公开/公告号CN114959108A
专利类型发明专利
公开/公告日2022-08-30
原文格式PDF
申请/专利权人 首都医科大学附属北京佑安医院;
申请/专利号CN202110200329.2
申请日2021-02-23
分类号C12Q1/70(2006.01);C12Q1/6844(2018.01);C12N15/11(2006.01);C12N15/113(2010.01);C12R1/93(2006.01);
代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司 11245;
代理人何叶喧
地址 100069 北京市丰台区右安门外西头条8号
入库时间 2023-06-19 16:31:45
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2022-09-16
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q 1/70 专利申请号:2021102003292 申请日:20210223
实质审查的生效
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种基于RCA-PCR-CRISPR-cas13a检测HBV cccDNA的试剂盒。
背景技术
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是引起乙型肝炎(简称乙肝)的病原体,属嗜肝DNA病毒科。在乙型肝炎病毒的复制过程中,病毒DNA进入宿主细胞核,在DNA聚合酶的作用下,两条链的缺口均被补齐,形成超螺旋的共价、闭合、环状DNA分子(covalentlyclosed circularDNA,cccDNA)。细胞外乙型肝炎病毒DNA是一种松弛环状的双链DNA(relaxed circularDNA,rcDNA)分子。cccDNA是乙型肝炎病毒前基因组RNA复制的原始模板,虽然其含量较少,每个肝细胞内只有约5~50个拷贝,但对乙型肝炎病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义,只有清除了细胞核内的cccDNA,才能彻底消除乙肝患者病毒携带状态,是抗病毒治疗的目标。
全球HBV慢性感染者约为2.57亿人,由HBV感染引起的失代偿肝硬化、肝衰竭和肝癌导致约90万人死亡,我国人群整体携带率为6.1%,约占全球的1/3。慢性乙型肝炎难以治愈的关键因素是未能彻底清除的HBV cccDNA,它是病毒复制产生的所有RNA和子代病毒合成的模板,可以在肝细胞核内持续、稳定地存在,且目前现有的抗病毒药均不能清除cccDNA,故HBV cccDNA的存在被认为是HBV感染慢性化及抗HBV治疗停止后肝炎复发最主要原因,解析cccDNA的调控机制被国内外专家公认为是慢乙肝治愈策略中需要优先解决的重要科学问题。因此,HBV cccDNA的检测对深入研究HBV致病机制、评价乙肝患者药物疗效等方面具有重要意义。
HBV cccDNA在患者肝脏中的水平极低,每个肝细胞内只有约5~50个拷贝,对检测技术的灵敏度提出了较高要求。乙肝病毒双链DNA(relaxed circular DNA,rcDNA)分子与ccc DNA序列的高度同源性,又需要检测技术同时具有高度特异性。
目前HBV cccDNA常用检测技术包括:①Southern印迹杂交:该方法定性检测较为准确,但操作繁琐、敏感性较低且不能准确定量,需标本量也较大,故在临床上应用较少;②套式或选择性聚合酶链式反应(PCR):检测敏感性比较好,但是由于需要多次扩增,并且对PCR产物进行再次扩增,导致假阳性;③实时荧光定量PCR法:该检测方法的特异性比选择性PCR进一步提高,可以消除高rcDNA背景可能产生的非特异性扩增,灵敏度也明显提高,但仍不能完全排除rcDNA非特异性扩增存在;④微滴式数字PCR(ddPCR)方法:ddPCR方法能够检测到血清、单细胞和FFPE肿瘤组织中的cccDNA,与Southern blot及其他方法相比,检测cccDNA的灵敏性提高,但是价格昂贵,不利于广泛推广。
滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)是借鉴自然界中环状病原微生物DNA分子的滚环复制方式而建立的一种核酸扩增技术,是一种恒温DNA扩增技术,以环形DNA为模板进行复制,最后形成一条与环形互补的DNA序列,复制效率高,可用于大的环形DNA模板的扩增。
2017年,《Science》报道张峰实验室利用CRISPR-Cas13检测技术结合重组酶聚合酶扩增技术建立了灵敏度达到单碱基的痕量核酸检测技术,且该技术具有检测成本低,检测速度快等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于RCA-PCR-CRISPR-cas13a检测HBV cccDNA的试剂盒。
HBV cccDNA又称为乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA。
本发明提供了一种核酸分子组合物,包括特异引物对和特异crRNA;
特异引物对由序列表的序列10所示的单链DNA分子和序列表的序列11所示的单链DNA分子组成;
特异crRNA为序列表的序列9所示的单链RNA分子。
所述核酸分子组合物还包括特异引物组;
特异引物组由8种引物组成,每种引物均为单链DNA分子,8种引物依次如序列表的序列1至序列8所示。
本发明还保护一种核酸分子组合物,由所述特异引物组、所述特异引物对和所述特异crRNA组成。
本发明还保护一种用于检测HBV cccDNA的试剂盒,包括以上任一所述的核酸分子组合物。
所述试剂盒还包括不降解质粒的ATP依赖的DNA酶。
所述试剂盒还包括LwCas13a蛋白。所述试剂盒还包括T7 RNA聚合酶。所述试剂盒还包括RNA酶抑制剂。所述试剂盒还包括报告RNA。
所述试剂盒还包括记载有检测方法的载体;所述检测方法包括如下步骤:
(1)提取受试者肝脏组织的总DNA,然后进行PSAD消化;
(2)取步骤(1)的产物溶液,采用所述特异引物组进行RCA扩增;
(3)取步骤(2)的产物溶液,采用所述特异引物对进行PCR扩增;
(4)取步骤(3)的产物溶液,进行基于CRISPR-Cas13a系统的可视化检测;所述CRISPR-Cas13a系统的crRNA为所述特异crRNA。
本发明还保护以上任一所述核酸分子组合物在制备试剂盒中的应用;所述试剂盒的用途为检测HBV cccDNA。
本发明还保护组件1、组件2和组件3在制备试剂盒中的应用;所述试剂盒的用途为检测HBV cccDNA;
所述组件1为以上任一所述核酸分子组合物;
所述组件2为不降解质粒的ATP依赖的DNA酶;
所述组件3为LwCas13a蛋白。
本发明还保护以上任一所述核酸分子组合物在检测HBV cccDNA中的应用。
本发明还保护一种检测HBV cccDNA的方法,包括如下步骤:
(1)提取受试者肝脏组织的总DNA,然后进行PSAD消化;
(2)取步骤(1)的产物溶液,采用所述特异引物组进行RCA扩增;
(3)取步骤(2)的产物溶液,采用所述特异引物对进行PCR扩增;
(4)取步骤(3)的产物溶液,进行基于CRISPR-Cas13a系统的可视化检测;所述CRISPR-Cas13a系统的crRNA为所述特异crRNA。
PSAD消化的反应体系(11.7μL):总DNA 8.5μl(DNA的含量约为1μg)、PSAD0.4μl(含4U)、PSAD Buffer 2μl、ATP溶液0.8μl。
PSAD消化的反应条件:37℃水浴12小时,随后加热至70℃反应30分钟。
RCA扩增的方法为:取步骤(1)的产物溶液,先进行预反应再进行RCA扩增。
RCA扩增的方法为:①按照表1制备RCA预混体系,然后进行如下程序:95℃3分钟;50℃15秒;30℃15秒;20℃10分钟;②完成步骤①后,在冰上按照表2制备RCA扩增体系,然后进行如下程序:30℃水浴16小时,然后65℃水浴10分钟。
PCR扩增的反应体系(20μl):2μl步骤(2)得到的产物溶液,10μl 2×Taq PCRMasterMix,引物F溶液1μl、引物T7-R溶液1μl,余量为水。引物F溶液提供的有效成分为引物F,引物F溶液中的引物F浓度为10μM。引物T7-R溶液提供的有效成分为引物T7-R,引物T7-R溶液中的引物T7-R浓度为10μM。
