一株马西利亚菌菌株KC 009，其发酵液及应用

技术领域

本发明涉及一株马西利亚菌菌株KC 009，其发酵液及应用，属微生物菌肥技术领域。

背景技术

菊花(Chrysanthemum morifolium)是我国十大传统名花，也是世界四大切花之一。我国作为菊花栽培的起源中心和菊属种质资源的分布中心，有着悠久的栽培历史。菊属植物有40余种，在我国分布的有 20余种，栽培菊园艺品种达数千余个。菊花除了具极高的观赏价值外，还可入药，具有散风清热、平肝明目、清热解毒之功效，亦可用作茶饮、食用；现代更是将其进行深度处理用于化妆品等工业的开发。菊花由于用途广泛，因而市场需求较大，这也促进了菊花的快速繁殖研究。目前，菊花常用的繁殖方法有：种子(播种)繁殖、分株繁殖、组培繁殖和扞插繁殖。由于播种苗很难保持原有品种的特性，分株繁殖的繁殖系数较低，组培繁殖需要建立无菌体系、炼苗历时较长，因此菊花种苗生产中常采用扞插繁殖。扞插能够保持品种的优良性状、繁殖系数较高、成苗时间短，是菊花大规模工厂化生产的最优繁殖途径。但菊花扦插育苗时，插穗的生根数量少、生根质量差严重制约了其市场供给和产业化应用。

土壤微生物可以分泌激素来调节植物生长，也可以通过固氮、解磷、解钾来促进植物生长、增加植物的抗性、改善土壤微生态，因此在植物促生根领域有着较好的应用潜力。马西利亚菌(Massilia)广泛分布于植物根际，具有固氮、解磷、产激素、产铁载体和ACC脱氨酶等促进植物生长的功能，其中固氮和解无机磷的能力较强。马西利亚菌能提高番茄、黄瓜、甘草和黄芪的发芽率、株高、根长、干重和鲜重，但目前还未见其在促进菊花生根繁殖方面的研究报道。

发明内容

为了解决菊花扦插育苗时生根数量少、生根质量差的问题，本发明提供一种马西利亚菌(Massilia consociata)菌株KC 009，保藏编号为CGMCC No.24333；

本发明马西利亚菌菌株KC 009筛选自云南昆明轿子山土壤，具有提高菊花扦插生根数量和质量的作用；

本发明利用细菌的16S rRNA基因通用引物对筛选到的菌株KC 009进行PCR扩增及测序鉴定：按细菌DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA，扩增细菌16S rRNA基因片段，经过测序鉴定该菌为马西利亚菌(Massilia consociata)，其16S rRNA基因序列如 SEQ IDNo.1所示；

本发明将筛选到的马西利亚菌菌株KC 009 马赛菌(Massilia sp)于2022年1月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.24333；

本发明还提供一种含有所述的马西利亚菌菌株KC 009的发酵液；

优选地，所述发酵液通过以下步骤获得：

步骤一，制备改良ISP 2培养基：称取动物蛋白胨1～10g，大豆蛋白胨0.5～5g，酵母膏2～20g，葡萄糖2～20g，麦芽浸粉2.5～25g，微量盐0.5～5ml和复合维生素0.005～0.05mg，用自来水溶解并定容至0.5～5L，调节pH到7.0～7.5，121℃灭菌20～30分钟。

