cm，得到拆丝后的拉丝蛋白，称重，备用；

步骤C.复配混料

步骤A得到的匀浆后的红平菇菌丝体加水悬浮，与步骤B得到的拆丝后的拉丝蛋白混合，得到混料；其中，以所述匀浆后的红平菇菌丝体和所述拆丝后的拉丝蛋白的总湿重为基准，所述匀浆后的红平菇菌丝体占10～60％，优选为10％～30％，最优30％，余量为所述拆丝后的拉丝蛋白；

步骤D.挤压成型

步骤C得到的混料通过螺杆挤压机挤压成型，得到成型坯料；其中，挤压过程中调节加水量使成型坯料中水的质量百分比含量为45～60％，挤出机模头温度100～140℃；

步骤E.干燥

将步骤D得到的成型坯料干燥至水的质量百分比含量20％以下，即得到所述植物素肉。

本发明还有一个目的在于提供通过上述方法制备得到的植物素肉。

本说明书中，如无特别说明，所述“水”是指经过纯化处理的水，如去离子水、蒸馏水、双蒸水等。

本发明提供的红平菇菌丝体的生产方法得到的红平菇菌丝体产量高、蛋白含量高，营养丰富。以该红平菇菌丝体为原料制备得到的植物素肉外形佳、风味好、成本低，可以满足人们对植物素肉的口感、风味和营养的要求。本发明为红平菇菌丝体的商业开发提供了一条有价值的路径。

附图说明

以下结合附图，对本发明做进一步的说明。

图1的照片示出的是在40倍显微镜下观察到的实施例3中三种匀浆速度下得到的红平菇菌丝体，其中：

A：配方14-500，

B：配方14-2000，

C：配方14-10000。

图2的照片示出的是实施例3中配方14-2000菌丝体和拉丝蛋白制备得到的植物素肉的成品照片，其中配方14-2000菌丝体占植物素肉原料总湿重质量的30％。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。其中，部分菌种、试剂的来源情况如下：

红平菇菌种：江苏省农科院菌种保藏中心赠送，保藏单位自建编号 NKY_H2020_15；

木醋杆菌，ATCC，菌种保藏编号ATCC700178；

拉丝蛋白：安阳倍加食品有限公司；

安琪酵母粉：FM888，其中核苷酸含量＜3％；安琪酵母股份有限公司；

高核苷酸酵母粉(核苷酸含量≥8％)：南京同凯兆业生物技术有限公司。

下述实施例中所述的玉米液化清液通过如下方法制备：

按照玉米粉和水的质量比1∶2.5将玉米粉和水混合，调pH5.5，基于玉米粉的质量加入α-淀粉酶10～20U/g，80～100℃液化1.5～2小时，然后降温至常温，进行固液分离，所得清液即为所述玉米清化液；其中，总糖含量为 150～200g/L。

下述实施例中所述的细菌纤维素通过如下方法制备：

1)刮取一环木醋杆菌斜面种子接于灭菌后的种子培养基(葡萄糖20g/L、酵母膏2g/L、蛋白胨2g/L、CaCO

2)糖蜜制备：将甘蔗糖蜜用水稀释至甘蔗糖蜜质量的2倍，用硫酸调pH 值为2.0，90℃水解30分钟，静置一夜后离心或过滤取上清液再稀释10倍，调pH值为5.5～6.5；

3)发酵：将步骤1)得到的木醋杆菌种子按10％接种于装有150mL甘蔗糖蜜培养基(步骤2)制备得到的糖蜜25g/L，甘油0.5g/L，玉米浆10g/L，硫酸铵 0.5g/L，柠檬酸1.0g/L，磷酸氢二钠2.0g/L，硫酸镁0.2g/L的500mL三角瓶静置发酵8天，发酵温度为28℃，得到发酵液，通过离心或过滤进行固液分离，得到细菌纤维素；

