一种茶叶中茅草枯、草芽畏、戊硝酚、消螨酚和毒菌酚的同步检测方法

技术领域

本发明属于农药残留检测技术领域，具体涉及一种茶叶中的茅草枯、草芽畏、戊硝酚、消螨酚和毒菌酚的同步检测方法。

背景技术

茶叶由于其富含茶多酚、儿茶素、黄酮等物质，具有醒脑提神、清热解毒等功效，因此深受人们的喜爱。在茶叶的生长过程中，为了除草和去害虫，茶农就会往茶树上喷洒农药，就会导致农药残留甚至超标。我国是茶叶生产、出口和消费大国，为了满足日趋严格的国内外茶叶中农药最大残留限量标准，保障茶叶质量安全，我国于2021年9月3日起正式实施的《食品安全国家标准食品中农药最大残留量》(GB 2763-2021)标准中规定了茶叶中最大残留限量的农药种类高达106项，为史上最严。其中新增的茅草枯、草芽畏、戊硝酚、消螨酚和毒菌酚在茶叶中的临时最大残留限量值均为0.01mg/kg。

截至目前，国内外仍尚未有茶叶中茅草枯、草芽畏、戊硝酚、消螨酚和毒菌酚检测方法的相关标准或者文献报道。关于茅草枯、草芽畏、戊硝酚、消螨酚和毒菌酚检测方法，仅有的标准和文献报道主要是针对水质或土壤中茅草枯或草芽畏的测定，其检测方法为采用二氯甲烷或固相萃取小柱萃取样品中的茅草枯或草芽畏，经浓缩丙酮复溶后，再采用五氟苄基溴进行衍生化，之后再对衍生物进行过柱净化，再复溶样品，最后采用气相色谱或气相色谱串联质谱法进行测定。该检测方法使用了大量的有机溶剂，并且样品前处理过程复杂、耗时长、成本高且检测项目有限，不符合当前倡导的绿色、高效、环保的主流要求。对于戊硝酚、消螨酚和毒菌酚这三个检测项目，在水质或土壤中目前尚未有相关文献报道，其检测方法处于技术空白点。

因此，亟需建立一种灵敏、准确、高效、便捷的茶叶中茅草枯、草芽畏、戊硝酚、消螨酚和毒菌酚的同步检测方法，以填补茶叶中茅草枯、草芽畏、戊硝酚、消螨酚和毒菌酚农药残留检测的技术空白点，为我国茶叶中茅草枯、草芽畏、戊硝酚、消螨酚和毒菌酚残留检测提供有力的技术支撑手段。

发明内容

本发明的目的是为了填补目前茶叶中茅草枯、草芽畏、戊硝酚、消螨酚和毒菌酚残留检测的技术空白点，而提供了一种新的茶叶中茅草枯、草芽畏、戊硝酚、消螨酚和毒菌酚的同步检测方法，该检测方法步骤简单、有机物用量少、对环境友好且回收率、重复性、灵敏度和检测限均满足当前国家标准(GB2763-2021)规定的临时最大残留限量值的要求。

具体地，本发明提供了一种茶叶中茅草枯、草芽畏、戊硝酚、消螨酚和毒菌酚的同步检测方法，其中，该方法包括如下步骤：

S1：样品前处理

称取适量待测茶叶样品于离心管中，采用水、甲酸和乙腈的混合溶液进行涡旋混合提取，接着加入氯化钠进行涡旋混匀后离心I；取上层清液加入无水硫酸镁、GCB和C18粉末进行涡旋混合净化后离心II；收集上层清液于35～45℃下氮吹至干，加入25％～35％v/v甲醇的水溶液复溶，最后经0.1～0.3μm滤膜过滤得到待测样品溶液，留待LC-MS/MS检测；其中，所述待测茶叶样品与水、甲酸、乙腈以及氯化钠的比例为1g:(5～7.5)mL:(0.10～0.15)mL:(10～15)mL:(2～3)g；所述待测茶叶样品与无水硫酸镁、GCB和C18粉末的比例为1g:(600～900)mg:(200～300)mg:(100～150)mg；

S2：配制基质标准溶液

取阴性空白茶叶样品，按照步骤S1进行样品前处理，得到基质空白溶液；将茅草枯、草芽畏、戊硝酚、消螨酚和毒菌酚标准品用溶剂溶解并用基质空白溶液配制成分别具有2～50ng/mL浓度梯度的系列基质混合标准溶液；

S3：样品检测

将步骤S2中的茅草枯、草芽畏、戊硝酚、消螨酚和毒菌酚系列基质混合标准溶液进行LC-MS/MS测定，得到基质标准工作曲线；将步骤S1中的待测样品溶液进行LC-MS/MS测定，采用基质标准曲线外标法定量，将所得检测曲线与标准工作曲线进行比对，得到待测茶叶样品中茅草枯、草芽畏、戊硝酚、消螨酚和毒菌酚的含量。

