一种光敏性水凝胶材料在制备促进皮肤伤口愈合和/或毛囊再生产品中的应用及产品

技术领域

本发明属于皮肤毛发再生技术领域，尤其涉及一种光敏性水凝胶材料在制备促进皮肤伤口愈合和/或毛囊再生产品中的应用及产品。

背景技术

组织工程皮肤是一种较为完善的组织工程化组织，是将真皮成纤维细胞与细胞外基质替代物混合制成人工皮肤。根据组织工程皮肤的结构不同将其分为三大类：表皮替代物、真皮替代物和全皮替代物。表皮替代物由生长在可降解基质或聚合物膜片上的表皮细胞组成。真皮替代物含有活细胞或不含细胞成分的基质结构，用来诱导成纤维细胞的迁移、增殖和分泌细胞外基质。而全皮替代物包含以上2种成分，既有表皮结构又有真皮结构。根据组织工程皮肤的构建方法不同也分三大类：由种子细胞和支架材料体外三维构建培养的组织工程皮肤、由细胞组成的组织工程化皮肤和由支架材料构成的组织工程化皮肤。

现有的利用组织工程皮肤治疗皮肤缺损的方法为：选取构建组织工程皮肤需要的种子细胞及支架材料；在体外构建出组织工程支架，并将种子细胞种植于支架表面；在体外培养接种细胞的组织工程支架约14天至组织工程皮肤具有一定皮肤活性和功能；将组织工程皮肤移植至患者皮肤缺损部位，治疗皮肤缺损。在体外培养组织工程皮肤的方法，由于组织支架与皮肤伤口的形貌、面积、深度难以完全贴合，使得工程皮肤修复创口的效果仍不理想。而通过原位3D打印技术将接种细胞的支架材料直接打印在伤口表面利用其利内微环境进行修复，可以很好的解决上述问题。

然而，现有3D打印修复皮肤伤口的方法中，由于采用的支架材料生物相容性较差、打印性差，难以有效促进皮肤伤口愈合以及毛囊再生。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种光敏性水凝胶材料在制备促进皮肤伤口愈合和/或毛囊再生产品中的应用及产品。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种光敏性水凝胶材料在制备促进皮肤伤口愈合和/或毛囊再生产品中的应用，所述光敏性水凝胶材料包括甲基丙烯酸酐化透明质酸、甲基丙烯酸酐化明胶中的任意一种或两种。

优选的，所述促进皮肤伤口愈合和/或毛囊再生产品包括光敏性水凝胶材料、种子细胞和光引发剂。

优选的，所述种子细胞包括表皮干细胞和真皮干细胞。

优选的，所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)、irgacure2959中的一种或两种，所述促进皮肤伤口愈合和/或毛囊再生产品中所含光引发剂的质量浓度为 0.1％-1％。

优选的，所述光敏性水凝胶材料为甲基丙烯酸酐化透明质酸时，所述促进皮肤伤口愈合和/或毛囊再生产品中所含甲基丙烯酸酐化透明质酸的质量浓度为1％-10％。

优选的，所述光敏性水凝胶材料为甲基丙烯酸酐化明胶时，所述促进皮肤伤口愈合和/或毛囊再生产品中所含甲基丙烯酸酐化明胶的质量浓度为2.5％-20％。

优选的，所述光敏性水凝胶材料为甲基丙烯酸酐化透明质酸和甲基丙烯酸酐化明胶时，所述促进皮肤伤口愈合和/或毛囊再生产品中所含甲基丙烯酸酐化透明质酸的质量浓度为 0.1％-2.5％，所含甲基丙烯酸酐化明胶的质量浓度为1％-20％。

优选的，所述促进皮肤伤口愈合和/或毛囊再生产品的制备方法包括以下步骤：

(1)提取、培养及收集种子细胞；

(2)制备光敏性水凝胶材料；并将光敏性水凝胶材料与含有光引发剂的溶液中混合，得混合物；

(3)将经步骤(1)得到的表皮干细胞、真皮干细胞与经步骤(2)得到的混合物混合均匀，即得。

更优选的，所述光敏性水凝胶材料甲基丙烯酸酐化透明质酸的制备方法包括以下步骤：

(1)将透明质酸溶解于蒸馏水中，透明质酸与蒸馏水的质量体积比为2g：100mL，4℃下搅拌，得透明质酸溶液；向所述透明质酸溶液中加入甲基丙酸烯酐，所述透明质酸与甲基丙酸烯酐的质量体积比为2g：8mL，室温搅拌反应24h，反应完成后得反应液；

