TRPA1激动剂在制备防治造影剂肾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药制备技术领域，尤其涉及TRPA1激动剂在制备防治造影剂肾病药物中的应用。

背景技术

造影剂肾病(contrast-induced nephropathy，CIN)是指在使用含碘造影剂后短时间内出现的急性肾功能损伤，冠脉介入手术不断进步和影像学硬件设施的快速升级，造成含碘造影剂使用需求不断增加，CIN的发病率随之上升。CIN的诊断标准尚不完全统一，根据KDIGO的最新推荐，排除其他病因干扰，造影剂使用后48h内肌酐水平比基线值升高超过0.3mg/dL(26.5μmol/L)，或在7天内至少升高1.5倍基线值，则可诊断为CIN。且推荐CIN以预防为主，包括减少造影剂剂量、减少肾脏毒性药物的使用、术前术后水化以及使用更加安全的造影剂等。目前没有任何一种药物得到循证医学的推荐用于预防治疗CIN，缺乏特异性的预防治疗手段。因此，寻求一种安全有效的方法来预防或逆转造影剂导致的肾损伤是非常必要的。

CIN的机制涉及造影剂的直接毒性作用、肾脏灌注改变、氧化应激、细胞凋亡、炎症反应等，其中氧化应激似乎起到了主导性作用。特异性抗氧化剂药物对CIN的肾功能有保护作用，间接证明了CIN的发病与氧化应激密切相关。当造影剂随血液进入肾脏后，其高粘滞性可使肾血管和肾小管内液体的粘度增加，血流速度减慢，降低肾脏血流灌注和原尿的生成，对肾小管上皮细胞和血管内皮细胞产生直接的毒性作用，坏死小管上皮细胞从基底膜脱落至肾小管管腔，导致压力升高，管腔梗阻，肾小球滤过率降低。

研究发现，早期肾脏对于造影剂的反应是快速、短暂的血管扩张，随着内皮细胞功能障碍，扩血管物质生成减少、缩血管物质增加，可出现持续的血管收缩，最终导致肾脏缺血。同时造影剂的高渗透性还可引起渗透性利尿，进一步加重肾脏负担，增加组织耗氧量，导致肾脏缺血和缺氧加重。过量产生的活性氧物质(reactive oxygen species，ROS)可抑制一氧化氮合酶(nitric oxide synthetase，NOS)和前列环素合酶的功能，导致一氧化氮(nitric oxide，NO)和前列腺素(prostaglandin，PG)生成减少。因此氧化应激被认为在CIN发病机制中发挥了重要作用。在以HK-2细胞和MDCK细胞为实验对象的研究中，给予特异性的药物干预，可降低ROS的产生，减少细胞凋亡。在给予抗氧化剂干预后，可以提高HK-2细胞的活力。有研究发现维生素E、L-肉碱、HSA-Trx、n-乙酰半胱氨酸等抗氧化剂在大鼠CIN模型中具有一定的保护作用。

瞬时受体电位通道A1(transient receptor potential ankyrin 1，TRPA1)是一种非选择性阳离子通道蛋白。TRPA1拥有6个跨膜螺旋结构(trans-membrane domain，TM)，TM5和TM6亲水区域之间形成一个孔环区域，这两个跨膜结构域收敛并形成通道的中心腔，其-NH

发明内容

本申请为了解决上述技术问题提供TRPA1激动剂在制备防治造影剂肾病药物中的应用，利用本发明人另一篇相关专利申请文件中构建的造影剂肾病小鼠模型，通过使用TRPA1的激动剂异硫氰酸烯丙酯(Allyl isothiocyanate，以下简称AITC)和抑制剂HC030031，观察TRPA1激动剂在造影剂肾病中的作用，并初步探究其在造影剂肾损中作用的潜在机制。

本申请通过下述技术方案实现：

TRPA1激动剂在制备防治造影剂肾病药物中的应用。

进一步的，所述TRPA1激动剂通过激活TRPA1防治造影剂导致的肾病。

优选地，所述TRPA1激动剂包括桂皮醛、芥末油、辣椒素、大蒜素中的至少一种。

进一步的，所述TRPA1激动剂包括AITC。

优选地，所述TRPA1激动剂还包括DMSO溶液和生理盐水，所述AITC的浓度为2mg/mL。

进一步的，所述AITC的用量为10mg/Kg体重。

进一步的，所述造影剂包括碘克沙醇；所述碘克沙醇的用量为10mL/Kg体重。

进一步的，所述应用包括改善造影剂导致的肾功能损害和肾脏形态学损伤、降低肾脏组织氧化应激水平和MDA水平、增加肾脏组织SOD水平、减少肾小管细胞凋亡中的任一一个。

进一步的，所述肾小管细胞凋亡的评价指标包括凋亡蛋白mRNA水平和/或蛋白水平、抗凋亡蛋白mRNA水平和/或蛋白水平中的至少一种。

优选地，所述凋亡蛋白包括Bax、Caspase-3；所述抗凋亡蛋白包括Bcl-2。

与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：

本发明提供了TRPA1激动剂在制备防治造影剂肾病药物中的应用，通过TRPA1特异性激动剂异硫氰酸烯丙酯AITC的干预，TRPA1的药理性激动剂可通过降低肾脏ROS水平、增加抗氧化能力、减少肾小管上皮细胞病理性损伤及凋亡等方式显著降低造影剂导致的肾脏病理损害和肾功能损伤，探讨了TRPA1激动剂在造影剂肾病中的作用及其潜在机制，为造影剂肾病的有效防治提供了实验依据。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请实施方式的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施方式的限定。