4)发酵后处理：步骤3)得到的细菌纤维素经碱水反复煮洗至无明显颜色，并用纯水清洗至pH中性，然后烘箱烘干或冷冻干燥，粉碎，备用。

实施例1红平菇菌丝体液体培养基的考察和优选

所述液体培养基通过如下方法制备：

步骤I.准备原料

按照如下配方分别准备原料中的各组分(单位：g/L)：

配方1：葡萄糖10、玉米淀粉15、硫酸镁0.4、硫酸铵0.2、磷酸二氢钾 0.6、尿素0.5、安琪酵母粉(FM888)2、V

配方2：以总糖计的玉米液化清液25、硫酸镁0.4、硫酸铵0.2、磷酸二氢钾0.6、尿素0.5、安琪酵母粉(FM888)2、V

配方3：葡萄糖25、硫酸镁0.4、硫酸铵0.2、磷酸二氢钾0.6、尿素0.5、安琪酵母粉(FM888)2、V

配方4：以总糖计的玉米液化清液25、硫酸镁0.4、硫酸铵0.2、磷酸二氢钾0.6、尿素0.5、安琪酵母粉2(FM888)、V

配方5：以总糖计的玉米液化清液25、硫酸镁0.4、硫酸铵0.2、磷酸二氢钾0.6、尿素0.5、安琪酵母粉(FM888)2、V

配方6：以总糖计的玉米液化清液25、硫酸镁0.4、硫酸铵0.2、磷酸二氢钾0.6、尿素0.5、安琪酵母粉(FM888)2、V

配方7：以总糖计的玉米液化清液25、硫酸镁0.4、硫酸铵0.2、磷酸二氢钾0.6、尿素0.5、安琪酵母粉(FM888)2、V

配方8：以总糖计的玉米液化清液25、硫酸镁0.4、硫酸铵0.2、磷酸二氢钾0.6、尿素0.5、安琪酵母粉(FM888)2、V

配方9：以总糖计的玉米液化清液25、硫酸镁0.4、硫酸铵0.2、磷酸二氢钾0.6、尿素0.5、安琪酵母粉(FM888)2、V

配方10：以总糖计的玉米液化清液25、硫酸镁0.4、硫酸铵0.2、磷酸二氢钾0.6、尿素0.5、安琪酵母粉(FM888)2、V

配方11：以总糖计的玉米液化清液25、硫酸镁0.4、硫酸铵0.2、磷酸二氢钾0.6、尿素0.5、安琪酵母粉(FM888)2、V

配方12：以总糖计的玉米液化清液25、硫酸镁0.4、硫酸铵0.2、磷酸二氢钾0.6、尿素0.5、安琪酵母粉(FM888)2、高核苷酸酵母粉1、V

配方13：以总糖计的玉米液化清液25、硫酸镁0.4、硫酸铵0.2、磷酸二氢钾0.6、尿素0.5、高核苷酸酵母粉2、V

步骤II.胡萝卜的处理

将所述重量份的新鲜胡萝卜切块粉碎，与原料中的部分水混合，匀浆处理，固液分离，取胡萝卜汁备用；

步骤III.液体培养基的配制和定容

将步骤II得到的所述胡萝卜汁和其他原料混合，必要时加水使各组分达到所述浓度，搅拌均匀，调pH6.0，灭菌，即得。

将上述制备的液体培养基用于红平菇的摇瓶培养，具体操作为：

步骤1.菌种活化

将低温保藏的红平菇斜面菌种切取小块接入PDA琼脂平板中央，进行菌种活化培养，培养条件为25℃恒温培养箱培养7～8天，待菌丝布满整个平板即可；

步骤2.摇瓶培养

用直径为0.5cm打孔器在培养7～8天的红平菇菌丝平板上打取4～5块菌块，分别接入装有本实施例制备的红平菇液体培养基的摇瓶中，摇瓶规格为500mL，装液量150mL，按照原料中玉米淀粉或制备所述玉米液化清液所用玉米粉的质量加入糖化酶70U/g，25℃恒温培养箱150rpm震荡培养6天，离心进行固液分离，用纯水清洗得到的菌丝体2次，离心后的固态菌丝体100℃烘干至恒重，计算菌丝体干重。采用凯氏定氮仪检测含氮量，并计算粗蛋白含量。结果见表1。

表1实施例1各液体培养基对红平菇菌丝体生长的影响

比较上表数据可知：

1)比较配方1、2和3可知，玉米液化清液作为碳源对菌丝体产量有明显提高作用，因此本发明优选玉米液化清液作为碳源。

2)比较配方2、4～10可知，适量的细菌纤维素对菌丝体产量有明显促进作用，且在110～200目范围内粒径越小越有利于菌丝体生长；但是细菌纤维素用量过大反而不利于菌丝体的生长。因此，优选细菌纤维素粒径为110～200目筛下物，更优选200目筛下物；所述液体培养基中细菌纤维素的含量为1～2g/L，更优选为2g/L。

3)比较配方6和11可知，添加胡萝卜汁能够促进菌丝体的生长。

4)比较配方2、12和13可知，与普通酵母粉相比，添加适量高核苷酸酵母粉对菌丝体蛋白质的合成有显著提升作用。因此优选的酵母粉为高核苷酸酵母粉。

通过上述实验，优选出的红平菇菌丝体的液体培养基的原料组成为：

以总糖计的玉米液化清液25g/L、硫酸镁0.4g/L、硫酸铵0.4g/L、磷酸二氢钾0.6g/L、尿素0.5g/L、高核苷酸酵母粉2g/L、110～200目筛下的细菌纤维素2g/L、V

实施例2红平菇菌丝体的液体发酵

本实施例所用的液体培养基的配方分别为：

配方2(g/L)：以总糖计的玉米液化清液25、硫酸镁0.4、硫酸铵0.2、磷酸二氢钾0.6、尿素0.5、安琪酵母粉(FM888)2、V

配方14(g/L)：以总糖计的玉米液化清液25、硫酸镁0.4、硫酸铵0.4、磷酸二氢钾0.6、尿素0.5、高核苷酸酵母粉2、200目筛下的细菌纤维素2、 V

按照实施例1所述的制备方法分别制备得到液体培养基；然后按照如下步骤通过液体发酵制备红平菇菌丝体：

步骤1.菌种活化

将低温保藏的红平菇斜面菌种切取小块接入PDA琼脂平板中央，进行菌种活化培养，培养条件为25℃恒温培养箱培养7～8天，待菌丝布满整个平板即可；

步骤2.摇瓶培养

用直径为0.5cm打孔器在培养7～8天的红平菇菌丝平板上打取4～5块菌块，分别接入装有本实施例制备的红平菇液体培养基的摇瓶中，摇瓶规格为500mL，装液量150mL，25℃恒温培养箱150rpm震荡培养6天，得到红平菇种子液；