步骤二，发酵：在装有50～150mL改良ISP 2液体培养基的三角瓶中接种菌株KC009，25～30℃恒温摇床100～200rpm培养3～8天，得到发酵液。

优选地，所述微量盐组成为：FeSO

优选地，所述复合维生素组成为：维生素B6占复合维生素用量的2/3，生物素占复合维生素用量的1/3；

本发明还提供所述的马西利亚菌(Massilia consociata)菌株KC 009在育苗的应用；

本发明还提供所述的马西利亚菌(Massilia consociata)菌株KC 009发酵液在菊花生根繁殖中的应用。

本发明使用KC 009发酵液稀释液进行灌溉，在扦插前期促进插穗分泌IAA和GA，通过IAA和GA对愈伤组织和根原基进行诱导分化，促进不定根的生成；同时POD活性的提高也诱导了不定根的生成；在扦插第11天，不定根开始生成，被灌溉KC 009发酵液1000倍稀释液的处理组，叶绿素含量高于对照组，活动更旺盛，光合产物均开始增加，生根更多，进而导致SOD含量也较对照组增高。随着采摘形成的伤口已经愈合并产生了新的根系，MDA含量开始下降。

本发明的优点：

1.本发明使用KC 009发酵液稀释液进行灌溉，可促进菊花插穗的生根，增加根长、增加根量、不污染环境。

2.本发明将马西利亚菌(Massilia consociata)菌株KC 009应用于菊花育苗，解决扦插菊花生根能力差的问题，实现工厂化育苗，利于产业化生产。

附图说明

图1为马西利亚菌KC 009的系统发育树。

图2为本发明实施例3的马西利亚菌KC 009对菊花“神马”的促进不定根生根数量作用图。

图3为本发明实施例3的马西利亚菌KC 009对菊花“神马”的促进不定根生根长度作用图。

图4为本发明实施例3的马西利亚菌KC 009对菊花“神马”的促进作用实物图(第20天生长对比)。

图5为本发明实施例3的马西利亚菌KC 009对菊花“晃花の宝”的促进不定根生根数量作用图。

图6为本发明实施例3的马西利亚菌KC 009对菊花‘晃花の宝’的过氧化物酶(POD)含量作用图。

图7为本发明实施例3的马西利亚菌KC 009对菊花‘晃花の宝’的超氧化物歧化酶(SOD)含量作用图。

图8为本发明实施例3的马西利亚菌KC 009对菊花‘晃花の宝’的丙二醛(MDA)含量作用图。

图9为本发明实施例3的马西利亚菌KC 009对菊花‘晃花の宝’的叶绿素含量作用图。

图10为本发明实施例3的马西利亚菌KC 009对菊花‘晃花の宝’的生长素(IAA)含量作用图。

图11为本发明实施例3的马西利亚菌KC 009对菊花‘晃花の宝’的赤霉素(GA)含量作用图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述；以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

1.发酵液制备：

步骤一，制备改良ISP 2培养基：称取动物蛋白胨1g，大豆蛋白胨0.5g，酵母膏2g，葡萄糖2g，麦芽浸粉2.5g，微量盐 (FeSO

步骤二，发酵：在装有50mL改良ISP 2液体培养基的三角瓶中接种菌株KC 009，25℃恒温摇床100rpm培养3天，得到发酵液。

2.选用菊花“神马和晃花の宝”作为扦插材料。从营养和生长良好的菊花母株上采取顶部插穗，每个插穗8cm，5个节，保留2个叶片，切口呈40度角。

3.将腐殖土作为扞插基质，装入穴盘内备用，穴盘采用72孔穴盘；将KC 009发酵液稀释1000倍备用；地点在昆明学院日光温室内，温度在20摄氏度左右。

4.在穴盘扞插基质上插2cm深的小洞，将插穗每孔插一棵，然后紧实土壤，再使用KC 009发酵液1000倍稀释液浇透基质，并搭设遮阳网，其后每天每穴盘浇灌1.5L的KC 009发酵液1000倍稀释液，共浇灌20次。

