检测男性不孕不育的基因文库的构建方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测领域，特别涉及一种检测男性不孕不育的基因文库的构建方法和试剂盒。

背景技术

男性不育是指夫妻双方在无保护性措施的同居下一年及以上，无法使女方自然受孕。男性不育患者主要表现为：梗阻性无精子症(临床表现为精液常规检查未见精子，附睾穿刺/睾丸组织活检可见精子)，非梗阻性无精子症/严重少精子症(临床表现为精液常规检查未见精子，附睾穿刺/睾丸组织活检未见精子，或者精子数量极度减少等)，和弱/畸形精子症(临床表现为精子数量减少、精子运动能力下降或精子形态畸形)。

虽然小部分患者可通过体外受精的辅助生殖技术，产生后代，但其成功率一直是生殖医学领域的一个难题，且当前的辅助生殖技术助孕流程复杂以及成本高昂，这给患者带来巨大的心里压力和经济负担。另一方面，目前大多数患者的病因不明，通过辅助生殖技术出生孩子是否将来仍有不育的风险一直让人担忧。

明确男性不育的病因对于医学基础研究及临床治疗均有重要意义。男性不育的病因复杂，由于男性生殖系统的特殊环境，遗传缺陷被认为可能是主要病因，并有高度的遗传异质性。已往的研究揭示，参与精子发生的基因有数千个，其中超过800个基因被敲除后，在模式动物中显示出雄性不育的表型。但在人类，男性不育的遗传病因学研究处于起步阶段，参与精子发生的基因多达2000多个，但明确的男性不育致病基因仅仅才100多个，大量未知的男性不育致病基因有待发现和阐明其致病机制。不同的致病基因导致的临床表型和助孕结局也不一样。因此，在临床上明确男性不育患者的遗传学因素对于助孕治疗方案的选择具有重要意义。目前已经被发现的与男性无精子症和严重少精子症相关的基因，包括MEIOB、MEI1、SPO11、TEX14、TEX11、TEX15、TDRD9、TDRD7、SYCE1、ZMYND15和C11orf80等；弱畸形精子症(精子变形和尾部鞭毛组装)的致病基因，包括DPY19L2、ZPBP、PICK1、SPATA16、SUN5、BRDT、TSGA10、AKAP3、AKAP4、DNAH1、CFAP43、CFAP44、DNAH11、DNAH5、SPAG1、CFAP47、CFAP58、CFAP65、CFAP69、CFAP70、CFAP91、CFAP251、DNAH2、DNAH6、DNAH8、DNAH10、DNAH17、AK7、ARMC2、CEP135、DZIP1、FSIP2、QRICH2、SPEF2、TTC29、TTC21A和WDR63等。

通过对男性不育患者的致病基因进行检测，即基因诊断(gene、diagnosis)技术，明确患者遗传病因，是目前明确疾病的诊断、从而进行有效精准的药物等治疗、进而选择合适的辅助生殖助孕方式、保证生育健康后代和避免出生缺陷的有效手段。

目前基因诊断技术主要为基于单个基因外显子区及其侧翼序列的普通一代PCR-Sanger测序技术，该技术设计较为个性化，通用性较低。个性化强也意味着工作量大，周期长，成本高昂，因此当前应用一代PCR-Sanger测序检测不孕不育遗传基因突变，面临极大的挑战。

发明内容

基于此，本发明的目的包括提供检测男性不孕不育的基因文库的构建方法，构建的文库能够用于二代测序，通用性强、诊断率高、耗时短。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

在本发明的第一方面，提供一种检测男性不孕不育的二代测序基因文库的构建方法，所述构建方法包括：

获取样本的基因组DNA；

对所述基因组DNA中的男性不孕不育基因进行扩增，构建检测男性不孕不育基因的文库；

所述男性不孕不育基因包括非梗阻性无精子症/严重少精子症相关基因、弱/畸形精子症相关基因和少弱畸形精子症相关基因；

所述非梗阻性无精子症/严重少精子症相关基因选自如下基因中的一种或者多种：DMC1、FKBP6、MEI1、MEIOB、MAJIN、MSH4、MSH5、RAD21L1、RNF212、SHOC1、SIX6OS1、SPATA22、STAG3、SYCE1、SYCP3、TERB1、TERB2、TEX11、TEX15、TOL6BL、XRCC2、ZSWIM7、M1AP、FBXO43、RPL10L、ZMYND15、TDRD7、TDRD9、NR5A1、TEX14、USP26、ANOS1、SPINK2、USP9Y和CEP128；