图1中A是空白对照组小鼠实验的药物干预流程示意图，B是造影剂肾病组小鼠实验的药物干预流程示意图，C是溶剂对照组小鼠实验的药物干预流程示意图，D是激动剂组小鼠实验的药物干预流程示意图，E是抑制剂组小鼠实验的药物干预流程示意图；

图2中A是正常小鼠肾脏组织DAPI荧光染色分布图，B是正常小鼠肾脏组织AQP1荧光染色分布图，C是正常小鼠肾脏组织TRPA1荧光染色分布图，D是正常小鼠肾脏组织DAPI、AQP1、TRPA1混合荧光染色分布图，E是空白对照组小鼠肾脏TRPA1免疫组化染色分布图，F是造影剂肾病组小鼠肾脏TRPA1免疫组化染色分布图，G是溶剂对照组小鼠肾脏TRPA1免疫组化染色分布图，H是激动剂组小鼠肾脏TRPA1免疫组化染色分布图，I是抑制剂组小鼠肾脏TRPA1免疫组化染色分布图；

图3是各实验组小鼠肾脏TRPA1免疫组化染色光密度值统计图；

图4中A是各实验组肌酐含量变化示意图，B是各实验组尿素氮含量变化示意图；

图5中A是空白对照组小鼠肾脏组织H&E染色结果示意图，B是造影剂肾病组小鼠肾脏组织H&E染色结果示意图，C是溶剂对照组小鼠肾脏组织H&E染色结果示意图，D是激动剂组小鼠肾脏组织H&E染色结果示意图，E是抑制剂组小鼠肾脏组织H&E染色结果示意图，F是空白对照组小鼠肾脏组织H&E染色结果局部放大示意图，G是造影剂肾病组小鼠肾脏组织H&E染色结果局部放大示意图，H是溶剂对照组小鼠肾脏组织H&E染色结果局部放大示意图，I是激动剂组小鼠肾脏组织H&E染色结果局部放大示意图，J是抑制剂组小鼠肾脏组织H&E染色结果局部放大示意图；

图6是各实验组肾脏组织损伤程度评分示意图；

图7中A是空白对照组小鼠肾脏组织DHE染色结果示意图，B是造影剂肾病组小鼠肾脏组织DHE染色结果示意图，C是溶剂对照组小鼠肾脏组织DHE染色结果示意图，D是激动剂组小鼠肾脏组织DHE染色结果示意图，E是抑制剂组小鼠肾脏组织DHE染色结果示意图，F是空白对照组小鼠肾脏组织DAPI染色结果示意图，G是造影剂肾病组小鼠肾脏组织DAPI染色结果示意图，H是溶剂对照组小鼠肾脏组织DAPI染色结果示意图，I是激动剂组小鼠肾脏组织DAPI染色结果示意图，J是抑制剂组小鼠肾脏组织DAPI染色结果示意图，K是空白对照组小鼠肾脏组织DHE和DAPI混合染色结果示意图，L是造影剂肾病组小鼠肾脏组织DHE和DAPI混合染色结果示意图，M是溶剂对照组小鼠肾脏组织DHE和DAPI混合染色结果示意图，N是激动剂组小鼠肾脏组织DHE和DAPI混合染色结果示意图，O是抑制剂组小鼠肾脏组织DHE和DAPI混合染色结果示意图；

图8是各实验组肾脏组织DHE荧光强度统计图；

图9中A是各实验组小鼠肾脏组织中SOD水平统计图，B是各实验组小鼠肾脏组织中MDA水平统计图；

图10中A是空白对照组小鼠肾脏组织TUNEL染色结果示意图，B是造影剂肾病组小鼠肾脏组织TUNEL染色结果示意图，C是溶剂对照组小鼠肾脏组织TUNEL染色结果示意图，D是激动剂组小鼠肾脏组织TUNEL染色结果示意图，E是抑制剂组小鼠肾脏组织TUNEL染色结果示意图，F是空白对照组小鼠肾脏组织DAPI染色结果示意图，G是造影剂肾病组小鼠肾脏组织DAPI染色结果示意图，H是溶剂对照组小鼠肾脏组织DAPI染色结果示意图，I是激动剂组小鼠肾脏组织DAPI染色结果示意图，J是抑制剂组小鼠肾脏组织DAPI染色结果示意图，K是空白对照组小鼠肾脏组织TUNEL和DAPI混合染色结果示意图，L是造影剂肾病组小鼠肾脏组织TUNEL和DAPI混合染色结果示意图，M是溶剂对照组小鼠肾脏组织TUNEL和DAPI混合染色结果示意图，N是激动剂组小鼠肾脏组织TUNEL和DAPI混合染色结果示意图，O是抑制剂组小鼠肾脏组织TUNEL和DAPI混合染色结果示意图；