PCR扩增的反应条件:95℃预变性10min;95℃30s,60℃30s,72℃30s,30个循环;72℃延伸10min,
基于CRISPR-Cas13a系统的可视化检测的反应体系(25μl):5μl步骤(3)的产物溶液、1μl Cas13蛋白溶液(含125ng蛋白)、2.5μl NTPmix、0.4μl T7 RNA聚合酶(含20U)、1μlRNA酶抑制剂、1μl特异crRNA(含45ng)、1.6μl报告RNA、2.5μl 10×buffer,余量为无RNA酶水。
基于CRISPR-Cas13a系统的可视化检测的反应条件:37℃,每2min为一个循环(读取荧光值),循环30次。
基于CRISPR-Cas13a系统的可视化检测通过荧光信号判断受试者肝脏组织中是否含有HBV cccDNA。荧光信号越强说明HBV cccDNA的含量越高。
LwCas13a蛋白如序列表的序列6第151-1302位氨基酸残基所示。
基于CRISPR-Cas13a系统的可视化检测具有如下优点:可实现对痕量核酸的快速检测;检测全过程在37℃条件下完成,不依赖仪器设备,可实现对特定病原核酸的床旁快速检测。
本发明以HBV cccDNA的检测为切入点,利用CRISPR技术建立一种高通量、高灵敏和低成本的HBV cccDNA新型检测方法。本发明提供的方法的基本原理:利用RCA扩增增加病毒DNA含量,然后通过PCR扩增特异性选择的DNA片段,随后逆转录得到具有特异性选择的目标片段的单链RNA,再通过CRISPR的crRNA特异性结合目的片段,最后利用Cas13a酶切活性带有荧光信号的报告RNA,通过荧光信号来检测HBV cccDNA。
采用本发明提供的试剂盒检测HBV cccDNA,稳定性高、特异性强、灵敏度高,能实现对乙肝的早期检测和药物疗效的有效监测,从而为改善乙肝患者在治疗疗效、用药监测等方面的问题,为乙肝的个体化治疗奠定坚实的基础。
本发明具有非常重要的临床应用前景和开发价值。
附图说明
图1为跨缺口引物示意图。
图2为RCA扩增引物的制备和效果验证的结果。
图3为crRNA的制备和效果验证的结果。
图4为特异性验证的结果。
图5为灵敏度检测的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。跨缺口引物的工作原理示意图见图1。
如无特殊说明,以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
如无特殊说明,核酸分子均为5’→3’方向。
PSAD消化,全称为不降解质粒的ATP依赖的DNA酶消化。不降解质粒的ATP依赖的DNA酶即Plasmid-Safe ATP-dependent DNase(PSAD)。
实施例1、RCA扩增引物的制备和效果验证
一、RCA扩增引物的制备
RCA扩增采用特异引物组。
特异引物组由如下8种引物组成:
引物R1(序列1):5’-ACCTATTCTCCTCCC-3’;
引物R2(序列2):5’-ATGCAACTTTTTCAC-3’;
引物R3(序列3):5’-GGCCCACATATTGT-3’;
引物R4(序列4):5’-AATCCTCACAATACC-3’;
引物R5(序列5):5’-CTAGCAGAGCTTGGT-3’;
引物R6(序列6):5’-CCTTTGTCCAAGGGC-3’;
引物R7(序列7):5’-TAGAAGAAGAACTCC-3’;
引物R8(序列8):5’-CCTATGGGAGTGGGC-3’。
分别制备特异引物组的8种引物。
二、效果验证
1、取三甲医院已确诊的HBV患者的肝脏组织,提取总DNA。
2、取步骤1得到的总DNA,进行PSAD消化。
PSAD消化的反应体系(11.7μL):步骤1得到的总DNA 8.5μl(DNA的含量约为1μg)、PSAD 0.4μl(含4U)、PSAD Buffer 2μl、ATP溶液0.8μl。
PASD(Plasmid-Safe
PSAD消化的反应条件:37℃水浴12小时,随后加热至70℃反应30分钟(酶灭活)。
3、取步骤2的产物溶液,先进行预反应再进行滚环扩增(RCA)。
(1)按照表1制备RCA预混体系,然后进行如下程序:95℃3分钟;50℃15秒;30℃15秒;20℃10分钟。
表1 RCA预混体系
(2)完成(1)后,在冰上按照表2制备RCA扩增体系,然后进行如下程序:30℃水浴16小时,然后65℃水浴10分钟(以灭活Phi 29DNA聚合酶)。
表2 RCA扩增体系
Phi29 DNA聚合酶(10U/μl):NEB公司,货号为M0269L。表1和表2中的10×Phi29DNA聚合酶Buffer,均为Phi29 DNA聚合酶的配套组件。
表1和表2中的8引物混合液提供的有效成分为特异引物组的8种引物(引物R1、引物R2、引物R3、引物R4、引物R5、引物R6、引物R7和引物R8),8种引物在8引物混合液中的浓度均为10μM。
4×dNTP mix:YTHXBio公司,货号YB007。4×dNTP mix提供的有效成分为dATP、dTTP、dCTP和dGTP,dATP、dTTP、dCTP和dGTP在4×dNTP mix中的浓度均为10mM。
4、取步骤2的产物溶液(RCA扩增前样本)或步骤3的产物溶液(RCA扩增后样本),采用微滴式数字PCR进行定量。
微滴式数字PCR采用的引物和探针如下:
引物D-F:5’-GGGGCGCACCTCTCTTTA-3’;
引物D-R:5’-AGGCACAGCTTGGAGGC-3’;
探针D-P:5’-FAM-TCACCTCTGCCTAATCATCTC-TAMRA-3’。
结果见图2。
实施例2、crRNA的制备和效果验证
一、crRNA的制备
1、合成三条单链DNA分子,HBV-F、T7-F和HBV-R。T7-F中,第1-20位核苷酸组成T7启动子。
HBV-F:
T7-F:
HBV-R:
2、制备反应体系并进行PCR扩增。
反应体系(50μl):2μl HBV-F溶液、2μl T7-F溶液、2μl HBV-R溶液、25μl2×TaqPCR MasterMix,余量为水。HBV-F溶液提供的有效成分为HBV-F,HBV-F溶液中的HBV-F浓度为10μM。T7-F溶液提供的有效成分为T7-F,T7-F溶液中的T7-F浓度为10μM。HBV-R溶液提供的有效成分为HBV-R,HBV-R溶液中的HBV-R浓度为10μM。
2×Taq PCR MasterMix:博迈德公司,货号MT211-02。
反应条件:95℃预变性5min;95℃30s、60℃30s、72℃15s,循环38次;72℃延伸10min。
3、完成步骤2后,回收PCR扩增产物,采用T7 Quick High Yield RNA Synthesiskit进行反转录,然后用Agencourt RNAClean XP回收RNA,得到crRNA。
crRNA序列如下(序列9):
crRNA中包括包括scaford序列和cccDNA跨缺口区序列。crRNA序列中,下划线标注的是引导区域(位于HBV cccDNA跨缺口区)。crRNA序列中,粗体标注的39nt为与LwCas13a蛋白结合的区域,也就是scaford序列。
二、效果验证
1、取三甲医院已确诊的HBV患者的肝脏组织,提取总DNA。
2、取步骤1得到的总DNA,进行PSAD消化。
方法同实施例1的步骤二的2。
3、取步骤2的产物溶液,进行滚环扩增(RCA)。
方法同实施例1的步骤二的3。
4、取步骤3的产物溶液,进行PCR扩增。
PCR扩增的反应体系(20μl):2μl步骤3得到的产物溶液,10μl 2×Taq PCRMasterMix,引物F溶液1μl、引物T7-R溶液1μl,余量为水。引物F溶液提供的有效成分为引物F,引物F溶液中的引物F浓度为10μM。引物T7-R溶液提供的有效成分为引物T7-R,引物T7-R溶液中的引物T7-R浓度为10μM。
2×Taq PCR MasterMix:博迈德公司,货号MT211-02。
引物F(序列10):5’-GGGGCGCACCTCTCTTTA-3’;
引物T7-R(序列11):5’-AATTC
引物F为针对乙型肝炎病毒基因组正链缺口上游的特异性PCR引物,与负链互补。引物T7-R为针对乙型肝炎病毒基因组负链缺口下游的特异性PCR引物且引入T7启动子序列。引物F和引物T7-R的靶序列为364bp。
