园参、林下参和野山参的SSR指纹图谱及鉴定方法

技术领域

本发明涉及中药材来源品种鉴定技术领域，具体地说是一种园参，林下参和野山参的SSR 指纹图谱及鉴定方法。

背景技术

人参是五加科人参属植物，它能有效地调节中枢神经系统，降低血糖，增强人体免疫力，抵抗癌细胞的扩散和转移，是我国常用的珍贵中药材。根据生长环境的不同可将人参可分为园参，林下参和野山参。园参为人工种植一般4-6年不等，存活率较高但是营养价值一般。林下参一般为10-20年，人工播种，山林中自然发芽生长，存活率较低，人参皂苷含量要高与园参，常被误认为野山参。野山参几十年、上百年不等，是生长于深山密林的原生态人参，是参中之最，人参皂苷含量最高，数量及其稀少，濒临灭绝。目前主要根据形态学、显微特征和理化性状等对人参品种进行鉴别，但是这些方法均具有主观性强的特点，此外对于参片及参粉等系列参的产品无法区分，因此需要一种鉴定真伪的方法。

随着分子生物学的发展，DNA分子标记技术的应用使得直接分析药用植物的遗传变异成为可能，也让中药材和中药产品的鉴定更为准确，高效。目前DNA分子标记经历了以分子杂交为核心的限制性片段长度多态性(RFLP)，以PCR技术为核心的扩增片段长度多态性 (AFLP)和SSR。相比之下RFLP费时费力，AFLP很难比较分析，SSR以其操作简便，重复性和多态性高而广泛应用。DNA指纹就是根据DNA序列的组成，顺序和长度差异进行鉴定，就像人类指纹一样，它们是具有个体特异的。而SSR指纹图谱就是DNA指纹的一种，因其具有受检样品用量少，检测速度快，准确性和可靠性高，不受环境因素影响等优点成为区分名贵中药材的首选方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种园参，林下参和野山参的SSR指纹图谱及鉴定方法，这种方法分辨率高、灵敏度高、重复性好、结果准确，能够用于人参样品的品种鉴定。

本发明的目的是由以下技术方案来实现的：

一种园参，林下参和野山参的SSR指纹图谱建立方法，其特征是，它包含下述步骤：

1)DNA提取：取园参，林下参和野山参按改良CTAB法提取其基因组DNA；

2)PCR扩增：应用20对引物，对上述DNA进行扩增；

3)PCR产物鉴定：扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳分析，记录电泳图谱；

4)SSR指纹图谱的建立：根据电泳图谱中各引物的扩增情况，选择有代表性的多态性 SSR引物构建园参，林下参和野山参的SSR指纹图谱。

一种园参，林下参和野山参的SSR指纹鉴定方法，其特征是，它包含下述步骤：

1)先建立园参，林下参和野山参的DNA标准指纹图谱，方法如下：

(a)DNA提取：取园参，林下参和野山参对照药材，按改良CTAB法提取DNA；

(b)PCR扩增：以步骤(1)中提取的DNA为模板，使用20对引物进行PCR扩增反应；

(c)PCR产物鉴定：扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳分析，记录电泳图谱；

(d)人参SSR标准指纹图谱的建立：根据电泳图谱中各引物的扩增情况，选择有代表性的P35引物构建园参，林下参和野山参的DNA标准指纹图谱；

2)测定样品SSR指纹图谱：以上述相同的方法测定待测园参，林下参和野山参样品，得样品SSR指纹图谱；

3)结果鉴定：比较样品SSR指纹图谱与园参，林下参和野山参SSR标准指纹图谱的相似度，根据相似度对人参样品进行品种鉴定。

附图说明

图1园参，林下参和野山参非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳SSR标准指纹

图2人参(园参，林下参和野山参)毛细管电泳SSR标准指纹

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，下面实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。

实施例1

1.DNA提取

从不同产地收集30份园参，15份林下参和16份野山参样品，分别取0.1g样品，采用改良CTAB法提取样品的基因组DNA。

表1.人参样品名称及产地表

2.PCR扩增

PCR反应体系为：1μL 10μmol/L SSR上下引物，4μL 10ng/μL模板DNA，10μL rTaqDNA 聚合酶(TaKaRa TaqTM Version 2.0)，4μL去离子水，反应在基因扩增仪上进行。

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s；合适的退火温度30s；72℃延伸30s，30次循环；72℃延伸10min，4℃保存。

3.园参，林下参和野山参的SSR指纹的建立

将步骤2中的PCR扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳分析，具体步骤如下：

3.1非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

PCR产物用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶(10.5ml ddH

3.2毛细管电泳

在20μL PCR产物中加入2μL的乙酸钠溶液和40μL的无水乙醇在-80℃的条件下放置1h。取出后4℃12,000r/min离心10min，沉淀DNA。向EP管中加入750μL 90％乙醇，4℃12,000 r/min离心2min，弃去上清，晾干过夜。加入适量ddH

实施例2

将本发明的园参SSR指纹鉴定方法用于某个园参样品的鉴定

假设现有一批园参样品不能确定是否是真正的园参，因此，按照如下方法对它进行鉴定。

园参SSR标准指纹图谱建立以后，要对某个样品进行鉴定时，首先用改良CTAB法提取样品的基因组DNA；用提取的DNA作为模板，用P35引物对其进行PCR扩增；扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳分析并记录电泳图谱，即得该批待测样品的DNA 指纹图谱；比较待测样品DNA指纹图谱与园参DNA标准指纹图谱的相似度，根据相似度对待测样品进行鉴定。

鉴定结果：若待测样品与标准品的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳图谱的相似度均大于95％(含95％)，这批样品就是真正的园参；若二者相似度小于95％，那么这批样品就不是真正的园参。

实施例3

将本发明的林下参DNA指纹鉴定方法用于某个林下参样品的鉴定

假设现有一批林下参样品不能确定是否是真正的林下参，因此，按照如下方法对它进行鉴定。

林下参SSR标准指纹图谱建立以后，要对某个样品进行鉴定时，首先用改良CTAB法提取样品的基因组DNA；用提取的DNA作为模板，用P35引物对其进行PCR扩增；扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳分析并记录电泳图谱，即得该批待测样品的 SSR指纹图谱；比较待测样品SSR指纹图谱与林下参DNA标准指纹图谱的相似度，根据相似度对待测样品进行鉴定。

鉴定结果：若待测样品与标准品的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳图谱的相似度均大于95％(含95％)，这批样品就是真正的林下参；若二者相似度小于95％，那么这批样品就不是真正的林下参。

实施例4

将本发明的野山参DNA指纹鉴定方法用于某个野山参样品的鉴定

假设现有一批野山参样品不能确定是否是真正的野山参，因此，按照如下方法对它进行鉴定。

野山参SSR标准指纹图谱建立以后，要对某个样品进行鉴定时，首先用改良CTAB法提取样品的基因组DNA；用提取的DNA作为模板，用P35引物对其进行PCR扩增；扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳分析并记录电泳图谱，即得该批待测样品的 DNA指纹图谱；比较待测样品SSR指纹图谱与野山参SSR标准指纹图谱的相似度，根据相似度对待测样品进行鉴定。

鉴定结果：若待测样品与标准品的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳图谱的相似度均大于95％(含95％)，这批样品就是真正的野山参；若二者相似度小于95％，那么这批样品就不是真正的野山参。