图11是各实验组肾脏组织凋亡细胞比率；

图12中A是激动TRPA1后各实验组小鼠肾脏TRPA1mRNA水平变化统计图，B是激动TRPA1后各实验组小鼠肾脏Bcl-2mRNA水平变化统计图，C是激动TRPA1后各实验组小鼠肾脏Caspase-3mRNA水平变化统计图，D是激动TRPA1后各实验组小鼠肾脏BaxmRNA水平变化统计图；

图13中A是激动TRPA1后各实验组小鼠肾脏目标蛋白表达量，B是激动TRPA1后各实验组小鼠肾脏TRPA1蛋白水平变化统计图，C是激动TRPA1后各实验组小鼠肾脏Bcl-2蛋白水平变化统计图，D是激动TRPA1后各实验组小鼠肾脏Caspase-3蛋白水平变化统计图，E是激动TRPA1后各实验组小鼠肾脏Bax蛋白水平变化统计图。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将结合实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施方式的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

实施例一

1.实验动物及分组

6-8周龄遗传背景为C57BL/6J的雄性小鼠，共25只，体重20-25g，购自成都达硕实验动物有限公司，饲养于成都医学院科研实验中心SPF级动物房内。

适应性喂养1周后，随机分为空白对照组(Control)、造影剂肾病组(CIN)、溶剂对照组(DMSO+CIN)、激动剂组(AITC+CIN)、抑制剂组(HC030031+CIN)，每组5只。

2.主要实验试剂配制

(1)吲哚美辛溶液配制：称取50mg吲哚美辛固体粉末，加入1mL DMSO溶解制成预溶液，适当加入浓度为5％的NaHCO

(2)亚硝基左旋精氨酸甲酯溶液配制：称取亚硝基左旋精氨酸甲酯粉末40mg，加入生理盐水定容至10mL，配制成浓度为4mg/mL的溶液置于4℃避光保存备用。

(3)AITC溶液的配制：取浓度为1g/mL的AITC溶液0.1mL，加入0.1mL DMSO溶液稀释，随后加入生理盐水定容至50mL，配置成浓度为2mg/mL的终溶液，至于低温储存备用。

(4)HC030031溶液的配制：称取10mg的HC030031固体粉末，加入0.1ml DMSO溶液溶解，随后再次加入生理盐水定容至1mL，配置成浓度为10mg/mL的稀释液，现配现用。

3.实验方法

(1)造影剂肾病小鼠模型构建

上述5组小鼠实验的药物干预流程如图1所示：

Control组：自由饮水，自由进食，48小时后眼眶采血，留取肾脏标本。

CIN组：造影剂干预前，小鼠禁水24h，间隔15min从腹腔依次注射吲哚美辛(10mg/Kg，4mL/Kg)、亚硝基左旋精氨酸甲酯(10mg/Kg，2.5mL/Kg)，随后从一侧尾静脉注入碘克沙醇注射液(320mg I/mL，10mL/Kg，5min内缓慢推注)。药物干预24h后眼眶采血，留取肾脏标本。在本发明人的另一篇相关专利申请文件中，在造影剂干预前禁水24h，然后予以缩血管药物吲哚美辛和亚硝基左旋精氨酸甲酯预处理，再通过尾静脉注射碘克沙醇注射液，使小鼠血清肌酐水平较基线上升超过了0.3mg/dL(26.5μmol/L)，达到了造影剂肾病诊断标准，成功构建了造影剂肾病小鼠模型，此处不再赘述。

DMSO+CIN组：造影剂干预前，小鼠禁水24h，在药物干预前30分钟，予以等量DMSO稀释溶液腹腔注射，后间隔15min从腹腔依次注射吲哚美辛(10mg/Kg，4mL/Kg)、亚硝基左旋精氨酸甲酯(10mg/Kg，2.5mL/Kg)，随后从一侧尾静脉注入碘克沙醇注射液(320mg I/mL，10mL/Kg，5min内缓慢推注)。24h后眼眶采血，留取肾脏标本。

AITC+CIN组：造影剂干预前，小鼠禁水24h，在造影剂造模干预前30min予以备好的AITC溶液(2mg/mL，10mg/Kg)腹腔注射，后间隔15min从腹腔依次注射吲哚美辛(10mg/Kg，4mL/Kg)、亚硝基左旋精氨酸甲酯(10mg/Kg，2.5mL/Kg)，随后从一侧尾静脉注入碘克沙醇注射液(320mg I/mL，10mL/Kg，5min内缓慢推注)。24h后眼眶采血，留取肾脏标本。