PCR扩增的反应条件:95℃预变性10min;95℃30s,60℃30s,72℃30s,30个循环;72℃延伸10min,
5、转录及CRISPR-Cas13a检测
反应体系(25μl):5μl步骤4的产物溶液、1μl Cas13蛋白溶液(含125ng蛋白)、2.5μl NTPmix、0.4μl T7 RNA聚合酶(含20U)、1μl RNA酶抑制剂、1μl特异crRNA(含45ng)、1.6μl报告RNA、2.5μl 10×buffer,余量为无RNA酶水。
用无菌水代替步骤4的产物溶液,作为阴性对照。
分别采用如下三种特异crRNA:crRNA1、crRNA2或crRNA3。crRNA2如序列表的序列9所示(即步骤一制备的crRNA)。crRNA1如序列表的序列12所示。crRNA3如序列表的序列13所示。crRNA1和crRNA3的制备方法参照步骤一。
报告RNA为RNaseAlert
T7 RNA聚合酶为HiScribe T7快速高效RNA合成试剂盒中的T7 RNA聚合酶混合液。NTPmix为HiScribe T7快速高效RNA合成试剂盒中的NTP缓冲液混合液。
HiScribe T7快速高效RNA合成试剂盒:NEB产品,货号E2050S。
RNA酶抑制剂为小鼠RNase抑制剂(规格为40000units/ml):NEB产品,货号M0314S。
Cas13a蛋白溶液,又称为LwCas13a蛋白溶液,制备方法见实施例6。
10×buffer(pH7.3):含400mM Tris-HCl、600mM氯化钠、60mM MgCl
反应条件:37℃,每2min为一个循环(读取荧光值),循环30次。
结果见图3。crRNA2的效果显著优于crRNA1和crRNA3。
实施例3、特异性验证
3份临床HBV阳性样本(三甲医院已确诊的3位HBV患者的肝脏组织,分别用P1、P2和P3表示)。3份临床对照样本(三甲医院已确诊的非HBV患者的肝脏组织,分别用C1、C2和C3表示)。
采用crRNA2(如序列表的序列9所示),按照实施例2的步骤二的方法进行检测。
结果见图4。HBV患者的肝脏组织检测结果均为阳性。非HBV患者的肝脏组织检测结果均为阴性。结果表明,本发明的方法对检测HBV cccDNA具有很好的特异性。
实施例4、灵敏度检测
取三甲医院已确诊的HBV患者的肝脏组织,提取总DNA(溶液形式)。按照实施例1的步骤二进行操作,根据微滴式数字PCR的结果换算得到总DNA中的HBV cccDNA的含量,单位为copy/μl。采用无菌水稀释总DNA,得到HBV cccDNA浓度为10
用稀释液代替总DNA,采用crRNA2(如序列表的序列9所示),按照实施例2的步骤二的方法进行检测。
结果见图5。在HBV cccDNA浓度为1copy/μl时,仍然与阴性对照的荧光值存在显著差异,提示本发明提供的方法的灵敏度良好,可低至1copy/μl。
实施例5、稳定性实验
用实施例4中的稀释液代替总DNA,采用crRNA2(如序列表的序列9所示),按照实施例2的步骤二的方法进行检测。每种稀释液进行6次重复试验。
6份临床HBV阳性样本(三甲医院已确诊的6位HBV患者的肝脏组织)。采用crRNA2(如序列表的序列9所示),按照实施例2的步骤二的方法进行检测。每个阳性样本进行4次重复试验。
组间组内无显著性差异(p<0.05)。
结果表明,本发明提供的方法稳定性及可重复性较好。
实施例6、LwCas13a蛋白的制备
一、制备重组菌
将质粒pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a导入TransB(DE3)ChemicallyComptent Cell,得到重组菌。
质粒pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a:Addgene,产品ID为90097;https://www.addgene.org/browse/sequence/181127/。
质粒pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a如序列表的序列14所示。序列表的序列14中,第2751-6659位核苷酸的反向互补序列编码融合蛋白。融合蛋白如序列表的序列15所示。序列表的序列15中,第5-10位氨基酸残基组成His
TransB(DE3)Chemically Comptent Cell即TransB(DE3)化学感受态细胞。
二、制备Cas13a蛋白
1、采用液体LB培养基培养步骤一制备的重组菌,直至培养体系的OD
2、取步骤1得到的菌体,加入裂解液(裂解液:含20mM Tris-HCl、500mM氯化钠、1mM二硫苏糖醇,余量为水),然后进行超声破碎(超声5s,停10s,总时间为1.5h),然后4℃、12000rpm离心10min,收集上清液。
3、取步骤2得到的上清液,加入咪唑并使其浓度为10mM,然后采用0.22μm滤膜过滤,收集滤液。
4、取步骤3得到的滤液,采用镍柱(HisTrap HP column)分离纯化具有His
5、收集步骤4得到的过柱后溶液,转移到透析袋中,将透析袋放入SUMO缓冲液中进行透析(4℃搅拌,约1h换液一次,换液3次)。SUMO缓冲液:含30mM Tris-HCl、500mM氯化钠、1mM二硫苏糖醇、0.15%NP-40,余量为水。
6、完成步骤5后,收集透析袋内的液体,采用SUMO蛋白酶进行酶切。
SUMO蛋白酶:索莱宝公司,货号P2070。
7、完成步骤6后,取酶切产物溶液,进行离子交换层析。
离子交换层析柱:UniGel-50SP(Nano-Micro Tech)。
离子交换柱平衡后上样酶切产物溶液,依次用200mM氯化钠水溶液、500mM氯化钠水溶液、1M氯化钠水溶液和0.5M NaOH水溶液洗脱,收集各个蛋白峰对应的过柱后溶液并进行电泳检测(LwCas13a蛋白的预期分子量为138.5kDa)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。总之,按本发明的原理,本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本申请中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围,可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 首都医科大学附属北京佑安医院
<120> 基于RCA-PCR-CRISPR-cas13a检测HBV cccDNA的试剂盒
<130> GNCYX210365
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acctattctc ctccc 15
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgcaacttt ttcac 15
<210> 3
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcccacata ttgt 14
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aatcctcaca atacc 15
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctagcagagc ttggt 15
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctttgtcca agggc 15
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tagaagaaga actcc 15
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cctatgggag tgggc 15
<210> 9
<211> 67
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca acuuuuucac cucugccuaa 60
ucaucuc 67