需要说明的是，在本发明中，为了便于描述，将样品前处理过程中的两次离心称为“离心I”和“离心II”的目的仅是为了区别不同对象，而不能理解为指示或暗示其的相对重要性。所述“阴性空白茶叶样品”是指茅草枯、草芽畏、戊硝酚、消螨酚和毒菌酚的含量低于实验方法检测限的茶叶样品。

在一种优选的实施方式中，步骤S1中，所述涡旋混合提取的条件为涡旋10～15min。

在一种优选的实施方式中，所述涡旋混匀的条件为涡旋30～60s。

在一种优选的实施方式中，所述涡旋混合净化的条件为涡旋60～90s。

在一种优选的实施方式中，步骤S1中，所述离心I的条件包括离心转速为10000～20000rpm，离心时间为5～10min。

在一种优选的实施方式中，所述离心II的条件包括离心转速为10000～20000rpm，离心时间为5～10min。

在一种优选的实施方式中，步骤S1中，所述滤膜为有机滤膜，所述滤膜的孔径为0.22μm。

在一种优选的实施方式中，步骤S3中，所述LC-MS/MS测定过程中液相色谱条件包括：色谱柱为Waters BEH C18；柱温为35℃；流速为0.30mL/min；进样量为5μL；流动相以浓度为0.02％v/v的甲酸水溶液作为A相且以甲醇作为B相，采用梯度洗脱且梯度洗脱程序如下：0～0.3min的流动相为70％A相和30％B相的混合溶液，0.3～3.5min的流动相为70％～5％A相和30～95％B相的混合溶液，3.5～5min的流动相为5％A相和95％B相的混合溶液，5～5.1min的流动相为5％～70％A相和95～30％B相的混合溶液，5.1～8min的流动相为70％A相和30％B相的混合溶液。

在一种优选的实施方式中，步骤S3中，所述LC-MS/MS测定过程中质谱条件包括：采用Dionex Ultimate 3000/TSQ QUANTIVA超高效液相色谱质谱联用仪；离子源为ESI-；离子源电压为2800V；离子传输管温度为350℃；喷针温度为300℃。

在一种优选的实施方式中，所述茶叶为乌龙茶、红茶、绿茶、黑茶、白茶、砖茶、黄茶和代用茶中的至少一种。

在一种优选的实施方式中，所述草芽畏采用222.9和224.9两个同位素离子峰作为其母离子。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供了一种茶叶中茅草枯、草芽畏、戊硝酚、消螨酚和毒菌酚的同步检测方法，先采用水、甲酸和乙腈的混合溶液对待测茶叶样品进行涡旋混合提取，再加入氯化钠进行涡旋混匀后进行高速离心，在所得上层清液中加入无水硫酸镁、GCB和C18粉末涡旋混合净化，并且在样品前处理过程中将待测茶叶样品与水、甲酸、乙腈以及氯化钠的比例控制在1g:(5～7.5)mL:(0.10～0.15)mL:(10～15)mL:(2～3)g，将待测茶叶样品与无水硫酸镁、GCB和C18粉末的比例控制在1g:(600～900)mg:(200～300)mg:(100～150)mg；通过上述特定的样品前处理方式，能够将样品中影响测试结果的杂质如茶叶中色素、多糖有效去除，同时仅保留目标产物。通过本发明所提供的检测方法，可以同时对茅草枯、草芽畏、戊硝酚、消螨酚和毒菌酚这5种农药进行检测，5种农药的仪器检测限为0.1～0.8ng/mL，方法检测限为0.1～0.8μg/kg，且其在2～50ng/mL浓度范围的相关系数R

(2)对本发明中的5种农药的化学结构式进行分析可知，茅草枯、草芽畏为氯代酸性农药，戊硝酚、消螨酚和毒菌酚为带苯酚的酸性农药，这5种化合物均能提供质子，容易失去一个质子带负电。因此，本发明优选采用ESI负模式(ESI-)，实现了对这5种化合物的同步检测，从而提高了检测效率。

(3)草芽畏为三氯苯甲酸，由于其结构上有三个氯原子，在ESI负模式下会产生223、225、227及229四个同位素离子峰，其丰度比为27:27:9:1，因此本发明优选222.9和224.9两个丰度较大的离子峰作为其母离子。由于草芽畏的特殊结构，在施加碰撞能后，其母离子失去一分子羧酸根后，剩下三氯苯环结构，其化学结构稳定难以被打碎，因此在草芽畏的碎片离子中只得到一个三氯苯环碎片。本发明利用氯原子同位素分子量的差异，优选将质荷比为222.9母离子产生的178.8碎片离子作为定量离子，同时将224.9母离子产生的180.9碎片离子作为定性离子，实现了对草芽畏准确的定性和定量检测。