5.培养20天，从第八天开始每三天取一次苗，每次取苗30棵。

实施例2

1.发酵液制备：

步骤一，制备改良ISP 2培养基：称取动物蛋白胨10g，大豆蛋白胨5g，酵母膏20g，葡萄糖20g，麦芽浸粉25g，微量盐 (FeSO

步骤二，发酵：在装有150mL改良ISP 2液体培养基的三角瓶中接种菌株KC 009，30℃恒温摇床200rpm培养8天，得到发酵液。

2.选用菊花“神马和晃花の宝”作为扦插材料。从营养和生长良好的菊花母株上采取顶部插穗，每个插穗12cm，6个节，保留3个叶片，切口呈45度角。

3.将腐殖土作为扞插基质，装入穴盘内备用，穴盘采用72孔穴盘；将KC 009发酵液稀释1000倍备用；地点在昆明学院日光温室内，温度在20摄氏度左右。

4.在穴盘扞插基质上插3cm深的小洞，将插穗每孔插一棵，然后紧实土壤，再使用KC 009发酵液1000倍稀释液浇透基质，并搭设遮阳网，其后每天每穴盘浇灌1.5L的KC 009发酵液1000倍稀释液，共浇灌20次。

5.培养20天，从第八天开始每三天取一次苗，每次取苗30棵。

实施例3

1.发酵液制备：

步骤一，制备改良ISP 2培养基：称取动物蛋白胨2.0g，大豆蛋白胨1.0g，酵母膏4.0g，葡萄糖4.0g，麦芽浸粉5.0g，微量盐 (FeSO

步骤二，发酵：在装有100mL改良ISP 2液体培养基的三角瓶中接种KC 009，28℃恒温摇床200rpm培养5天，得到发酵液。

2.选用菊花“神马和晃花の宝”作为扦插材料。从营养和生长良好的菊花母株上采取顶部插穗，每个插穗10cm，6个节，保留3个叶片，切口呈43度角。

3.将腐殖土作为扞插基质，装入穴盘内备用，穴盘采用72孔穴盘；将KC 009发酵液稀释1000倍备用；地点在昆明学院日光温室内，温度在20摄氏度左右。

4.在穴盘扞插基质上插3cm深的小洞，将插穗每孔插一颗，然后紧实土壤，再使用KC 009发酵液1000倍稀释液浇透基质，并搭设遮阳网，其后每天每穴盘浇灌1.5L的KC 009发酵液1000倍稀释液，共浇灌20次。

5.培养20天，从第八天开始每三天取一次苗，每次取苗30棵。

实施例4

1.发酵液制备：

步骤一，制备改良ISP 2培养基：称取动物蛋白胨5g，大豆蛋白胨2.5g，酵母膏10g，葡萄糖10g，麦芽浸粉12.5g，微量盐 (FeSO

步骤二，发酵：在装有75mL改良ISP 2液体培养基的三角瓶中接种菌株KC 009，27℃恒温摇床200rpm培养8天，得到发酵液。

2.选用菊花“神马和晃花の宝”作为扦插材料。从营养和生长良好的菊花母株上采取顶部插穗，每个插穗9cm，5个节，保留2个叶片，切口呈42度角。

3.将腐殖土作为扞插基质，装入穴盘内备用，穴盘采用72孔穴盘；将KC 009发酵液稀释1000倍备用；地点在昆明学院日光温室内，温度在20摄氏度左右。

4.在穴盘扞插基质上插2cm深的小洞，将插穗每孔插一颗，然后紧实土壤，再使用KC 009发酵液1000倍稀释液浇透基质，并搭设遮阳网，其后每天每穴盘浇灌1.5L的KC 009发酵液1000倍稀释液，共浇灌20次。