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggggcgcacc tctcttta 18
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aattctaata cgactcacta tagggaggca cagcttggag gc 42
<210> 12
<211> 67
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu caccucugcc uaaucaucuc 60
uuguuca 67
<210> 13
<211> 67
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu uuucaccucu gccuaaucau 60
cucuugu 67
<210> 14
<211> 9542
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaaccgccct taacatggcc cgctttatca gaagccagac attaacgctt ctggagaaac 60
tcaacgagct ggacgcggat gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac gaccacgctg 120
atgagcttta ccgcagctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca 180
tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc 240
gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta 300
gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt 360
gcaccattgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc 420
tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 480
tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 540
aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 600
tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 660
tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 720
cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 780
agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 840
tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 900
aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 960
ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 1020
cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 1080
accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 1140
ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 1200
ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 1260
gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 1320
aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 1380
gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 1440
gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 1500
cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 1560
gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 1620
gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctgca 1680
ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 1740
tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 1800
ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 1860
cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 1920
accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaaca 1980
cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 2040
tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 2100
cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 2160
acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 2220
atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 2280
tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 2340
aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 2400
cgtatcacga ggccctttcg tcttcaagaa ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa 2460
gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa 2520
atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg 2580
cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt gcgggatatc cggatatagt tcctcctttc 2640
agcaaaaaac ccctcaagac ccgtttagag gccccaaggg gttatgctag ttattgctca 2700
gcggtggcag cagccaactc agcttccttt cgggcctcga gtgcggccgc ttattccagg 2760
gccttgtact cgaacatgac tttcacgagt tcgcacagtt cctcgctgtt ccggtcggtc 2820
atcagtttct ttttcttcag attcttcagg tgcacgatct tctctgattc cagggtctgg 2880
atttcgatct tcttgtcagc gccgatcttg aaggtggcca cgaagccgta ttctttcaga 2940