(2)向所述反应液中加入蒸馏水，然后在去离子水中透析7天，将透析后所得溶液冷冻干燥5天，得甲基丙烯酸酐化透明质酸冻干粉，-20℃下储存，备用；

所述光敏性水凝胶材料甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶的制备方法包括以下步骤：

(1)将明胶溶解于DPBS中，明胶与DPBS的质量体积比为10g：100mL，60℃下搅拌，得明胶溶液；向所述明胶溶液中加入甲基丙酸烯酐，所述明胶与甲基丙酸烯酐的质量体积比为10g：8mL，60℃下搅拌反应3h，反应完成后得反应液；

(2)向所述反应液中加入蒸馏水，然后在去离子水中37℃下透析7天，将透析后所得溶液冷冻干燥2天，得甲基丙烯酸酐化明胶冻干粉，-20℃下储存，备用。

作为一个总的发明过构思，本发明提供了一种促进皮肤伤口愈合和/或毛囊再生产品，包括光敏性水凝胶材料、种子细胞和光引发剂，所述光敏性水凝胶材料包括甲基丙烯酸酐化透明质酸、甲基丙烯酸酐化明胶中的任意一种或两种。

优选的，所述光敏性水凝胶材料为甲基丙烯酸酐化透明质酸时，所述促进皮肤伤口愈合和/或毛囊再生产品中所含甲基丙烯酸酐化透明质酸的质量浓度为1％-10％；

所述光敏性水凝胶材料为甲基丙烯酸酐化明胶时，所述促进皮肤伤口愈合和/或毛囊再生产品中所含甲基丙烯酸酐化明胶的质量浓度为2.5％-20％；

所述光敏性水凝胶材料为甲基丙烯酸酐化透明质酸和甲基丙烯酸酐化明胶时，所述促进皮肤伤口愈合和/或毛囊再生产品中所含甲基丙烯酸酐化透明质酸的质量浓度为0.1％-2.5％，所含甲基丙烯酸酐化明胶的质量浓度为1％-20％。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明中，甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶、甲基丙烯酸酰化透明质酸水凝胶具有很好的生物相容性，其生物相容性优于基质胶，可以作为皮肤干细胞进行伤口愈合及毛囊再生的支撑材料，实现含有毛囊的皮肤损伤修复，可用于临床应用；而且本发明采用的水凝胶具有可打印性，尤其是应用于皮肤原位打印修复上有优势。

(2)本发明选用表皮干细胞与真皮干细胞的混合物作为种子细胞，两种细胞能够更好地模拟皮肤的真实结构，相比于传统的组织工程皮肤，在可再生毛囊、皮脂腺方面更接近天然皮肤，用于皮肤损伤创面修复、皮肤结构再生的效果更好，能够更有效恢复皮肤的功能。

(3)本发明采用光敏性水凝胶材料(甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶、甲基丙烯酸酰化透明质酸水凝胶)可以在体外进行组织工程支架的打印，也可以在皮肤缺损部位进行原位生物打印以实现皮肤损伤修复。

(4)本发明中的光敏性水凝胶材料具有光敏性，在没有进行光交联之前是流体，不仅可以与细胞进行很好的混合，同时可以很好的与皮肤伤口贴合。

(5)本发明中的光固化水凝胶的光固化时间为1-30s，相对于matrigel(基质胶)、I型胶原具有成型快的特点且具有可打印性。

(6)本发明可用于伤口愈合即皮肤烧伤、损伤等领域的治疗，同时可用于毛囊再生包括毛发移植、地中海等脱发问题的治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是各水凝胶的制备过程示意图和相关化学方程式；其中，(a)为GelMA水凝胶的制备过程示意图；(b)为GelMA合成的化学方程式；(c)为HAMA水凝胶的制备过程示意图；(b)为HAMA合成的化学方程式；

图2是不同质量浓度的水凝胶的外观图片和水凝胶的冻干图；其中，(a)为不同质量浓度的GelMA水凝胶的外观图片；(b)为不同质量浓度的冻干GelMA水凝胶的外观图片；(c) 为不同质量浓度的GelMA水凝胶的扫描电镜图；(d)为不同质量浓度的冻干GelMA水凝胶的扫描电镜图；(e)为不同质量浓度的GelMA溶液的外观图片；(f)为不同质量浓度的GelMA水凝胶的外观图片；

图3是小鼠组织工程皮肤创伤修复过程中真皮干细胞的情况；其中，(a)为真皮干细胞在2.5％GelMA水凝胶的形态图及细胞活死染色图，显示真皮干细胞在GelMA胶的存活率约为80％；(b)为真皮干细胞AP染色图，结果显示GelMA胶可以很好地维持真皮干细胞的干性，与正常培养几乎无差异。