5.培养20天，从第八天开始每三天取一次苗，每次取苗30棵。

实施例5

1.发酵液制备：

步骤一，制备改良ISP 2培养基：称取动物蛋白胨8g，大豆蛋白胨4g，酵母膏16g，葡萄糖16g，麦芽浸粉20g，微量盐 (FeSO

步骤二，发酵：在装有130mL改良ISP 2液体培养基的三角瓶中接种菌株KC 009，28℃恒温摇床200rpm培养8天，得到发酵液。

2.选用菊花“神马和晃花の宝”作为扦插材料。从营养和生长良好的菊花母株上采取顶部插穗，每个插穗11cm，6个节，保留3个叶片，切口呈44度角。

3.将腐殖土作为扞插基质，装入穴盘内备用，穴盘采用72孔穴盘；将KC 009发酵液稀释1000倍备用；地点在昆明学院日光温室内，温度在20摄氏度左右。

4.在穴盘扞插基质上插3cm深的小洞，将插穗每孔插一颗，然后紧实土壤，再使用KC 009发酵液1000倍稀释液浇透基质，并搭设遮阳网，其后每天每穴盘浇灌1.5L的KC 009发酵液1000倍稀释液，共浇灌20次。

5.培养20天，从第八天开始每三天取一次苗，每次取苗30棵。

对比例(不添加菌株KC 009)

1.发酵液制备：

步骤一，制备改良ISP 2培养基：称取动物蛋白胨2.0g，大豆蛋白胨1.0g，酵母膏4.0g，葡萄糖4.0g，麦芽浸粉5.0g，微量盐 (FeSO

步骤二，在装有100mL改良ISP 2液体培养基的三角瓶置于28℃恒温摇床200rpm培养5天，得到发酵液。

2.选用菊花“神马和晃花の宝”作为扦插材料。从营养和生长良好的菊花母株上采取顶部插穗，每个插穗10cm，6个节，保留3个叶片，切口呈43度角。

3.将腐殖土作为扞插基质，装入穴盘内备用，穴盘采用72孔穴盘；将发酵液稀释1000倍备用；地点在昆明学院日光温室内，温度在20 摄氏度左右。

4.在穴盘扞插基质上插3cm深的小洞，将插穗每孔插一颗，然后紧实土壤，再使用发酵液1000倍稀释液浇透基质，并搭设遮阳网，其后每天每穴盘浇灌1.5L的发酵液1000倍稀释液，共浇灌20次。

5.培养20天，从第八天开始每三天取一次苗，每次取苗30棵。

结果分析

表1本发明实施例3的马西利亚菌KC 009对菊花“神马”的促进不定根生根数量作用表

表2本发明实施例3的马西利亚菌KC 009对菊花“神马”的促进不定根生根长度作用表

由表1、2和图2、3可以看出，KC 009发酵液1000倍稀释液与对照相比，在扦插第20天时可以提高菊花“神马”40.79％的不定根生根数量，同时增加“神马”根长35.68％。图4为第20天取样的对照与处理组对比图，结果差异显著。

由表3可知，经KC 009发酵液1000倍稀释液处理的‘晃花の宝’生根率要远高于对照组。第20d时，处理组的生根率达到了90％，而对照仅为53.33％。

表3本发明实施例3的马西利亚菌KC 009对菊花“晃花の宝”的促进不定根生根数量作用表

由图5对菊花“晃花の宝”作用可知，自扦插14d开始，处理组平均根数开始高于对照组。在第20d时，处理组平均根数较对照组提高了30.95％。

过氧化物酶(POD)与愈伤组织的形成和根原基的诱导密切相关。由图6可知，“晃花の宝”处理组的POD含量整体高于对照组，第11 天的增幅最大，达到43.02％。

超氧化物歧化酶(SOD)可岐化超氧化物阴离子自由基生成过氧化氢和分子氧，保护细胞免受氧化损伤，其含量指征了代谢活动的强弱。图7显示，“晃花の宝”处理组的SOD含量始终高于对照组，即KC 009发酵液1000倍稀释液刺激并增强了插穗菊花的代谢强度。

植物遭受机械伤害时，会引起膜脂过氧化作用，进而导致MDA 等过氧化物的产生，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。由图 8可知，“晃花の宝”处理组MDA含量整体呈现先上升后下降的趋势，因为插穗都不同程度地遭受细胞膜结构和功能的破坏，但到了生根后期便恢复正常的生理代谢活动。在处理的20d内，处理组比对照组的 MDA含量要低，说明了处理组的愈伤组织形成更快，从而促进不定根的产生。