DMSO+CIN组：造影剂干预前，小鼠禁水24h，在造影剂造模干预前30min予以现配制的HC030031悬浊液(10mg/mL，100mg/Kg)腹腔注射，后间隔15min从腹腔依次注射吲哚美辛(10mg/Kg，4mL/Kg)、亚硝基左旋精氨酸甲酯(10mg/Kg，2.5mL/Kg)，随后从一侧尾静脉注入碘克沙醇注射液(320mg I/mL，10mL/Kg，5min内缓慢推注)。24h后眼眶采血，留取肾脏标本。

(2)血清肌酐、尿素氮测定

药物干预24h后，予以少量异氟烷诱导麻醉各组小鼠，以10％水合氯醛腹腔注射全身麻醉，剪去小鼠双侧胡须，单手固定小鼠，食指拇指绷紧小鼠一侧眼周皮肤，充分暴露眼球，组织镊摘除小鼠眼球，采血约1mL后采用颈椎脱臼法处死小鼠。

采取血液置于离心机离心20℃(3000r，15min)，离心后取血清于EP管中置于4℃保存备用。使用小鼠血清肌酐及尿素氮试剂盒测定血肌酐、尿素氮水平。

对照孔加入显色剂A、显色剂B和终止液；标准品孔，加标准品50μL，后加入辣根过氧化物酶100μL；样本孔加血清50μL，辣根过氧化物酶100μL，盖膜混匀，37℃孵育60min。去封板膜，弃去液体，加洗涤液，静置1min，重复5次。每孔先加入底物液A 50μL，再加入底物液B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。加终止液50μL终止反应。置于酶标仪，波长450nm，测各孔的吸光度(OD值)。

(3)肾脏组织病理形态学观察

A.肾脏病理切片的制作：

a.取材与固定：将眼眶采血完毕后的小鼠，颈椎脱臼处死，固定于自制的解剖板上，充分暴露小鼠腹部。剪去腹部毛发备皮，酒精消毒。镊子夹起下腹部皮肤，组织剪打开腹壁，暴露腹腔。找到肾脏，离断肾脏血管及周围组织，取出肾脏，PBS冲洗干净，手术镊小心分离肾脏表面包膜，再次用PBS冲洗，一侧肾脏按一定厚度纵行分割后置于4％多聚甲醛固定，一侧肾脏冷冻保存制作冰冻切片。

b.脱水：75％酒精4h，85％酒精2h，95％酒精1h，100％酒精0.5h，100％酒精0.5h，100％酒精0.5h，100％酒精0.5h。

c.透明：二甲苯10min，二甲苯10min。

d.浸蜡：石蜡1h，石蜡2h，石蜡3h。

e.包埋：提前融化石蜡，备好模具，将浸润好的肾脏组织标本放入模具中，加入融化的石蜡，置于-20℃上冷却后将石蜡切割成单个蜡块。

f.切片：以5μm厚度依次切片，烘片，编号备用。

B.苏木素-伊红染色(Hematoxylin-Eosin Staining，H&E染色)：苏木精染色15min；水洗3min；分化液分化10s；水洗3min；放入50℃的温水，直到蓝色显色；清水冲洗3min；85％的酒精5min；伊红染色5min；水洗5s；依次梯度酒精脱水处理；二甲苯透明封片。

C.于400倍光镜下随机观察每个切片样本的5个视野范围，根据Paller法对肾小管间质损伤程度进行评分量化。

评分标准为：肾小管上皮细胞颗粒样变性记1分；空泡样变性记1分；小管上皮细胞出现核固缩记1分；肾小管明显扩张或肾小管上皮细胞扁平记1分；肾小管刷状缘损伤记1分，刷状缘脱落记2分；管腔内出现脱落或坏死的细胞，未形成管型记1分，若有管型记2分。

(4)肾脏组织TUNEL荧光染色

A.切片固定：取前期制作的冰冻切片，复温晾干，冷丙酮固定10min，待丙酮晾干后于PBS洗涤3次，每次5min。

B.修复：用免疫组化笔在切片上组织周围画圈，防止液体流失，滴加蛋白酶K工作液，37℃孵育25min。将玻片置于PBS中洗涤3次，每次5min。

C.破膜：切片甩干滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS中洗涤3次，每次5min。

D.加试剂：按1：9的比例将试剂盒中试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃孵育2h。

E.DAPI复染：切片用PBS洗涤3次，每次5min。去除PBS滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

F.封片：玻片置于PBS中洗涤3次，抗荧光淬灭剂封片。

G.镜检：荧光显微镜下观察并采集。

(5)免疫荧光染色观察TRPA1定位

A.将小鼠肾组织取出，PBS漂洗3次，每次5min。用4％PFA过夜固定组织后，用30％蔗糖将组织脱水48小时。

B.将脱水后的组织利用OCT冰冻切片包埋剂包埋，放于-80℃保存。

C.使用冰冻切片机进行切片。

D.选片：通过光镜观察选择需要的切片，放置于37℃烘箱中烘片1h。

E.漂洗：1XPBS漂洗3次，每次10min。

F.抗原修复：调节水浴锅温度至95℃，将加有1X柠檬酸钠抗原修复液的免疫组化漂洗盒置于水浴锅中，漂洗完成的切片架于热修复液中，待20min后取出，室温冷却至常温约1小时。

G.再次漂洗：1XPBS漂洗3次，每次10min。

H.封闭：擦干切片表面水分后，用免疫组化笔围绕在组织样品划圈，用移液器滴上20μL透化性封闭液,室温1小时.