步骤3.接种发酵

将步骤2得到的所述红平菇种子液按照接种量15％，利用火焰接种法分别接入预先加入上述液体培养基的红平菇发酵罐(3L)，参数设置为：装液量为 50％，以所述液体培养基原料中的玉米粉的质量为基准添加糖化酶20～100U/g，搅拌速度150～300rpm，温度25℃，溶氧50％以上，压力0.05～0.1Mpa，培养发酵至糖含量＜1g/L且菌丝体形态完整；发酵结束后排出发酵液总体积的70％，然后补充新的液体发酵培养基，继续同条件培养发酵。

步骤4.固液分离收集菌丝体

通过离心和/或过滤处理步骤3得到的发酵液，分离得到的菌丝体按照实施例1所述方法测定粗蛋白含量，结果见表2。

表2不同液体培养基及发酵方式对菌丝体蛋白质合成的影响

表2的数据示出：配方14的液体培养基促进菌丝体生长及蛋白质合成的作用好于配方2。分批补料方式发酵可以大幅度缩短达到发酵终点的时间，提高生产效率。

实施例3植物素肉的制备

1.红平菇菌丝体的后处理

实施例2得到的两种配方发酵菌丝体通过离心进行固液分离，加入菌丝体湿重40倍的水制成悬浮液，匀浆工艺采用三种搅拌转速，分别为500r/min、 2000r/min和10000r/min，通过离心进行固液分离，得到匀浆后的红平菇菌丝体，称重，分别计为：

配方2-500、配方2-2000、配方2-10000；

配方14-500、配方14-2000、配方14-10000。

在40倍显微镜下观察菌丝体的状态，其中配方14-500、配方14-2000和配方14-10000的菌丝体在40倍显微镜下的照片，见图1。两种配方发酵菌丝体都呈现相似的状态：

配方2-500和配方14-500(匀浆转速500r/min)：部分菌丝体结团；

配方2-2000和配方14-2000(匀浆转速2000r/min)：分散均匀，未观察到菌丝体断裂；

配方2-10000和配方14-10000(匀浆转速10000r/min)：分散均匀，但菌丝体断裂显著。

因此，优选匀浆的转速为500r/min以上，但低于10000r/min；更优选为 1000～2500r/min，最优选为2000r/min。

2.植物素肉的制备

将商品化成品拉丝蛋白完全浸泡在水中，至复水率不低于120％；对复水后的拉丝蛋白进行拆丝，使拆丝均一、无硬芯、无大块异物，丝宽不大于0.5cm，得到拆丝后的拉丝蛋白，称重，备用；上述匀浆后的红平菇菌丝体加水悬浮，与拆丝后的拉丝蛋白混合，得到混料；其中，以所述匀浆后的红平菇菌丝体和所述拆丝后的拉丝蛋白的总质量为基准，所述匀浆后的红平菇菌丝体分别占30 或60％，余量为所述拆丝后的拉丝蛋白；

所述混料通过螺杆挤压机挤压成型，得到成型坯料；其中，挤压过程中调节加水量使成型坯料中水的质量百分比含量为50～60％，挤出机模头温度 100～140℃；得到的成型坯料干燥至水的质量百分比含量20％以下，即得到所述植物素肉。

使用质构仪对制备得到的各样品进行进行质构分析(TPA)试验，选用 AB/E-d35柱形探头分析其内聚性和弹性。同时测定一款市售的植物素肉的相关指标。菌丝体添加60％的成品肉质紧实度不好，制得的植物素肉质地疏松，不适于后续的工业加工。菌丝体添加30％的成品肉质感好，质地紧实，具有菇香味和鲜美味。因此，本发明优选植物素肉原料中菌丝体(湿重)的质量占比为10％～30％，更优选为30％。

菌丝体占比30％的植物素肉的测定结果见表3，其中配方14-2000制备的植物素肉的成品照片见图2。

表3不同植物素肉的品质

表3的数据显示，匀浆不充分的菌丝体(匀浆转速500r/min)使得成品颗粒感明显；相较之下，匀浆充分的菌丝体使得成品外观显著改善好。以素肉弹性指标来衡量，匀浆转速2000r/min得到的菌丝体制备的素肉相较其它转速更好。另外，配方14的菌丝体蛋白含量高于配方2的菌丝体，在两者在素肉中占比相同的情况下，配方14的菌丝体制成的素肉弹性更高。本发明特别优选配方14-2000作为植物素肉的食用菌原料。