(4)本发明采用液相色谱串联质谱法对茅草枯、草芽畏、戊硝酚、消螨酚和毒菌酚5种农药进行测定，待测茶叶样品无需进行衍生化处理，简化了样品前处理实验步骤，同时在样品前处理过程中避免使用二氯甲烷等大量有机溶剂，提高了实验人员的人身安全性和实现了环境保护。

(5)在进行ESI负模式分析时，甲酸的添加会抑制母离子的电离效率，降低检测灵敏度，但是却可以改善液相流动相的pH值，使化合物在色谱柱上保留性能发生变化。本发明在采用ESI负模式对茅草枯、草芽畏、戊硝酚、消螨酚和毒菌酚5种农药进行检测时，在流动相中添加了体积比0.02％v/v的甲酸水溶液作为A相。经过测试所得5种农药的保留时间合理、分离度良好，峰形尖锐、对称且峰窄，不仅能够极大改善目标物的峰形，同时保证了目标物的灵敏度满足检测要求，能够更好的与其他杂质峰进行区分开，提高了定量和定性的准确性和灵敏性。

(6)本发明采用基质标准曲线外标法定量，能够有效地消除茶叶基质带来的基质效应，有效地校正回收率，使得实验结果具有更高的准确性和灵敏度。

附图说明

图1为茅草枯基质标准样品的标准曲线图；

图2为草芽畏基质标准样品的标准曲线图；

图3为戊硝酚基质标准样品的标准曲线图；

图4为消螨酚基质标准样品的标准曲线图；

图5为毒菌酚基质标准样品的标准曲线图；

图6(a)为2ng/mL茅草枯、(b)为2ng/mL草芽畏、(c)为2ng/mL戊硝酚、(d)为2ng/mL消螨酚和(e)为2ng/mL毒菌酚的提取离子流图；

图7(a)为10ng/mL茅草枯、(b)为10ng/mL草芽畏、(c)为10ng/mL戊硝酚、(d)为10ng/mL消螨酚和(e)为10ng/mL毒菌酚在流动相A相为纯水时的提取离子流图；

图8(a)为10ng/mL茅草枯、(b)为10ng/mL草芽畏、(c)为10ng/mL戊硝酚、(d)为10ng/mL消螨酚和(e)为10ng/mL毒菌酚在流动相A相为添加0.02％甲酸的提取离子流图。

具体实施方式

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

(1)本发明实施例和对比例中所涉及到的试剂药品如下：

茅草枯标准品(纯度99.9％，BePure)；草芽畏标准品(纯度99.3％，BePure)；戊硝酚标准品(纯度99.9％，BePure)；消螨酚标准品(纯度99.9％，BePure)；毒菌酚标准品(纯度99.5％，BePure)；甲醇(色谱纯，瑞典欧普森)；甲酸(质谱级，美国ACS化学试剂)；氯化钠(优级纯，西陇科学)；无水硫酸镁(分析纯，西陇科学)；GCB，即石墨化碳黑吸附剂(120～400目，上海安谱实验科技股份有限公司)；C18粉末(40～63μm，上海安谱实验科技股份有限公司)；水(符合GB/T6682-2008规定的一级水)。

(2)本发明实施例和对比例中所涉及到的实验仪器如下：

Waters BEH C18(2.1mm×100mm,1.7μm,Waters公司)；Dionex Ultimate3000/TSQQUANTIVA超高效液相色谱质谱联用仪(美国Thermo公司)；MTV-100多管旋涡混匀仪(北京金洋万达科技有限公司)；IKA MS3 Digital数显型旋涡混匀器(厦门锐思捷科学仪器有限公司)；柯瑞峰超纯水系统(四川德立世科技有限公司)；GL-20C-II高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；KQ-600DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；AutoEVA-60全自动平行浓缩仪(睿科集团(厦门)股份有限公司)；0.22μm聚四氟乙烯针头式过滤器(天津津腾实验设备有限公司)。

实施例1

S1：样品前处理

称取2g待测茶叶样品(精确至0.01g)于50mL离心管中，分别加入10mL水、0.2mL甲酸和20mL乙腈溶液后进行涡旋混合提取10min，接着加入4g氯化钠进行涡旋混匀30s后，在转速为10000rpm下离心5min，静置分层；移取上清液于50mL离心管中，加入1200mg无水硫酸镁，400mg GCB和200mg C18粉末，充分涡旋混合净化60s后，在转速为15000rpm下离心5min，静置分层；准确移取上清液10mL于45℃下进行水浴氮吹至近干，加入1mL30％v/v甲醇水溶液进行复溶混匀，最后经0.22μm有机微孔滤膜过滤获得待测样品溶液。