所述弱/畸形精子症相关基因选自如下基因中的一种或者多种：DNAH1、DNAH2、DNAH6、DNAH17、CFAP70、CFAP43、CFAP44、CFAP251、CFAP91、SPEF2、CFAP65、FSIP2、AKAP4、CEP135、DZIP1、TTC21A、TTC29、CFAP69、QRICH2、AK7、ARMC2、CFAP47、CFAP58、DNAH8、DNAH10、CFAP206、CATIP、WDR63、DNHD1、SLO3、DRC1、STK33、SUN5、TSGA10、PMFBP1、DNAAF1、DNAAF2、DNAAF3、DNAAF4、DNAAF5、DNAAF6、ZMYND10、LRRC6、C11orf70、TTC12、DNAH5、DNAH9、DNAI1、DNAI2、CCDC39、CCDC40、GAS8、RSPH1、RSPH3、RSPH4A、RSPH9、HYDIN、DNAJB13、GAS2L2、DPY19L2、CATSPER2、ZPBP、PICK1、SPATA16、BRDT、SPAG1、SLC26A8、CATSPER1、CCNO、AURKC、C21orf59、CCDC151、CCDC114、GFPT2、PATE1、GALNTL5、IFT74、WDR1和ADCY10；

所述少弱畸形精子症相关基因选自如下基因中的一种或者多种：FANCM、CDC14A、KLHL10、SEPTIN12、SYCP2、BRWD1、CFAP61、RABL2A和KATNAL2。

在本发明的一些实施方式中，所述样本取自特发性无精子症患者、特发性严重少精子症患者或者特发性弱/畸形精子症患者。

在本发明的一些实施方式中，扩增所述男性不孕不育相关基因对应的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1-SEQ ID No.326所示。

在本发明的一些实施方式中，所述样本为体液或者组织。

在本发明的第二方面，提供一种检测男性不孕不育基因的试剂盒，所述试剂盒包含扩增第一方面中定义的所述男性不孕不育基因的引物对。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括DNA提取试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括用于文库构建的反应试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述反应试剂包括多重PCR聚合酶、DNA连接酶、末端修复酶、dNTPs和PCR缓冲液中的一种或者多种。

在本发明的第三方面，提供第二方面所述的试剂盒在检测男性不孕不育基因中的应用。

在本发明的一些实施方式中，检测采用二代测序法。

相对于传统技术，本发明具有如下有益效果：本发明提供的方法，能针对合适的男性不孕不育基因进行扩增并构建二代测序文库，实现二代测序在男性不孕不育基因检测中的应用，采用二代测序对男性不孕不育基因进行检测，优点包括：(1)通量高：基于高通量测序技术，可以同时对每个样品上的多个基因进行分析；(2)成本低：随着NGS测序技术的不断发展和测序成本的不断降低，本发明对男性不育患者基因突变分析的成本也在不断下降；(3)效率高：省去了大量的引物设计、PCR和测序结果拼接分析的实验，节省了时间；(4)测序深度高，平均测序深度100×以上，可信度强。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为男性不孕不育患者遗传基因突变分析流程图；

图2为2个弱畸形精子症导致的男性不育家系图及DNHD1突变测序分析。

具体实施方式

下面结合附图、实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。

本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。

本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。

本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。

本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。

本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。

本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。

本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。

本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。

备注术语：

读段(reads)：是指测序获得的序列片段。

单核苷酸多态性(single、nucleotide、polymorphism，SNP)：主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。

测序深度：例如在本发明的一个实施方案中，测序深度为100×，即代表该条特异PCR扩增产物被测序100次。

目前的不孕不育基因诊断技术主要为基于单个基因外显子区及其侧翼序列的普通一代PCR-Sanger测序技术，该技术设计较为个性化，通用性较低。个性化强也意味着工作量大，周期长，成本高昂，因此当前应用一代PCR-Sanger测序检测不孕不育遗传基因突变，面临极大的挑战。并且，采用普通一代PCR-Sanger测序技术进行检测的过程中，随着新的研究成果的发现，男性不育的致病基因需要定期更新并需要补充新的扩增引物。

在临床科研实践中，发现导致男性不育患者致病基因已超过百个，并且随着遗传学研究的进一步发展，其数目有呈逐年增加趋势，对这类患者进行传统的临床遗传检测面临巨大的困难，也给患者带来巨大的经济负担，从而不利后续到的对症治疗和保障后代的优生优育。

相较于一代PCR-Sanger测序，二代测序(NGS)以其通量高(可以同时进行多个基因乃至全部基因检测)，已成为当前具有多个致病基因的遗传病检测的主流技术，在高通量测序平台易实现自动化分析，能够同时快速高效的对不孕不育的基因进行检测。且随着近年来遗传学领域和技术的飞速发展，NGS技术的成本也正逐年降低到普通患者可以接受的程度，能够在临床上对不孕不育患者开展遗传基因检测。

本发明旨在针对不孕不育患者致病基因过多的特点，对这些患者的体液或者组织基因组DNA抽提后进行二代测序及一次性分析所有相关致病基因，建立一种通用性强、诊断率高、耗时短、成本低的不孕不育遗传学检测方法。