atgtccacga tggacttcat gatggcgttc ttcagcttcc ggtcgtagga cagcagcttc 3000
cgcaggtttt ccagcacttc cagcaggcta atctcggcgt gggggatgta gttgaagtgg 3060
gcaatgtagt tccggatgta caggtccttt ttttcctgct tcagtttctt cactttcttg 3120
tcggagtaga tgctccgctt ttccacattg tccttgtaca gttctttgta gaagttgata 3180
tacttttcca cgatctggcc gcttttgtac ttcacattct tggagttgtc gaaattgaaa 3240
atttcctcga tgtagtggtt ctcgggaaac tcgcccttca gccggaatct caggtcccgc 3300
tcccagatgc tggtgtagcc cacgagccgg tgcaggatct tcagcagcag gccctgcagc 3360
aggttcagct cattgaattc caccttgttc ttcaggtggg tgtacttctg gatgttgccg 3420
atggccttct catactcttt gtagtcctcg tcgttgaact tttcgtcctt cttgggtctg 3480
gcgtacttcc ggtgcaggtt ctgctgcatg gtgtagttct tttcaatctc attcttcttg 3540
ttgctgtact ctttcagttc tttcaggctg atcttatact tggccttatc ggcgatcttt 3600
tccagcagat tcagcatgcc gtatttcttg atattgtaga aggcccggtg cttgatgatg 3660
ttctcgccgt cgaaatagat cttgttggtg tcgaactttt tcagctcttt ccggtccttg 3720
attttgtttt cgttgaagtc caggaacttg ccgatctcgt tggcttccag ctcgaagtcc 3780
tcggtcactc tgttgttgtc caggttcagc aggttgatca gttccagctc gtcgctgaag 3840
gtttcttctt tgttggcgga ctggtacttt tccaggctgc ccttcaggtt ggtcagctct 3900
ttgtggttca gcagcttcag gatcaggtaa aacatgttca gattctcggt gtacttcaga 3960
atcttcccca gcttgatctc gcgcacgaac tcattgatct cgtgagggat ttctttgttc 4020
cgattgtgct tctcatagtt cttcaggatc ttgtcgtact tctctttgtt atcctttttg 4080
atcttgatct tggagaagat gtcgttgttg tcattgttgt tgttgctctc gatatacttc 4140
agattgttct tgttcaggta gtcgatgaag cccttcagga aaatctgctg aataaagtcg 4200
atgtaggtat tcttttcctc tttgtcctgg ttgttgatca tctctctgct ctggatgatg 4260
gccaggtatt ccacgggcac ggttttctcg atgttctcga acttctgata cttgtagtgg 4320
ccggttttct ggttccgctg cttgttaatc ttgatcactt cattggtgat cttaaagaac 4380
accttggagt ttttcacgaa cttgttcagg aactcgccgt agtagatatt cttcagcagg 4440
tagatctggg cgtccttctc ttctttgtcc ttgggcacgc tccaaaaaaa cttcagggta 4500
ttccgcaggt cctcaatctt gttgtacagc ttggtgaagc tgggcacgaa ggggatgttt 4560
ttgttcacga agttgaactt ggtattcttc aggtacttga tgatcacatc cttctcgtag 4620
tagttgaaca cgttggcgct gttcagctgc ttgaagattt tcagcttcag cttcttttcg 4680
ttgatttcgt tctgaaacat cttcttggag atctcgctgg gggcgatatt cttgaaggcg 4740
aagatgtcct tgccttccag ttccaggttg aagtgcacga tgccgtgtct gatgctgctg 4800
atggcctcgt cgatgttggc gaagaagtcc tcgatctcgt tcttgttgtc catgttgaag 4860
tcgtagctgt agaacatctt cagattttct ttcacttcgt tctgcttgtt ctcattgtag 4920
atcttgtcca cctcgccgga cacgtatttc tcttcgccct tgttgttctt cacggtcttg 4980
ccccgcatcc ggccggtgat atcgttctcg ttctcggttt ccaggatgtt cctcaggctg 5040
aagtaggcca cgctggacac gccgatgatg tttctcagga aggcctcgtt ctgccggttc 5100
cgggcgataa agtcggaggt ggcgatctcg cccacttgca gatagtagtt gtacttgccg 5160
cagttccgca cgtaggtgtc cagcttgttc agcagtttgt tttcgatcag ctttttcaga 5220
ttctggtact cgaagatccg cttgatctta tcgttgctga tgttgctcag ccgcttgtac 5280
acgtagtttt tcagcagctg ggacatctcg atttccacga agtggcagaa ggcgtactta 5340
atattcttgt cgttcagttc ctctttgtcc aggtagtact tgtagaacac ctggcttttc 5400
ttcagctcag acatgtcggg gatcttctca atcagctctt tgatgttgtt cacgttctgg 5460
atctcttcgt agataatctt ggcgaagttc tctttgtcgt tcttccggcc gatgatcttg 5520
tgatagtact cgcggatctt gtacttctcg tgcttcttgc tgttctcgat caggaaaaac 5580
agtttctcga tatcctcttt cttatacagc ttgtcgaagg cttcctgcac gttgttgatg 5640
tagtcgttgc gcttggcgct ctctctgtag tagtcgtaga tgatgttccg cttgctcttg 5700
ccgcccactt tttccacgtt gttctcgttg atcttctggt agttggcctt gttctcttcg 5760
aagctgtact tcaggctgtt gatcttgttc agcttggctt ccacgtcctt ccgaaagatt 5820
tccagttcct cagagttcac gtcctcgttc agcaggatct tcttcagcac ggagaagctg 5880
ttcttgtttt tcaggtcgta ctcgctgatg tcctcttcgc tatagttctt gtcctgcacg 5940