I.吸掉样品周围的封闭液，加入一抗(AQP1，sc-32737，Santa Cruz；TRPA1，PA1-46159，Invitrogen，1:100稀释)4℃湿敷过夜。

J.漂洗：1XPBS漂洗3次，每次10min。

K.二抗：滴加二抗(Goat-Anti mouse IgG，Alexa Fluor 488，A11001，Invitrogen；Goat-Anti rabbit IgG，Alexa Fluor 594，1：500稀释)于样品表面，避光室温孵育2小时。

L.漂洗(避光)：1XPBS漂洗3次，每次10min。

M.封片：滴加30μLDAPI于每个样品表面，待3-5min后用载玻片进行封片。

N.观察及拍照：激光共聚焦显微镜观察并拍照。

(6)免疫组化观察TRPA1的表达

A.切片脱蜡：将样本切片依次放入二甲苯I 15min，二甲苯II 15min，无水乙醇I5min，无水乙醇II 5min，85％酒精5min，75％酒精5min，流水清洗。

B.抗原修复：将切片置于含柠檬酸抗原修复缓冲液的修复盒中进行抗原修复，冷却后PBS洗涤3次。

C.阻断内源性过氧化物酶：用3％双氧水溶液，避光条件下室温孵育25min，将玻片置于PBS中洗涤3次，每次5min。

D.血清封闭：滴加3％BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。

F.加一抗：去除封闭液，滴加按比例稀释的一抗，平放于湿盒内4℃孵育。

G.加二抗：玻片置于PBS中洗涤3次，每次5min。切片甩干滴加HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。

H.DAB显色：玻片置于PBS中洗涤3次，每次5min。切片甩干后滴加DAB显色液，显微镜下控制显色时间，棕黄色为阳性，自来水冲洗，终止显色。

I.染细胞核：苏木素复染3min，纯水冲洗，苏木素分化液处理数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝处理，纯水冲洗。

J.脱水封片：将切片依次放入75％酒精，85％酒精，无水乙醇I，无水乙醇II，正丁醇，二甲苯Ⅰ中各5min进行脱水透明，晾干封片。

K.镜下观察。

(7)Q-PCR测定目标基因转录情况

A.肾脏RNA提取

a.取匀浆管，加入RNA提取液，预冷。

b.取小鼠肾脏组织，加入匀浆管中，充分研磨至无组织块。

c.4℃下12000rpm离心10min。

d.取上清液，转移至离心管，加入三氯甲烷，充分混匀，静置3min。

e.4℃下12000rpm离心10min。

f.取上清液，转移至离心管，加异丙醇混匀，-20℃静置15min。

g.4℃下12000rpm离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。

h.吸除多于液体，加入1.5mL 75％乙醇洗涤沉淀。

i.4℃下12000rpm离心5min，将液体吸除干净。

j.加入15μL纯水溶解RNA，55℃孵育5min。

k.RNA纯度检测：取2.5μL样品RNA溶液于检测基座上，检测吸光值。

B.逆转录

a.配制逆转录体系：5×Reaction Buffer 4μm、Oligo(dT)18Primer 0.5μm、Random Hexamer primer 0.5μm、Servicebio RT Enzyme Mix 1μm、Total RNA 10μm、RNasefree water配置成20μm的反应体系，充分混匀。设置程序：25℃孵育5min，42℃孵育30min，85℃孵育5s。

b.目的基因引物序列

由北京索莱宝科技有限公司设计和合成的小鼠目标基因TRPA1引物，及凋亡相关指标Bax、Bcl-2、Caspase-3的引物，引物序列及扩增片段长度如表1所示：

表1目的片段引物序列及扩增长度

c.配制扩增体系：取0.2mL PCR管，加入2×qPCR Mix 7.5μL、基因引物(上游+下游)1.5μL、反转录产物(cDNA)2μL、ddH

(8)肾脏组织SOD、MDA水平测定

A.使用南京建成生物工程研究所的“SOD试剂盒”，操作流程如下：取小鼠肾脏组织匀浆，分别加入试剂一、二、三、四，充分混匀后置于37℃水浴40min后，加入显色剂置于室温10min，波长550nm，1cm光镜孔径，蒸馏水较零，比色。组织中SOD活力计算公式为：