本发明提供一种检测男性不孕不育的二代测序基因文库的构建方法，所述构建方法包括：

获取样本的基因组DNA；

对所述基因组DNA中的男性不孕不育基因进行扩增，构建检测男性不孕不育基因的文库；

所述男性不孕不育基因包括非梗阻性无精子症/严重少精子症相关基因、弱/畸形精子症相关基因和少弱畸形精子症相关基因；

所述非梗阻性无精子症/严重少精子症相关基因选自如下基因中的一种或者多种：DMC1、FKBP6、MEI1、MEIOB、MAJIN、MSH4、MSH5、RAD21L1、RNF212、SHOC1、SIX6OS1、SPATA22、STAG3、SYCE1、SYCP3、TERB1、TERB2、TEX11、TEX15、TOL6BL、XRCC2、ZSWIM7、M1AP、FBXO43、RPL10L、ZMYND15、TDRD7、TDRD9、NR5A1、TEX14、USP26、ANOS1、SPINK2、USP9Y和CEP128；

所述弱/畸形精子症相关基因选自如下基因中的一种或者多种：DNAH1、DNAH2、DNAH6、DNAH17、CFAP70、CFAP43、CFAP44、CFAP251、CFAP91、SPEF2、CFAP65、FSIP2、AKAP4、CEP135、DZIP1、TTC21A、TTC29、CFAP69、QRICH2、AK7、ARMC2、CFAP47、CFAP58、DNAH8、DNAH10、CFAP206、CATIP、WDR63、DNHD1、SLO3、DRC1、STK33、SUN5、TSGA10、PMFBP1、DNAAF1、DNAAF2、DNAAF3、DNAAF4、DNAAF5、DNAAF6、ZMYND10、LRRC6、C11orf70、TTC12、DNAH5、DNAH9、DNAI1、DNAI2、CCDC39、CCDC40、GAS8、RSPH1、RSPH3、RSPH4A、RSPH9、HYDIN、DNAJB13、GAS2L2、DPY19L2、CATSPER2、ZPBP、PICK1、SPATA16、BRDT、SPAG1、SLC26A8、CATSPER1、CCNO、AURKC、C21orf59、CCDC151、CCDC114、GFPT2、PATE1、GALNTL5、IFT74、WDR1和ADCY10；

所述少弱畸形精子症相关基因选自如下基因中的一种或者多种：FANCM、CDC14A、KLHL10、SEPTIN12、SYCP2、BRWD1、CFAP61、RABL2A和KATNAL2。

本发明所述男性不孕不育基因选自上述基因中的1个、2个、3个、4个……120个、121个、122个或者123个。

在本发明的一些实施方式中，所述样本取自特发性无精子症患者、特发性严重少精子症患者或者特发性弱/畸形精子症患者。

在本发明的一些实施方式中，扩增所述男性不孕不育基因对应的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1-SEQ ID No.326所示。本发明提供的引物对，能够基于多重PCR在同一管中扩增对应男性不孕不育基因的基因外显子及其侧翼序列。

在本发明的一些实施方式中，所述样本为体液或者组织。

本发明提供一种检测男性不孕不育基因的试剂盒，所述试剂盒包含扩增第一方面中定义的所述男性不孕不育基因的引物对。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括DNA提取试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括用于文库构建的反应试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述反应试剂选自多重PCR聚合酶、DNA连接酶、末端修复酶、dNTPs和PCR缓冲液中的一种或者多种。

本发明提供第二方面所述的试剂盒在检测男性不孕不育基因中的应用。

在本发明的一些实施方式中，检测采用二代测序法。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。

下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。

本发明所用试剂及试剂盒：德国QIAGEN公司的DNA抽提试剂盒(DNA、Qiamp、DNA、Blood、Mini、Kit；51106)；美国Promega公司的PCR扩增试剂盒(

本发明中，对临床上受检患者的体液或者组织样品进行全基因组DNA抽提后，样本DNA进行碎片化和建立基因组文库，并对文库中全部基因的外显子及其侧翼序列进行捕获及高通量测序，应用本发明出的一套新的分析流程，分析被评估为致病基因的编码区、编码区侧翼剪切位点，结合大样本人群数据库频率分析、患者家系共分离分析以及多种生物信息学预测分析等技术，明确了众多患者的致病基因突变，为其后续的临床治疗、保障其孩子的健康以及其他类似患者提供了依据。具体实验方法(参照图1)和结果如下：

1、临床适应证：

对临床上的男性不育患者进行精液常规检测，若有患者精液有内精子则加做精子巴氏染色，最终诊断的以下患者将可入选进行该项目检测：

1.1、特发性无精子症患者；

1.2、特发性严重少精子症患者(精子浓度≤5×10

1.3、特发性弱/畸形精子症患者(精子活动力≤20％，单一畸形≥80％)(伴或不伴呼吸系统疾病)；

1.4、合并特发性少弱畸形精子症患者。

2、基因组DNA提取

采用德国QIAGEN公司的DNA抽提试剂盒(DNA、Qiamp、DNA、Blood、Mini、Kit；51106)用于抽提体液(如外周血、尿液、唾液、精液等)或者组织样品DNA，步骤包括：