gcgttctttt ctttccggtt cttcagatac agcacgctgt ccttcaggtg cagcaccttg 6000
ttgctaaaga acttcttcag gttctctctt ctgatccggt tctcttcctc ggaggcgttg 6060
tcggggttct tgatgtagat gtccagccgg atgctcagca gctcgctcag tctctcgctg 6120
gtccggtttt cctcgctggt ggacttcacg agcttgccct cttcgatgta cttcttgtgg 6180
ctgatgccgt cgaccttggt cactttcatg gatccaccaa tctgttctct gtgagcctca 6240
ataatatcgt tatcctccat gtccaaatct tcaggggtct gatcagcttg gattctaata 6300
ccgtcgtaca agaatcttaa ggagtccatt tccttaccct gtcttttagc gaacgcttcc 6360
atcagccttc ttaaaggagt ggtctttttg atcttgaaga agatctctga agatccatcg 6420
gacaccttta aattgatgtg agtctcaggc ttgacttctg gcttgacctc tggcttagct 6480
tcttgattga cttctgagtc cgacattttc tcaaactgag ggtgtgacca tgcactacca 6540
cctgaaccac caccgctacc accacctttt tcaaactgcg gatggctcca gctagccata 6600
tggctgccgc gcggcaccag gccgctgctg tgatgatgat gatgatggct gctgcccatg 6660
gtatatctcc ttcttaaagt taaacaaaat tatttctaga ggggaattgt tatccgctca 6720
caattcccct atagtgagtc gtattaattt cgcgggatcg agatctcgat cctctacgcc 6780
ggacgcatcg tggccggcat caccggcgcc acaggtgcgg ttgctggcgc ctatatcgcc 6840
gacatcaccg atggggaaga tcgggctcgc cacttcgggc tcatgagcgc ttgtttcggc 6900
gtgggtatgg tggcaggccc cgtggccggg ggactgttgg gcgccatctc cttgcatgca 6960
ccattccttg cggcggcggt gctcaacggc ctcaacctac tactgggctg cttcctaatg 7020
caggagtcgc ataagggaga gcgtcgagat cccggacacc atcgaatggc gcaaaacctt 7080
tcgcggtatg gcatgatagc gcccggaaga gagtcaattc agggtggtga atgtgaaacc 7140
agtaacgtta tacgatgtcg cagagtatgc cggtgtctct tatcagaccg tttcccgcgt 7200
ggtgaaccag gccagccacg tttctgcgaa aacgcgggaa aaagtggaag cggcgatggc 7260
ggagctgaat tacattccca accgcgtggc acaacaactg gcgggcaaac agtcgttgct 7320
gattggcgtt gccacctcca gtctggccct gcacgcgccg tcgcaaattg tcgcggcgat 7380
taaatctcgc gccgatcaac tgggtgccag cgtggtggtg tcgatggtag aacgaagcgg 7440
cgtcgaagcc tgtaaagcgg cggtgcacaa tcttctcgcg caacgcgtca gtgggctgat 7500
cattaactat ccgctggatg accaggatgc cattgctgtg gaagctgcct gcactaatgt 7560
tccggcgtta tttcttgatg tctctgacca gacacccatc aacagtatta ttttctccca 7620
tgaagacggt acgcgactgg gcgtggagca tctggtcgca ttgggtcacc agcaaatcgc 7680
gctgttagcg ggcccattaa gttctgtctc ggcgcgtctg cgtctggctg gctggcataa 7740
atatctcact cgcaatcaaa ttcagccgat agcggaacgg gaaggcgact ggagtgccat 7800
gtccggtttt caacaaacca tgcaaatgct gaatgagggc atcgttccca ctgcgatgct 7860
ggttgccaac gatcagatgg cgctgggcgc aatgcgcgcc attaccgagt ccgggctgcg 7920
cgttggtgcg gatatctcgg tagtgggata cgacgatacc gaagacagct catgttatat 7980
cccgccgtta accaccatca aacaggattt tcgcctgctg gggcaaacca gcgtggaccg 8040
cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt gaagggcaat cagctgttgc ccgtctcact 8100
ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 8160
cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 8220
acgcaattaa tgtaagttag ctcactcatt aggcaccggg atctcgaccg atgcccttga 8280
gagccttcaa cccagtcagc tccttccggt gggcgcgggg catgactatc gtcgccgcac 8340
ttatgactgt cttctttatc atgcaactcg taggacaggt gccggcagcg ctctgggtca 8400
ttttcggcga ggaccgcttt cgctggagcg cgacgatgat cggcctgtcg cttgcggtat 8460
tcggaatctt gcacgccctc gctcaagcct tcgtcactgg tcccgccacc aaacgtttcg 8520
gcgagaagca ggccattatc gccggcatgg cggccgacgc gctgggctac gtcttgctgg 8580
cgttcgcgac gcgaggctgg atggccttcc ccattatgat tcttctcgct tccggcggca 8640
tcgggatgcc cgcgttgcag gccatgctgt ccaggcaggt agatgacgac catcagggac 8700
agcttcaagg atcgctcgcg gctcttacca gcctaacttc gatcattgga ccgctgatcg 8760
tcacggcgat ttatgccgcc tcggcgagca catggaacgg gttggcatgg attgtaggcg 8820
ccgccctata ccttgtctgc ctccccgcgt tgcgtcgcgg tgcatggagc cgggccacct 8880
cgacctgaat ggaagccggc ggcacctcgc taacggattc accactccaa gaattggagc 8940