B.使用南京建成生物工程研究所的“MDA试剂盒”，操作流程如下：按说明加入组织匀浆及试剂，充分混匀后于95℃水浴40min，取出后冷却，3500转/分离心10min，取上清液，波长532nm，1cm光镜孔径，蒸馏水较零，比色。组织中MDA含量计算公式为：

(9)肾脏组织目标蛋白测定

A.肾脏蛋白提取：取冷冻肾脏组织称重，放入试剂管中，加入裂解液，启动组织匀浆模式，静置30min，取上清。

B.BCA测定蛋白浓度：

a.测标准蛋白及样品所对应的吸光度值；

b.绘制标准曲线；

c.依据标准曲线计算出各组的目标蛋白浓度，计算出电泳上样量。

C.蛋白电泳：SDS-PAGE胶的配置：

a.组装玻璃板，烘干备用；

b.下层凝胶(ddH2O 4.0mL+30％Acr-Bis 5.0mL+1M Tris 5.7mL+10％SDS 0.15mL+10％Aps 0.15mL+TEMED 0.007mL)配制混匀，注入到玻璃板内，丙醇封闭，待下层凝胶凝固，倒出无水乙醇，吸干腔内残余液体；

c.上层凝胶(ddH2O 4.0mL+30％Acr-Bis 1.1mL+1M Tris 0.75mL+10％SDS0.07mL+10％Aps 0.07mL+TEMED 0.006mL)，充分混匀后灌注上层凝胶，后立即插梳子，待上层凝胶凝固后取出备用。配液：电泳液(Glycine 14.4g、Tris 3.03g、SDS 1g定容至1L)；转膜液(Glycine 14.4g、Tris 3.03g、10％SDS 2mL、甲醇200mL定容至1L)，配好备用。

电泳装置：在电泳槽中安装玻璃板，根据蛋白浓度将蛋白溶液按比例加入上样缓冲液，100℃水浴锅中孵育5min，高速离心使样品完全沉积于Ep管底，微量移液器上样。

垂直电泳：浓缩胶80V下30min后，分离胶中120V 90min，待溴酚蓝完全分离，停止电泳。

转膜：用无水甲醇浸泡PVDF膜，依次将在转膜液中浸泡过的三层滤纸、胶、PVDF膜、三层滤纸对齐放好赶走气泡，后接通电源开始转膜，周围放置冰袋，恒压100V，1h。

D.抗体杂交：将PVDF膜浸泡于丽春红溶液反应，明确蛋白是否成功转移至PVDF；依据Marker所对应的分子量裁膜；膜放入试剂管中，用TBST(Tris 2.42g、NaCl 8g、Tween-201mL定容至1L)缓冲液清洗(90r/min，5min)，洗脱丽春红染液；5％脱脂奶粉封闭2h；TBST缓冲液清洗；将相应的条带放置到盛有TBST稀释的一抗的孵育盒内4℃孵育过夜；TBST缓冲液清洗；条带转移至二抗(TBST稀释)的孵育盒内；摇床上室温1h；TBST缓冲液清洗。

E.发光检测：使用chemiDOC化学发光凝胶成像系统对目的条带进行灰度检测，Image LabTM软件对目的条带和内参条带的OD比值进行分析处理。

4.统计学处理

采用SPSS 22.0进行实验数据处理与分析。实验所得计量数据用均数±标准差(X±s)表示，进行正态分布检验与方差齐性检验，两组间数据比较采用独立样本t检验，两组以上采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

5.AITC干预上调肾脏组织中TRPA1的表达

通过激光共聚焦显微镜观察了正常小鼠肾脏组织中TRPA1的分布情况。显微镜下可以观察到，标记TRPA1的红色荧光(图2C)与标记细胞膜蛋白AQP1的绿色荧光(图2B)有较好的重合(图2D)，提示TRPA1主要分布于细胞膜。

然后，通过对肾脏免疫组化染色观察发现：正常情况下的Control组肾脏TRPA1有一定量的表达，而CIN组、DMSO+CIN组、AITC+CIN组相对于Control组而言，TRPA1的表达有所增加，HC030031+CIN组TRPA1的表达减少(图2E-图2I)。

如图3所示，进一步对各实验组肾脏TRPA1免疫组化染色光密度值进行统计学分析发现：对比Control组，CIN组和DMSO+CIN组，TRPA1表达有所增加，差异有统计学意义(P＜0.01)。CIN组和DMSO+CIN组间无明显差异(P＞0.05)，AITC+CIN组和CIN组相比，TRPA1表达明显上调，差异有统计学意义(P＜0.01)，而HC030031+CIN组与CIN组相比，TRPA1表达下降，差异有统计学意义(P＜0.01)。

上述实验结果提示，给予造影剂干预后，TRPA1的表达有所增加，这可能和机体有一定代偿能力相关，而使用了AITC后能显著的增加TRPA1的表达，使用HC030031后能显著的降低TRPA1的表达。