2.1、若为组织，取绿豆大小的组织，放入1.5mL的离心(EP)管，加入180μl的组织裂解液ATL，用眼科剪剪碎组织后，加入20μl的蛋白酶K，颠倒混匀，震荡60s，56℃水浴45min。后加200μl、细胞裂解液AL，颠倒混匀，震荡30s，瞬时离心，70℃水浴10min；

2.2、若为体液，往1.5mL的EP管中加入200μl的体液和20μl的蛋白酶K，混匀；加200μl的AL，颠倒混匀，震荡30s，瞬时离心，56℃水浴10min；

2.3、加200μl无水乙醇，颠倒混匀60下，瞬时离心；

2.4、将EP管内的液体倒入装有离心管的柱子中，13200×g，离心1min，弃掉滤液和废液收集管；

2.5、将柱子放入新的废液收集管上，加500μl洗脱液AW1，13200×g，离心1min，弃掉滤液和废液收集管；

2.6、将柱子放入新的废液收集管上，加入500μl洗脱液AW2，13200×g，离心3min，弃掉滤液和废液收集管；

2.7、将柱子放入新的废液收集管上，空离心1min，弃掉滤液和废液收集管；

2.8、将柱子放在新的1.5mL的EP管中，加入80μl的DNA溶剂AE，室温静置5min，13200×g，离心1min，收集EP管内DNA溶液；

2.9、基因组DNA质控检测(包括浓度、完整性和纯度)合格后(操作如下)，4℃短暂保存或-70℃长期保存基因组DNA。

(1)使用QubitFluorometer检测DNA浓度，其中OD值在1.8～2.0之间，要求DNA测定浓度>20ng/μl，总量>1μg；

(2)1.5％琼脂糖凝胶电泳(AgaroseGelElectrophoresis)质控合格：配制1.5％琼脂糖(TSJ001，擎科生物)凝胶：称取1.5g琼脂糖于500ml锥形瓶中，加入100ml的1×TAE缓冲液(TSG001，擎科生物)，微波炉大火加热3min，冷却到55℃左右，加4μl滴核酸染料(TSJ003，擎科生物)，轻柔混匀后，倒入事先安好梳子的模具槽中，室温冷却凝固成型。取1μl基因组DNA与1×loading、buffer混匀后进行上样，220V电泳10min，成像拍摄，要求DNA条带单一且不弥散。

3、文库构建和全基因组外显子测序

3.1、取患者基因组gDNA共计1000ng，按照Illumina标准建库流程进行测序文库的构建。

本发明应用安捷伦V6捕获芯片对基因组全部基因外显子及其侧翼序列进行捕获。通过将样品DNA片段化、磁珠筛选、文库纯化、末端修饰、A尾添加、接头连接和PCR富集过程，构建基因组外显子区域的DNA测序文库。检测文库的片段大小及浓度使其达到可上机测序的条件，以便完成后续对基因组DNA的序列测定。

3.2、上机测序：将捕获后的样品使用对Illumina、Miseq和/或X-ten高通量测序平台进行上机测序。

4、突变信息注释和致病性分析

4.1、数据分析：利用trimmomatic软件对Illumina测序仪器产生的原始下机数据rawdata去除接头序列，得到cleandata；

4.2、随后应用比对和分析软件工具BWA(Burrow-Wheeler-Aligne)、HaplotypeCaller和GATK+SAMtools等将读段与人类参考基因组序列比对(GRCh37)，对SNP和InDel进行识别分析(数据质量平均测序深度达到100×以上，即视为合格)；

4.3、变异筛选及疾病相关性的预测：使用ANNOVAR对发现的基因变异(包括单核苷酸变异、小插入或缺失等)进行的有害性、数据库记载频率、相关记载和基因功能表型进行注释；

4.4、对全外测序的注释结果进行本项目的候选致病基因突变进行筛选过滤，候选基因包括：

1)人类在线孟德尔数据库OMIM(https://omim.org/)有记载的，导致特发性男性不育相关疾病(包括生精障碍导致的无精子症和少弱精子症、和原发性纤毛运动障碍等)的基因；