caatcaattc ttgcggagaa ctgtgaatgc gcaaaccaac ccttggcaga acatatccat 9000
cgcgtccgcc atctccagca gccgcacgcg gcgcatctcg ggcagcgttg ggtcctggcc 9060
acgggtgcgc atgatcgtgc tcctgtcgtt gaggacccgg ctaggctggc ggggttgcct 9120
tactggttag cagaatgaat caccgatacg cgagcgaacg tgaagcgact gctgctgcaa 9180
aacgtctgcg acctgagcaa caacatgaat ggtcttcggt ttccgtgttt cgtaaagtct 9240
ggaaacgcgg aagtcagcgc cctgcaccat tatgttccgg atctgcatcg caggatgctg 9300
ctggctaccc tgtggaacac ctacatctgt attaacgaag cgctggcatt gaccctgagt 9360
gatttttctc tggtcccgcc gcatccatac cgccagttgt ttaccctcac aacgttccag 9420
taaccgggca tgttcatcat cagtaacccg tatcgtgagc atcctctctc gtttcatcgg 9480
tatcattacc cccatgaaca gaaatccccc ttacacggag gcatcagtga ccaaacagga 9540
aa 9542
<210> 15
<211> 1302
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ala Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln
35 40 45
Phe Glu Lys Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu
50 55 60
Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser
65 70 75 80
Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu
85 90 95
Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp
100 105 110
Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr
115 120 125
Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg
130 135 140
Glu Gln Ile Gly Gly Ser Met Lys Val Thr Lys Val Asp Gly Ile Ser
145 150 155 160
His Lys Lys Tyr Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Lys Ser Thr Ser Glu
165 170 175
Glu Asn Arg Thr Ser Glu Arg Leu Ser Glu Leu Leu Ser Ile Arg Leu
180 185 190
Asp Ile Tyr Ile Lys Asn Pro Asp Asn Ala Ser Glu Glu Glu Asn Arg
195 200 205
Ile Arg Arg Glu Asn Leu Lys Lys Phe Phe Ser Asn Lys Val Leu His
210 215 220
Leu Lys Asp Ser Val Leu Tyr Leu Lys Asn Arg Lys Glu Lys Asn Ala
225 230 235 240
Val Gln Asp Lys Asn Tyr Ser Glu Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Asp Leu
245 250 255
Lys Asn Lys Asn Ser Phe Ser Val Leu Lys Lys Ile Leu Leu Asn Glu
260 265 270
Asp Val Asn Ser Glu Glu Leu Glu Ile Phe Arg Lys Asp Val Glu Ala
275 280 285
Lys Leu Asn Lys Ile Asn Ser Leu Lys Tyr Ser Phe Glu Glu Asn Lys
290 295 300
Ala Asn Tyr Gln Lys Ile Asn Glu Asn Asn Val Glu Lys Val Gly Gly
305 310 315 320
Lys Ser Lys Arg Asn Ile Ile Tyr Asp Tyr Tyr Arg Glu Ser Ala Lys
325 330 335
Arg Asn Asp Tyr Ile Asn Asn Val Gln Glu Ala Phe Asp Lys Leu Tyr
340 345 350
Lys Lys Glu Asp Ile Glu Lys Leu Phe Phe Leu Ile Glu Asn Ser Lys
355 360 365
Lys His Glu Lys Tyr Lys Ile Arg Glu Tyr Tyr His Lys Ile Ile Gly
370 375 380
Arg Lys Asn Asp Lys Glu Asn Phe Ala Lys Ile Ile Tyr Glu Glu Ile
385 390 395 400
Gln Asn Val Asn Asn Ile Lys Glu Leu Ile Glu Lys Ile Pro Asp Met
405 410 415
Ser Glu Leu Lys Lys Ser Gln Val Phe Tyr Lys Tyr Tyr Leu Asp Lys
420 425 430
Glu Glu Leu Asn Asp Lys Asn Ile Lys Tyr Ala Phe Cys His Phe Val
435 440 445
Glu Ile Glu Met Ser Gln Leu Leu Lys Asn Tyr Val Tyr Lys Arg Leu
450 455 460
Ser Asn Ile Ser Asn Asp Lys Ile Lys Arg Ile Phe Glu Tyr Gln Asn
465 470 475 480
Leu Lys Lys Leu Ile Glu Asn Lys Leu Leu Asn Lys Leu Asp Thr Tyr
485 490 495
Val Arg Asn Cys Gly Lys Tyr Asn Tyr Tyr Leu Gln Val Gly Glu Ile
500 505 510
Ala Thr Ser Asp Phe Ile Ala Arg Asn Arg Gln Asn Glu Ala Phe Leu
515 520 525
Arg Asn Ile Ile Gly Val Ser Ser Val Ala Tyr Phe Ser Leu Arg Asn
530 535 540
Ile Leu Glu Thr Glu Asn Glu Asn Asp Ile Thr Gly Arg Met Arg Gly
545 550 555 560
Lys Thr Val Lys Asn Asn Lys Gly Glu Glu Lys Tyr Val Ser Gly Glu
565 570 575
Val Asp Lys Ile Tyr Asn Glu Asn Lys Gln Asn Glu Val Lys Glu Asn
580 585 590
Leu Lys Met Phe Tyr Ser Tyr Asp Phe Asn Met Asp Asn Lys Asn Glu
595 600 605
Ile Glu Asp Phe Phe Ala Asn Ile Asp Glu Ala Ile Ser Ser Ile Arg