叶绿素含量，反映了插穗进行光合作用的能力。图9“晃花の宝”处理组可以看出，扦插前11d叶绿素含量都有所下降，是由于插穗基部正处于根的发生阶段，插穗叶片光合速率下降，光合产物合成受阻。扦插11d时根系开始形成，第14d时叶绿素含量开始回升，这为插穗有足够的光合色素进行光合作用提供了保证，也为生长恢复时期的插穗提供了生长的物质基础。而处理组促进了不定根的生成，间接促进了叶绿素的合成，所以整体处理组的叶绿素含量都高于对照组，这又加快了菊花的插穗生根和提高了生根后的幼苗品质。

吲哚乙酸(IAA)能促进植株的生长，还可以诱导不定根的生成。图10是KC 009发酵液1000倍稀释液处理“晃花の宝”对其内源激素 IAA的影响。扦插11d时，IAA含量增加，此时生根开始形成。IAA 含量变化趋势与平均生根数从11d到20d增长趋势相吻合，整体上处理组要高于对照组，特别是扦插的第11天，处理组IAA含量比对照组增加了27.8％。

图11是KC 009发酵液1000倍稀释液处理“晃花の宝”对赤霉素 (GA)的影响。GA可以促进细胞的伸长，在愈伤组织形成及根原基分化时也有促进作用。前20d内，整体上处理组的GA含量平均较对照组提高了25.99％；在11天时GA含量最高，较对照组提高了59.74％。

综上所述，插穗从母体植株上采摘，会对养分和水分的吸收造成许多压力，从而改变内源激素。此外，插穗遭受采摘带来的机械损伤和失水胁迫，导致MDA等过氧化物的产生，引起膜脂过氧化和脱酯化作用，细胞膜的结构和功能受到破坏，干扰细胞正常的生理代谢。使用KC 009发酵液1000倍稀释液进行灌溉，在扦插前期促进插穗分泌IAA和GA，通过IAA和GA对愈伤组织和根原基进行诱导分化，促进不定根的生成；同时POD活性的提高也诱导了不定根的生成；在扦插第11天，不定根开始生成，被灌溉KC 009发酵液1000倍稀释液的处理组，叶绿素含量高于对照组，活动更旺盛，光合产物均开始增加，生根更多，进而导致SOD含量也较对照组增高。随着采摘形成的伤口已经愈合并产生了新的根系，MDA含量开始下降。

本发明使用KC 009发酵液1000倍稀释液进行灌溉，可促进菊花插穗的生根，增加根长和根量；将马西利亚菌(Massilia consociata) 菌株KC 009应用于菊花育苗，解决扦插菊花生根能力差的问题，实现工厂化育苗，利于产业化生产。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 昆明学院

<120> 一株马西利亚菌菌株KC009，其发酵液及应用

<130> 2022

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1494

<212> DNA

<213> Massilia consociata

<400> 1

tagagtttga tcatggctca gattgaacgc tggcggcatg ctttacacat gcaagtcgaa 60

cggcagcacg ggcttcggcc tggtggcgag tggcgaacgg gtgagtaata tatcggaacg 120

tacccagaag tgggggataa cgtagcgaaa gttacgctaa taccgcatac gatctacgga 180

tgaaagtggg ggaccttcgg gcctcatgct tttggagcgg ccgatatctg attagctagt 240

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taccctggta gtccacgccc taaacgatgt ctactagttg tcgggtttta attaacttgg 840

taacgcagct aacgcgtgaa gtagaccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ttaaaactca 900

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aaaaacctta cctacccttg acatggaagg aatcccggag agatccggga gtgcccgaaa 1020

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aagtcccgca acgagcgcaa cccttgtcat tagttgctac gcaagagcac tctaatgaga 1140

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