2)本项目前期研究发现的可以导致男性不育的全新致病基因；

3)经评估后的NCBI、Pubmed英文文献检索数据库中能检索到的最新发表的导致男性不育的新的致病基因。

表1、人类男性不育候选基因列表

4.5、突变致病性分析

候选致病基因突变的筛选策略如下：

1)过滤掉人群公共遗传突变数据库(1000、Genomes、GnomAD以及GnomAD-EAS数据库)中频率大于1％的突变；

2)选取生物信息学软件预测(Mutation、taster、SIFT、PloyPhen-2和CADD)为可能致病的突变；

3)隐性遗传模式基因优先考虑纯合突变或复合杂合突变。

5、PCR-Sanger测序和家系分析

对发现的候选基因突变位点进行针对性的引物设计，将患者、其父母及同胞的基因组DNA进行PCR-Sanger测序验证。

以弱畸形精子症患者T00550存在的DNHD1基因c.8782C>T(p.Arg2928*)纯合突变为例。

所用的正反引物序列分别为：

DNHD1-25F(SEQ ID No.1)：5′-AACTGAAGTTGAGCCCCCAC-3′，

DNHD1-25R(SEQ ID No.2)：5′-TGGCCAAGACAGCGTAAGAG-3′。

表2、DNHD1基因PCR扩增体系

PCR扩增反应条件如下：95℃预变性5min后，94℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸、45s，共34个循环，最后72℃延伸5min，PCR扩增产物放置于4℃保存。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定扩增的目的条带无误后，将剩余的PCR扩增产物送至擎科生物科技有限公司(北京，中国)进行Sanger法测序。

测序结果应用contig1和Chromas软件进行拼接，结果显示患者是真实存在的突变后，分析其父母和同胞的测序拼接结果，若结果符合基因型和表型共分离，即可得出所检测到的基因突变为患者致病基因突变。

目前已经对临床上600例特发性男性不育患者进行基因检测和遗传病因诊断，(包括无精子症和少弱/畸形精子症患者)。这些患者已经排除有毒物接触史，免疫系统疾病，感染类疾病，生殖道畸形，染色体异常和Y染色体AZF区域微缺失。

获取这些患者的基因组DNA(外周血)，取质控合格的样品进行基因组全外显子测序检测。通过应用本发明的分析流程，对本项目入选的候选基因进行过滤、致病性分析和家系分析，在多个不相关的家系中发现多个导致原发性男性不育的基因突变，取得一系列有原创性的成果。

经过前期大量的检测和分析，对不同的患者人群进行大样品检测，统计其检出阳性率，最终确定了需要进行检测的患者群体和适应证，即：特发性无精子症患者；特发性严重少精子症患者(精子浓度≤5×10

以下面患者为例子，展示我们的部分成果：

我们收集了2个由于弱畸形导致男性不育的患者，通过对患者进行全基因组外显子检测，发现第一个患者存在DNHD1复合杂合突变(c.5560C>T、(p.Arg1854Cys)和c.6498T>G、(p.Tyr2166*))，其父母分别为杂合突变。第二个患者存在DNHD1纯合突变(c.8782C>T、(p.Arg2928*))，其父母为杂合突变。家系分析符合基因型和表型共分离，且进一步的基因敲除小鼠表现出弱畸形精子症和雄性不育，进一步证实了DNHD1为导致弱畸形精子症和男性不育的全新致病基因。为后续患者的遗传咨询及生殖干预提供了依据。

图2为2个弱畸形精子症导致的男性不育家系图及DNHD1突变测序分析。家系图中，方框表示男性，圆形表示女性，横线表示夫妻关系，竖线表示子女关系，实心表示患者，箭头表示先证者(患者)。第一个家系的患者(F1-II-1)存在DNHD1复合杂合突变(c.5560C>T(p.Arg1854Cys)和c.6498T>G(p.Tyr2166*))，其父母(F1-I-1和F1-I-2)分别为杂合突变。第二个家系的患者(F2-II-2)存在DNHD1纯合突变(c.8782C>T(p.Arg2928*))，其父母(F2-I-1和F2-I-2)为杂合突变。