610 615 620
His Gly Ile Val His Phe Asn Leu Glu Leu Glu Gly Lys Asp Ile Phe
625 630 635 640
Ala Phe Lys Asn Ile Ala Pro Ser Glu Ile Ser Lys Lys Met Phe Gln
645 650 655
Asn Glu Ile Asn Glu Lys Lys Leu Lys Leu Lys Ile Phe Lys Gln Leu
660 665 670
Asn Ser Ala Asn Val Phe Asn Tyr Tyr Glu Lys Asp Val Ile Ile Lys
675 680 685
Tyr Leu Lys Asn Thr Lys Phe Asn Phe Val Asn Lys Asn Ile Pro Phe
690 695 700
Val Pro Ser Phe Thr Lys Leu Tyr Asn Lys Ile Glu Asp Leu Arg Asn
705 710 715 720
Thr Leu Lys Phe Phe Trp Ser Val Pro Lys Asp Lys Glu Glu Lys Asp
725 730 735
Ala Gln Ile Tyr Leu Leu Lys Asn Ile Tyr Tyr Gly Glu Phe Leu Asn
740 745 750
Lys Phe Val Lys Asn Ser Lys Val Phe Phe Lys Ile Thr Asn Glu Val
755 760 765
Ile Lys Ile Asn Lys Gln Arg Asn Gln Lys Thr Gly His Tyr Lys Tyr
770 775 780
Gln Lys Phe Glu Asn Ile Glu Lys Thr Val Pro Val Glu Tyr Leu Ala
785 790 795 800
Ile Ile Gln Ser Arg Glu Met Ile Asn Asn Gln Asp Lys Glu Glu Lys
805 810 815
Asn Thr Tyr Ile Asp Phe Ile Gln Gln Ile Phe Leu Lys Gly Phe Ile
820 825 830
Asp Tyr Leu Asn Lys Asn Asn Leu Lys Tyr Ile Glu Ser Asn Asn Asn
835 840 845
Asn Asp Asn Asn Asp Ile Phe Ser Lys Ile Lys Ile Lys Lys Asp Asn
850 855 860
Lys Glu Lys Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Asn Tyr Glu Lys His Asn Arg
865 870 875 880
Asn Lys Glu Ile Pro His Glu Ile Asn Glu Phe Val Arg Glu Ile Lys
885 890 895
Leu Gly Lys Ile Leu Lys Tyr Thr Glu Asn Leu Asn Met Phe Tyr Leu
900 905 910
Ile Leu Lys Leu Leu Asn His Lys Glu Leu Thr Asn Leu Lys Gly Ser
915 920 925
Leu Glu Lys Tyr Gln Ser Ala Asn Lys Glu Glu Thr Phe Ser Asp Glu
930 935 940
Leu Glu Leu Ile Asn Leu Leu Asn Leu Asp Asn Asn Arg Val Thr Glu
945 950 955 960
Asp Phe Glu Leu Glu Ala Asn Glu Ile Gly Lys Phe Leu Asp Phe Asn
965 970 975
Glu Asn Lys Ile Lys Asp Arg Lys Glu Leu Lys Lys Phe Asp Thr Asn
980 985 990
Lys Ile Tyr Phe Asp Gly Glu Asn Ile Ile Lys His Arg Ala Phe Tyr
995 1000 1005
Asn Ile Lys Lys Tyr Gly Met Leu Asn Leu Leu Glu Lys Ile Ala Asp
1010 1015 1020
Lys Ala Lys Tyr Lys Ile Ser Leu Lys Glu Leu Lys Glu Tyr Ser Asn
1025 1030 1035 1040
Lys Lys Asn Glu Ile Glu Lys Asn Tyr Thr Met Gln Gln Asn Leu His
1045 1050 1055
Arg Lys Tyr Ala Arg Pro Lys Lys Asp Glu Lys Phe Asn Asp Glu Asp
1060 1065 1070
Tyr Lys Glu Tyr Glu Lys Ala Ile Gly Asn Ile Gln Lys Tyr Thr His
1075 1080 1085
Leu Lys Asn Lys Val Glu Phe Asn Glu Leu Asn Leu Leu Gln Gly Leu
1090 1095 1100
Leu Leu Lys Ile Leu His Arg Leu Val Gly Tyr Thr Ser Ile Trp Glu
1105 1110 1115 1120
Arg Asp Leu Arg Phe Arg Leu Lys Gly Glu Phe Pro Glu Asn His Tyr
1125 1130 1135
Ile Glu Glu Ile Phe Asn Phe Asp Asn Ser Lys Asn Val Lys Tyr Lys
1140 1145 1150
Ser Gly Gln Ile Val Glu Lys Tyr Ile Asn Phe Tyr Lys Glu Leu Tyr
1155 1160 1165
Lys Asp Asn Val Glu Lys Arg Ser Ile Tyr Ser Asp Lys Lys Val Lys
1170 1175 1180
Lys Leu Lys Gln Glu Lys Lys Asp Leu Tyr Ile Arg Asn Tyr Ile Ala
1185 1190 1195 1200
His Phe Asn Tyr Ile Pro His Ala Glu Ile Ser Leu Leu Glu Val Leu
1205 1210 1215
Glu Asn Leu Arg Lys Leu Leu Ser Tyr Asp Arg Lys Leu Lys Asn Ala
1220 1225 1230
Ile Met Lys Ser Ile Val Asp Ile Leu Lys Glu Tyr Gly Phe Val Ala
1235 1240 1245
Thr Phe Lys Ile Gly Ala Asp Lys Lys Ile Glu Ile Gln Thr Leu Glu
1250 1255 1260
Ser Glu Lys Ile Val His Leu Lys Asn Leu Lys Lys Lys Lys Leu Met
1265 1270 1275 1280
Thr Asp Arg Asn Ser Glu Glu Leu Cys Glu Leu Val Lys Val Met Phe
1285 1290 1295
Glu Tyr Lys Ala Leu Glu
1300
机译: 基于在样品中任选存在的寡核苷酸,适合用于HBV核酸扩增的寡核苷酸引物对,基于HBV靶标的HBV DNA的核酸序列的转录进行扩增的方法,以及适用于基于HBV DNA转录进行扩增和检测的测试试剂盒
机译: 基于基于任选存在于样品,寡核苷酸中的HBV的双丝的HBV DNA靶核酸序列的转录进行扩增的方法,适于基于HBV DNA转录进行扩增和检测的测试试剂盒
机译: HBV cccDNA纯化试剂盒