S2：配制标准溶液

(1)配制标准品：将草芽畏、戊硝酚、消螨酚和毒菌酚标准品分别用乙腈溶解配制成1.0mg/mL的标准储备溶液，将茅草枯标准品用乙腈稀释配制成100μg/mL的标准储备溶液，将上述所得标准储备溶液用乙腈稀释成浓度为1.0μg/mL混合标准工作溶液；

(2)配制基质标准溶液

选取茅草枯、草芽畏、戊硝酚、消螨酚和毒菌酚的含量低于实验方法检测限的茶叶样品作为阴性空白茶叶样品，按照步骤S1进行样品前处理，得到基质空白溶液，将步骤(1)中的标准工作溶液用基质空白溶液配制成分别具有2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL和50ng/mL浓度梯度的系列基质混合标准溶液。

S3：样品检测

将步骤S2中的茅草枯、草芽畏、戊硝酚、消螨酚和毒菌酚系列基质混合标准溶液进行LC-MS/MS测定，得到基质标准工作曲线；将步骤S1中的待测样品溶液进行LC-MS/MS测定，采用基质标准曲线外标法定量，将所得检测曲线与标准工作曲线进行比对，得到待测茶叶样品中茅草枯、草芽畏、戊硝酚、消螨酚和毒菌酚的含量。

LC-MS/MS测定过程中，液相色谱条件包括：色谱柱为Waters BEH C18(2.1mm×150mm,1.7μm)；柱温为35℃；流速为0.30mL/min；进样量为5μL；流动相以含0.02％v/v甲酸水溶液作为A相且以含甲醇作为B相，采用梯度洗脱且梯度洗脱程序如下：0～0.3min的流动相为70％A相和30％B相的混合溶液，0.3～3.5min的流动相为70％～5％A相和30～95％B相的混合溶液，A相和B相之间比例梯度均为线性变化，3.5～5min的流动相为5％A相和95％B相的混合溶液，5～5.1min的流动相为5％～70％A相和95～30％B相的混合溶液，A相和B相之间比例梯度均为线性变化，5.1～8min的流动相为70％A相和30％B相的混合溶液。

LC-MS/MS检测过程中，质谱条件包括：采用Dionex Ultimate 3000/TSQ QUANTIVA超高效液相色谱质谱联用仪；离子源为ESI-；离子源电压为2800V；离子传输管温度为350℃；喷针温度为300℃；质谱扫描信息具体见表1。

表1

表1中*为定量离子对

选择10倍信噪比时对应的浓度作为该目标物的检测限，茅草枯、草芽畏、戊硝酚、消螨酚和毒菌酚5种农药标准曲线相关系数所得结果见表2和图1～5，以及浓度为2ng/mL的茅草枯、草芽畏、戊硝酚、消螨酚和毒菌酚在上述检测条件下的提取离子流图的测试结果见图6。结果表明，这5种农药在2～50ng/mL的质量浓度范围内具有良好的线性关系，其相关系数R

表2

对比例1

与实施例1不同的是，在样品检测时，选择不添加0.02％v/v的甲酸水溶液作为A相(也即直接纯水作为A相)，其余条件均与实施例1相同，所得测试结果对比如图7和图8所示。已知在进行ESI负模式分析时，甲酸的添加会抑制母离子的电离效率，降低检测的灵敏度，但是却可以改善液相流动相的pH值，使化合物在色谱柱上保留性能发生变化。从图7和图8结果可知，当纯水作为A相时，测试所得的5种农药的保留效果均较差，不同程度上地出现了峰形展宽甚至产生裂峰现象。然而在进行样品检测时，在纯水中添加了体积比0.02％v/v的甲酸作为A相，测试所得的5种农药保留时间合理、分离度良好，其峰形尖锐、对称且峰窄。由此说明，在纯水中添加了体积比0.02％v/v的甲酸作为A相，不仅能够极大改善目标物的峰形，同时还保证了目标物的灵敏度满足检测要求，能够更好地与其他杂质峰进行区分开，提高了定量和定性的准确性和灵敏性。因此，本发明选择浓度为0.02％v/v的甲酸水溶液作为A相且以甲醇作为B相作为流动相。

测试例

以市售的铁观音、金骏眉和普洱茶作为测试对象，采用阴性样品分别加标5μg/kg、20μg/kg和40μg/kg的茅草枯、草芽畏、戊硝酚、消螨酚和毒菌酚5种农药标准溶液，同时做平行试验(n＝6)，测定回收率及相对标准偏差(RSD)见表3。从表3实验数据结果显示，在三个加标浓度条件下5种农药的回收率在60.2％～91.1％，相对标准偏差RSD(n＝6)在2.6％～8.8％。上述测定结果符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求。

表3

应用本发明所提供的茶叶中茅草枯、草芽畏、戊硝酚、消螨酚和毒菌酚的同步检测方法，对100个批次的市售茶叶进行检测，结果显示所有样品均未检出上述5种农药残留。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。