图4是小鼠组织工程皮肤创伤修复实验图；其中，(a)为GelMA水凝胶用于小鼠伤口毛囊再生模型的过程图；(b，d)为2.5％GelMA及5％GelMA水凝胶用于小鼠伤口皮肤的再生图；(c)为Biotin免疫荧光图，结果显示再生的皮肤含皮脂腺；(d)为CD31免疫荧光图，结果显示再生的皮肤含血管；(f，g)为HE染色及免疫荧光染色检测图，结果显示伤口得到了很好的修复，不仅有表皮、真皮，并且有毛囊、皮脂腺等附属器官结构。

图5是机械臂原位生物打印GelMA水凝胶及皮肤干细胞用于小鼠皮肤损伤修复的实验图，其中，(a)为机械臂原位生物打印GelMA水凝胶及皮肤干细胞用于小鼠皮肤损伤修复的过程；(b-d)为3％％GelMA水凝胶及5％GelMA水凝胶用于小鼠伤口皮肤的再生图；(f,g) 为HE染色及免疫荧光染色图；(h)为CD31免疫荧光图；(i)Biotin免疫荧光结果显示再生的皮肤含皮脂腺；

图6是2.5％HAMA水凝胶用于小鼠伤口的皮肤再生修复图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例：

一种光敏性水凝胶材料在制备促进皮肤伤口愈合和/或毛囊再生产品中的应用，促进皮肤伤口愈合和/或毛囊再生产品包括光敏性水凝胶材料、种子细胞和光引发剂；光敏性水凝胶材料为甲基丙烯酸酐化透明质酸、甲基丙烯酸酐化明胶中的任意一种或两种。

促进皮肤伤口愈合和/或毛囊再生产品的制备方法如下：

1、表皮干细胞的提取、培养及收集

将生后1-3天C57新生小鼠用碘酒和酒精消毒后，剪取出背部皮肤，然后将皮肤组织剪成6-10mm

2、真皮干细胞的提取、培养及收集

真皮干细胞的分离是用蛋白分散酶(dispase II)将真皮与表皮分开后，取真皮组织用无菌剪刀充分切碎，用胶原酶(Collagenase I)37℃消化40-60min后过40μm的细胞筛。1300 rpm离心5min收集细胞，并用DMEM/F12洗细胞一次，用细胞计数板进行计数。将分离的真皮细胞种于10cm表面未处理的细胞培养皿中，加入10mL含B27的DMEM/F12培养基，并添加EGF和bFGF，于37℃、5％CO

3、甲基丙烯酸酐化透明质酸冻干粉的制备

2克透明质酸完全溶解在100毫升的蒸馏水中，4℃使用磁力搅拌。8毫升的甲基丙酸烯酐(MA)添加到透明质酸溶液中，室温搅拌24h。反应完成后向反应液中加入400毫升蒸馏水，然后在去离子水中透析约1星期。HAMA溶液冷冻干燥5天，得甲基丙烯酸酐化透明质酸冻干粉，储存在-20℃，供以后使用。

4、甲基丙烯酸酐化明胶冻干粉的合成

10克明胶完全溶解在100毫升的DPBS中，60℃使用磁力搅拌。8毫升的甲基丙酸烯酐 (MA)添加到明胶溶液，60℃搅拌在3h。反应完成后加入400毫升蒸馏水稀释明胶溶液，然后用去离子水透析37℃约1星期。然后GelMA冷冻干燥2天，得甲基丙烯酸酐化明胶冻干粉，储存在-20℃，供以后使用。

5、促进皮肤伤口愈合和/或毛囊再生产品的制备

将0.05g LAP光引发剂加入到含有10mL PBS缓冲液的棕色瓶子中，并放入60℃水浴中溶解10分钟，期间震荡3次，将溶解好的光引发剂溶液用0.22μm无菌过滤器过滤后放于4℃下储存，得含光引发剂的PBS缓冲液；

将光敏性水凝胶材料(甲基丙烯酸酐化透明质酸冻干粉和/或甲基丙烯酸酐化明胶冻干粉) 加入到含光引发剂的PBS缓冲液中，60℃水浴中溶解30分钟，期间震荡3次，得光敏性水凝胶材料溶液，再立即用0.22μm无菌过滤器过滤，-20℃下储存，得光敏性水凝胶材料/光引发剂混合物，备用。

当光敏性水凝胶材料为甲基丙烯酸酐化透明质酸时，促进皮肤伤口愈合和/或毛囊再生产品中所含甲基丙烯酸酐化透明质酸的质量浓度为1％；

当光敏性水凝胶材料为甲基丙烯酸酐化明胶时，促进皮肤伤口愈合和/或毛囊再生产品中所含甲基丙烯酸酐化明胶的质量浓度为2.5％、5％；

当光敏性水凝胶材料为甲基丙烯酸酐化透明质酸和甲基丙烯酸酐化明胶时，促进皮肤伤口愈合和/或毛囊再生产品中所含甲基丙烯酸酐化透明质酸的质量浓度为0.5％，所含甲基丙烯酸酐化明胶的质量浓度为2.5％；