6.激动TRPA1改善造影剂导致的肾功能损害

结合图4，在单纯给予造影剂造模处理的CIN组(92.8±6.64μmol/L)小鼠血清肌酐水平较Control组(45.8±4.20μmol/L)有明显升高(P＜0.01)，变化趋势与本发明人另一件专利申请文件中的结果一致，肌酐水平较基线值也上升超过0.3mg/dL(26.5μmol/L)，达到了CIN诊断标准，表明已成功构建小鼠造影剂肾病模型。且CIN组与DMSO+CIN组两组间肌酐和尿素氮水平无显著性差异(P＞0.05)。

提前给了TRPA1激动剂的AITC+CIN组(65.6±5.03μmol/L)、(11.6±0.89mmol/L)相较于CIN组肌酐和尿素氮水平明显下降(P＜0.01)，而HC030031+CIN组(109±5.78μmol/L)、(24.2±4mmol/L)与CIN组相比，肌酐和尿素氮明显升高(P＜0.01)。

综上，在施用造影剂前给予TRPA1激动剂可使小鼠的肌酐和尿素氮水平明显下降；在施用造影剂前给予TRPA1抑制剂可使小鼠的肌酐和尿素氮水平明显上升。

7.激动TRPA1改善造影剂导致的肾脏形态学损伤

如图5所示，与Control组相比，CIN组小鼠肾脏损伤明显加重，肾脏切片中明显可见大部分肾小管出现了空泡样改变(红色箭头所示)，部分上皮细胞扁平脱落，整个肾脏切片中肾小管排列紊乱(图5A)。提前用TRPA1激动剂的AITC+CIN组与CIN组相比，肾小管损伤程度有所改善。HC030031+CIN组肾脏组同样出现了大片细胞空泡样变性，刷状缘损伤明显，官腔内可见脱落上皮细胞及细胞碎片(黑色箭头所示)，局部可见肾小管基底膜裸露(黄色箭头所示)。

结合图6，对肾小管损伤程度量化统计分析发现，与Control组(0.12±0.17)相比，DMSO+CIN组和CIN组(3.86±0.26)肾脏损伤程度加重，差异有统计学意义(P＜0.01)，AICT+CIN组(1.56±0.29)和CIN组相比，肾脏损伤成都有所减轻，差异有统计学意义(P＜0.01)，HC030032+CIN组(4.68±0.17)与CIN组相比，肾脏损伤程度加重，差异有统计学意义(P＜0.01)，DMSO+CIN组肾小管损伤程度和CIN组无明显差异(P＞0.05)。

综上，在施用造影剂前给予TRPA1激动剂可改善造影剂使用后导致的小鼠肾功能损伤，同时改善形态学损害；在施用造影剂前给予TRPA1抑制剂会加重造影剂使用后导致的小鼠肾功能损伤，并加重形态学损害。

8.激动TRPA1降低造影剂暴露后的ROS水平

如图7-图8所示，肾脏组织DHE染色提示：与Control组相比较，CIN组与DMSO+CIN组肾脏ROS水平明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)，CIN组与DMSO+CIN组两组间无统计学差异(P＞0.05)。相较于CIN组，AITC+CIN组ROS水平降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，HC030031+CIN组与CIN组相比，ROS水平显著上升(P＜0.01)。

综上，在施用造影剂前给予TRPA1激动剂可显著降低肾脏氧化应激水平；在施用造影剂前给予TRPA1抑制剂会使氧化应激水平显著升高。

9.激动TRPA1增加肾脏组织SOD水平，降低MDA水平

通过测定各组小鼠肾脏组织中SOD和MDA水平，进行统计分析后发现：

与Control组相比，CIN组与DMSO+CIN组肾脏组织SOD活力明显下降，差异有统计学意义(P＜0.01)，CIN组和DMSO+CIN组间SOD活力无明显差异(P＞0.05)，AITC+CIN组SOD活力明显高于CIN组，差异有统计学意义(P＜0.01)。HC030031+CIN组SOD活力明显低于CIN组，差异有统计学意义(P＜0.01)(图9A，图中肾脏组织SOD活力，定义为每毫克组织蛋白在1mL反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为一个活力单位(U))。

CIN组与DMSO+CIN组和Control组相比，MDA水平明显上升，差异有统计学意义(P＜0.01)，CIN在和DMSO+CIN组间MDA水平无明显差异(P＞0.05)，AITC+CIN组MDA含量明显低于CIN组，HC030031+CIN组MDA含量明显高于CIN组，差异有统计学意义(P＜0.01)(图9B)。

综上，在施用造影剂前给予TRPA1激动剂可明显提高小鼠肾脏组织SOD活力，同时明显降低MDA水平；在施用造影剂前给予TRPA1抑制剂反而会明显降低小鼠肾脏组织SOD活力，同时明显升高MDA水平。