表3、患者DNHD1基因突变详细信息

表4、PCR-Sanger扩增及测序引物序列和扩增条件

F：正向引物，R：反向引物。

表5、全基因组外显子测序质量表

表6、男性不育致病基因信息表

AD：常染色体显性遗传；AR：常染色体隐性遗传；XL：X染色体连锁遗传；YL：Y染色体连锁遗传。

表7、基因突变PCR-Sanger扩增及测序引物

F：正向引物，R：反向引物。

以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

序列表

<110> 中信湘雅生殖与遗传专科医院有限公司

<120> 检测男性不孕不育的基因文库的构建方法和试剂盒

<160> 326

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

aactgaagtt gagcccccac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

tggccaagac agcgtaagag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

gcttcccgaa acacaagcac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 4

tccaccacca atggcttcat 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 5

tgcagccggt cagtgtaac 19

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 6

aggctccagc tatatacccc a 21

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 7

tctgcctggt cctcagca 18

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 8

ggcagacagc gactcgt 17

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 9

tgtgctatgg tgccccg 17

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 10

ccgacacaga ggcacagg 18

<210> 11

<211> 16

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 11

ctccctgcga gtggcg 16

<210> 12

<211> 16

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 12

gagcagggca gggtcc 16

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 13

ctagggctgg cagaatttag ga 22

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 14

ctgcactacc cttacctcga c 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 15

agcaggcgag tggataaacc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 16

gaagggcgtg cctacattct 20

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 17

ctggtcccaa ccttgcgt 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 18

cctctccagc ctgcgttc 18

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 19

agaactgttg ccctgcacc 19

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 20

gactgtcgca cgatgttgat 20

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 21

ctcgtgtgcg tttcgtgtc 19

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 22

aaatcttcag ccgggaacgc 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 23

aaatcttcag ccgggaacgc 20

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 24

gccaataaca atgcccctta gc 22

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 25

aggcctggct ttcattctcc 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 26

tgaggcctct ctcttcccaa 20

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 27

cagaaggcct ggtgggtg 18

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 28

caggtggttc ccaggctc 18

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 29

cgaaccgccc tcactttttg 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 30

cggctcccaa ccctctttta 20

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 31

gaccaagaac cagtaaacag aataa 25

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 32

gagacaggac tgacagctaa a 21

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 33

gtcccccggt tttgagagg 19

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 34

gaactcgcgg acgtgtagg 19

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 35

gtgggtgtct gaactgaggg 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 36

tcaagactgc tgcccctttc 20

<210> 37

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 37

ggaaaccctg tcgtgcgt 18

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 38

cttctcacgt gggctaaggg 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 39

cgacgccatg tttcaagggc 20

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 40

gcgggtcact gatcgttcc 19

<210> 41

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 41

cgccaccgtg ggaaactat 19

<210> 42

<211> 16

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 42

tgcgcactcg acgctg 16

<210> 43

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 43

cgacgtcact ccgtctcg 18

<210> 44

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 44

gacctcggtc ccgtacttc 19

<210> 45

<211> 16

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 45

ttgcccgcag tgagcc 16

<210> 46

<211> 17

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 46

cctgaggact ggcccga 17

<210> 47

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 47

aggcccgcac accctatt 18

<210> 48

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 48

ggccttgttc ccatctcc 18

<210> 49

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 49

tgctgttgaa aaatgggatg gc 22

<210> 50

<211> 24

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 50

tactttcagg tttttccacg gact 24

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 51

ggcgcttcta ttcgagaggg 20

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 52

ctgaagaaaa ggttccgccc 20

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 53

cttactgcct gccttccaca 20

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 54

gtcccctgga gtgaggagat 20

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 55

gctttagtgg cctagcgtga 20

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 56

ttgagagcga cgagcagttc 20

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 57

ctgaccgtcc cccttttctg 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 58

aagctaggca ggccatgaag 20

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 59

ctgctgtgtt cctgaggctt 20

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 60

tcatctgcca cattccccac 20

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 61

gaagatccca tccgaacggt 20

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 62

aggaatccac aaggcgtgat 20

<210> 63

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 63

ggagcggcgt gactcaaa 18

<210> 64

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 64

gcgggaacgt acaagacacg 20

<210> 65

<211> 36

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 65

gagagtgaag aaaaaccatg ccattttttc tagaag 36

<210> 66

<211> 35

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 66

ggtttttctt cactctcatc tgacaattaa cttga 35

<210> 67

<211> 25

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 67

taattgcaca gaaagtatgc agtaa 25

<210> 68

<211> 23

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 68

tgctgttttc tctgtcacta cca 23

<210> 69

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 69

ggcaacctcc tcgtgttctt a 21

<210> 70

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 70

gatgttcagg cagctagaag tg 22

<210> 71

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 71

tttggctacc acaagccca 19

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 72

aagtgctttg tcttctgggg 20

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 73

ctttgaaagt agggcgcagc 20

<210> 74

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 74

agctaacacg gcgtgagg 18

<210> 75

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 75

gtggtgtgag ggggtttctg 20

<210> 76

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 76

aaggccctca cttacgaagc 20

<210> 77

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 77

ccatctccat ggttacgcgg 20

<210> 78

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 78

gtacgcctcc gggtcaag 18

<210> 79

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 79

cgtcgcgcct ttagcttctt t 21