促进皮肤伤口愈合和/或毛囊再生产品中所含光引发剂的质量浓度为0.5％。

将表皮干细胞与真皮干细胞分离培养好后重悬于PBS中，300g离心5min收集细胞。取离心后的细胞，弃上清，在细胞沉淀中加入50μL光敏性水凝胶材料/光引发剂混合物中混匀，即得促进皮肤伤口愈合和/或毛囊再生产品，其中表皮干细胞的密度约为5×10

将光敏性水凝胶材料/光引发剂混合物在紫外光或可见光下固化，得到固化后的水凝胶。其中，图1是各水凝胶的制备过程示意图和相关化学方程式；其中，(a)为GelMA水凝胶的制备过程示意图；(b)为GelMA合成的化学方程式；(c)为HAMA水凝胶的制备过程示意图；(d)为HAMA合成的化学方程式。

图2是不同质量浓度的水凝胶的外观图片和水凝胶的冻干图；其中，(a)为不同质量浓度的GelMA水凝胶的外观图片；(b)为不同质量浓度的冻干GelMA水凝胶的外观图片；(c) 为不同质量浓度的GelMA水凝胶的扫描电镜图；(d)为不同质量浓度的冻干GelMA水凝胶的扫描电镜图；(e)为不同质量浓度的GelMA溶液的外观图片，可见GelMA溶液在常温下流动性非常好；(f)为不同质量浓度的GelMA水凝胶的外观图片。

6、皮肤伤口的建立

在4-6周裸鼠背部用打孔器制造直径不同的圆型全层伤口(直径分别为2mm，5mm，10mm)。

7.可光固化水凝胶进行皮肤损伤修复

在上述小鼠上开展组织工程皮肤修复创伤为实例。

通过移液枪移植到小鼠皮肤缺损处或者通过用1mL规格注射器吸取含细胞水凝胶，连接 0.26mm内径打印喷头，并调节好六轴机械臂的打印温度、运动速度。参数调节完成后六轴机械臂根据三维扫描仪以及视觉识别系统的指令，在皮肤伤口上进行原位打印修复。打印修复完成后，光固化时间为1-30s，用3M膜覆盖、绑带包扎。然后在不同的时间取伤口皮肤固定染色检测伤口愈合及皮肤再生情况。

图3中，(a)为真皮干细胞在2.5％GelMA水凝胶的形态图及细胞活死染色图，显示真皮干细胞在GelMA胶的存活率约为80％；(b)为真皮干细胞AP染色图，结果显示GelMA 胶可以很好地维持真皮干细胞的干性，与正常培养几乎无差异。

图4中，(a)为GelMA水凝胶用于小鼠伤口毛囊再生模型的过程图；(b，d)为2.5％GelMA及5％GelMA水凝胶用于小鼠伤口皮肤的再生图；(c)为Biotin免疫荧光图，结果显示再生的皮肤含皮脂腺；(d)为CD31免疫荧光图，结果显示再生的皮肤含血管；(f,g) 为HE染色及免疫荧光染色检测图，结果显示伤口得到了很好的修复，不仅有表皮、真皮，并且有毛囊、皮脂腺等附属器官结构。

图5中，(a)为机械臂原位生物打印GelMA水凝胶及皮肤干细胞用于小鼠皮肤损伤修复的过程；(b-d)为3％％GelMA水凝胶及5％GelMA水凝胶用于小鼠伤口的皮肤再生修复图；(f,g)为HE染色及免疫荧光染色图，检测结果显示伤口得到了很好的修复，不仅有表皮、真皮，并且有毛囊、皮脂腺等附属器官结构；(h)为CD31免疫荧光图，结果显示再生的皮肤含血管；(i)Biotin免疫荧光结果显示再生的皮肤含皮脂腺。

图6为2.5％HAMA水凝胶用于小鼠伤口的皮肤再生修复图。

综上所述，说明本发明采用甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶、甲基丙烯酸酰化透明质酸水凝胶作为支架材料具有很好的生物相容性，其生物相容性优于基质胶，可以作为皮肤干细胞进行伤口愈合及毛囊再生的支撑材料，实现含有毛囊的皮肤损伤修复；而且本发明采用的水凝胶具有可打印性，尤其是应用于皮肤原位打印修复上有优势。本发明的产品可用于伤口愈合即皮肤烧伤、损伤等领域的治疗，同时可用于毛囊再生包括毛发移植、地中海等脱发问题的治疗。