10.激动TRPA1减少造影剂导致的肾小管上皮细胞凋亡

如图10所示，肾脏组织TUNEL荧光染色显示：与Control相比，CIN组和DMSO+CIN组肾脏组织出现了显著的肾小管上皮细胞凋亡；而AITC+CIN组与CIN组相比，凋亡细胞相对减少；与CIN组相比，HC030031组肾小管凋亡明显加重。

结合图11，对各实验组TUNEL阳性的细胞进行统计学分析发现，相较于Control组(0.72±0.31％)，CIN组(28.04±0.38％)及DMSO+CIN组(29.93±9.74％)凋亡细胞率明显增加，差异具有统计学意义(P＜0.01)，CIN组与DMSO+CIN组两组间TUNEL细胞阳性率无统计学差异(P＞0.05)，AITC+CIN组(18.16±2.74％)与CIN组相比，细胞凋亡明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，HC030031+CIN组(70.55±1.81％)与CIN组相比，凋亡细胞比率明显增加(P＜0.01)。

综上，在施用造影剂前给予TRPA1激动剂可有效减少小鼠肾脏细胞的凋亡率；在施用造影剂前给予TRPA1抑制剂会明显升高凋亡细胞比率。

11.激动TRPA1增加Bcl-2mRNA水平，降低Bax、Caspase-3mRNA水平

如图12所示，PCR结果提示：相比于Control组，CIN组和DMSO+CIN组TRPA1 mRNA水平有所增加(P＜0.01)，AITC+CIN组与CIN组相比，TRPA1 mRNA水平明显增加(P＜0.01)，凋亡蛋白Bax、Caspase-3的mRNA和蛋白量都明显降低(P＜0.01)，抗凋亡蛋白Bcl-2的mRNA水平增加(P＜0.01)。HC030031+CIN组与CIN组相比，TRPA1 mRNA水平明显降低(P＜0.01)，Bax、Caspase-3mRNA水平增加(P＜0.01)，Bcl-2mRNA水平减低(P＜0.01)。CIN组和DMSO+CIN组间上述指标无明显差异(P＞0.05)。

综上，在施用造影剂前给予TRPA1激动剂可使Bcl-2在基因水平上调，而凋亡蛋白Bax、Caspase-3在基因水平均下降；而提前给予TRPA1抑制剂HC030031后能够显著降低TRPA1的表达，增加凋亡蛋白Bax、Caspase-3的基因水平，而降低Bcl-2的基因水平。

12.激动TRPA1增加Bcl-2蛋白表达，降低Bax、Caspase-3蛋白表达

结合图13，为了进一步探究TRPA1在造影剂肾病中的作用，通过WB检测了TRPA1及凋亡相关蛋白的表达水平。

结果发现，与Control组相比，CIN组和DMSO+CIN组TRPA1蛋白水平上调，差异有统计学意义(P＜0.01)。CIN组和DMSO+CIN组之间无明显差异(P＞0.05)。AITC+CIN组和CIN组相比，TRPA1蛋白水平明显上调(P＜0.01)，HC030031+CIN组与CIN组相比，TRPA1蛋白水平降低(P＜0.01)。

其次，与Control组相比，抗凋亡蛋白Bcl-2在CIN组和DMSO+CIN组中表达明显降低(P＜0.01)，凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达明显增加(P＜0.01)。AITC+CIN组与CIN组相比，抗凋亡蛋白Bcl-2表达有所上调(P＜0.05)，而凋亡蛋白Bax、Caspase-3有所下调(P＜0.01)。HC030031+CIN组与CIN组相比，Bcl-2表达降低(P＜0.01)，Bax、Caspase-3表达增加(P＜0.05、P＜0.01)。

综上，在施用造影剂前给予TRPA1激动剂可使Bcl-2在蛋白水平上调，而凋亡蛋白Bax、Caspase-3在蛋白水平均下降；而提前给予TRPA1抑制剂HC030031后能够显著降低TRPA1的表达，增加凋亡蛋白Bax、Caspase-3的蛋白水平，而降低Bcl-2的蛋白水平。

综上所述，在提前使用了TRPA1激动剂AITC后，使TRPA1的表达显著增加，并且能够改善造影剂使用后导致的肾功能损伤，同时改善形态学损害，降低肾脏氧化应激水平，减少肾脏细胞凋亡。再者，激动TRPA1能使抗凋亡蛋白Bcl-2在基因和蛋白水平均上调，而凋亡蛋白Bax、Caspase-3在基因和蛋白水平均下降。而提前给与TRPA1抑制剂HC030031后能够显著降低TRPA1的表达，增加凋亡蛋白Bax、Caspase-3的水平，而降低抗凋亡蛋白Bcl-2的水平，加重肾脏损伤，增加氧化应激水平和肾小管上皮细胞凋亡，加重造影剂对肾功能的影响。TRPA1激动剂还可选用桂皮醛、芥末油、辣椒素、大蒜素中的至少一种。

综合上述结果，在施用造影剂前给予TRPA1激动剂，可激活肾脏组织中的TRPA1，进而显著降低造影剂导致的肾损伤。

以上的具体实施方式，对本申请的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。