<210> 80

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 80

aatcgtcagt aggagaggga ca 22

<210> 81

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 81

tagtctgtca gcaggaatg 19

<210> 82

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 82

aaagagtaga aatacaagca 20

<210> 83

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 83

ggcttggaga aggggcttt 19

<210> 84

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 84

ccagtgactc cagggacca 19

<210> 85

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 85

ccctgcagac ggagaaatag t 21

<210> 86

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 86

tcccgcacac actcagatta aa 22

<210> 87

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 87

atcctgagtc gtccgtggtc 20

<210> 88

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 88

ccgaggagca gcaaagcg 18

<210> 89

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 89

gggtacccaa cctatacgca 20

<210> 90

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 90

ctgatggtgg tgcaaccttt c 21

<210> 91

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 91

cctccgcgcc attttcaaac 20

<210> 92

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 92

ctctggctcc cacatccg 18

<210> 93

<211> 24

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 93

ctgcagtgag gaattaagtg tgtt 24

<210> 94

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 94

ctcttttcct ctgcagaccc c 21

<210> 95

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 95

acagtgcaga agttgaccaa g 21

<210> 96

<211> 24

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 96

ctgattaaaa gggataaacc ccac 24

<210> 97

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 97

aggagaaacg ggatgttttc g 21

<210> 98

<211> 17

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 98

tgctgccagt ggcgttc 17

<210> 99

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 99

agatgaggga ggaggtgtcc 20

<210> 100

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 100

aagcaagcct ggtgatcctc 20

<210> 101

<211> 23

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 101

atatgggtac ttgtgcagct gtg 23

<210> 102

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 102

ctctgtcacg gtgatctgca c 21

<210> 103

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 103

ctctgtttcc gtggagacgc t 21

<210> 104

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 104

aactccagtt ttccgttccg c 21

<210> 105

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 105

gttaggaggt ctctgtcggg 20

<210> 106

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 106

ggtgggtcag tctgtgctat c 21

<210> 107

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 107

tctcagccca gttaaagtcc a 21

<210> 108

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 108

agccaatggt cagagtggat g 21

<210> 109

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 109

aaccgctccc cttttcaact 20

<210> 110

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 110

agctacaaag cactgaacca ga 22

<210> 111

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 111

gccagaccaa cacgcaattt 20

<210> 112

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 112

ttgtagtcca ggccctcaga 20

<210> 113

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 113

aatgagtgaa cagagccgga g 21

<210> 114

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 114

aggtacgtgc atttgtccct 20

<210> 115

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 115

gagttccgag atggtacggc 20

<210> 116

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 116

gcacgcgttc aatgaggtag 20

<210> 117

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 117

tcacgtgtga cacctcactg 20

<210> 118

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 118

tgacaaagat ctgggccacc 20

<210> 119

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 119

atcattgtgc agcagaagcg 20

<210> 120

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 120

actaggccct gtgctcttga 20

<210> 121

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 121

gagtgcggat gcacagacc 19

<210> 122

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 122

gtggaaagga caggcgatca 20

<210> 123

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 123

gcttcaagag gtctccgtcc 20

<210> 124

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 124

tatacccagg tgtccccgtt 20

<210> 125

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 125

ccagaagagg gtgccttcaa 20

<210> 126

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 126

tattcccaaa ggtcctgccc 20

<210> 127

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 127

ggctctgagc aaaagagggt 20

<210> 128

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 128

atgacaaagg aggctcggtc 20

<210> 129

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 129

ccatcttgtg ccctgacagt 20

<210> 130

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 130

gtctgtccac cctctgaagc 20

<210> 131

<211> 23

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 131

ggaaggaaat tctgttgtgt gct 23

<210> 132

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 132

tggggatagg gtgtggctat aa 22

<210> 133

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 133

ctgaatgcga acaagggaga c 21

<210> 134

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 134

agatagggtt ccttgctgac g 21

<210> 135

<211> 24

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 135

tgaaaggaat aaacaggtga tgct 24

<210> 136

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 136

actctgaatg cccctcctaa c 21

<210> 137

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 137

ttagggcctg tcgcttcc 18

<210> 138

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 138

tcaaaaggcc agagtcgtcc 20

<210> 139

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 139

tctcaatgtg tcccccactg 20

<210> 140

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 140

cctgcccctc ccttgatttt 20

<210> 141

<211> 25

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 141

accattatga gctagctttc cttga 25

<210> 142

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 142

cctgatagtt gcagctcggt 20

<210> 143

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 143

gtcaaagatg gcacgctcag 20

<210> 144

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 144

aacgtcagac ccaagctcat 20

<210> 145

<211> 24

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 145

tccttgtagt caacctcttg tttg 24

<210> 146

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 146

aacctgtctc ttagtgcctc g 21

<210> 147

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 147

gagcttgagc tgggatggtc 20

<210> 148

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 148

cttgggtcaa cttcattgcg g 21

<210> 149

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 149

aaagtgctct ggctgttggc 20

<210> 150

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 150

gtcaaagatg gcacgctcag 20

<210> 151

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 151

gattggctgg aacgtgtact a 21

<210> 152

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 152

ggaattgatg tcactgcc 18

<210> 153

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 153

cacgcagtaa ccatcgagga 20

<210> 154

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 154

ggacgcggag gaaggtct 18

<210> 155

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 155

gtacttccac catgtgcagc 20

<210> 156

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 156

agagtgttag ggcccagcta 20

<210> 157

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 157

cccctggttc tacttgggga 20

<210> 158

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 158

cttccaggag ctgccttgtc 20

<210> 159

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 159

atacgggtgt acacagcagc 20

<210> 160

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 160

cttggggcag gaggttcc 18

<210> 161

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 161

cttgtgttaa caaccggccc 20

<210> 162

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 162

tcttcctgtc ctacagtgcg 20

<210> 163

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 163

aagcgagtgg cgctttcac 19

<210> 164

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 164

caccttcccg atgtttccgc 20

<210> 165

<211> 23

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 165

actctccaat tgtgtctgac agg 23

<210> 166

<211> 24

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 166

caccttttca ccgaaattcg tagt 24

<210> 167

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 167

caggagctct gtccagtgac 20

<210> 168

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 168

gcatcgtggc tgtcaggag 19

<210> 169

<211> 17

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 169

cggcgtcgtg gggttac 17

<210> 170

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 170

ggaatgagct tggcgaggg 19

<210> 171

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 171

gcgactggtg tagcctttct a 21

<210> 172

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 172

gtcactgtcc agccaagaga 20

<210> 173

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 173

cccagattct ccagttccca c 21

<210> 174

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 174

ccaccgcttc tgagcctatc 20

<210> 175

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 175

caatcctgcc tgtaccctcc 20

<210> 176

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 176

aaccttctgc acttcgcctc 20

<210> 177

<211> 25

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 177

catgaccatg ttttgatacc ttttc 25

<210> 178

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 178

tcttaccctg ttactgcaag gt 22

<210> 179

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 179

gcagcttctg tagttgggct a 21

<210> 180

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 180

gaaattgtag cggggaccct 20

<210> 181

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 181

tttcaggacc ctgtgaacgg 20

<210> 182

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 182

cttccctgcg tcctttctct 20

<210> 183

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 183

gtcagactga tcgcctttgg c 21

<210> 184

<211> 16

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 184

agcgccgccg gttctc 16

<210> 185

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 185

caggagaaac agccgaggac 20

<210> 186

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 186

ctggcttgac cgtcatcctt 20

<210> 187

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 187

ttgtgaccca attcccgcc 19

<210> 188

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 188

ggaagtgacg gggtccagaa at 22

<210> 189

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 189

ggaattgtta ccaggcgacc 20

<210> 190

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 190

tgaatgctgc ttggatctca gt 22

<210> 191

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 191

cccgtggaac aatgagctac t 21

<210> 192

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 192

gccagacctc agttagggac 20

<210> 193

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 193

accctagagc aacgtttggg 20

<210> 194

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 194

atgtaggaaa gaacggcccc 20

<210> 195

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 195

atagcgacct ggcatcagtc 20

<210> 196

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 196

ccatcggctg aaccagtcaa 20

<210> 197

<211> 24

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 197

tgtttggtga agtattgctt gctt 24

<210> 198

<211> 25

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 198

acaggcaaaa cctataaaga gctaa 25

<210> 199

<211> 24

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 199

gtgtatactg gaacaaatgc atgg 24

<210> 200

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 200

tcacactgcc gggacatatt 20

<210> 201

<211> 17

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 201

caatgggagc aggcggg 17

<210> 202

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 202

cacatcgtgg ctgcttctcg 20

<210> 203

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 203

tcatggccag tgtctgtctg 20

<210> 204

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 204

gaattccgga gtgcctgtca 20

<210> 205

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 205

aatggacaag tccctcttgc tg 22

<210> 206

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 206

acatacccct ggtagaaggc at 22

<210> 207

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 207

cgagccggaa gtggagtg 18

<210> 208

<211> 17

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 208

gctagggagg cctcgga 17

<210> 209

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 209

caaggggatc ccacgactca 20

<210> 210

<211> 17

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 210

ttcccgagcc gttgtgg 17

<210> 211

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 211

ctttgtgagg gggactgtac t 21

<210> 212

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 212

caggggtctg tgccgaatg 19

<210> 213

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 213

cccagcacag tcatggatca aa 22

<210> 214

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 214

tggtcgtgga agtcttggaa c 21

<210> 215

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 215

tactttgggg ttgaggtggc 20

<210> 216

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 216

cccatgacaa aggtttccca c 21

<210> 217

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 217

ctagcccagc acctcaactc 20

<210> 218

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 218

tgggggtttg catagggatg 20

<210> 219

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 219

tgggcatttt ggtatggggg 20

<210> 220

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 220

ccaggagtgg ggtggaaaag 20

<210> 221

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 221

ggacgagggg caacgtat 18

<210> 222

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 222

tacccaggtc aaagatgcgg 20

<210> 223

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 223

gggcgccttc tgtccaatta 20

<210> 224

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 224

ttacaggtac ctctggggcg 20

<210> 225

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 225

gaaaccgatg gggatcggaa 20

<210> 226

<211> 17

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 226

cgctgctgct ggcaaag 17

<210> 227

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 227

tatctgacct catgcagtgg c 21

<210> 228

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 228

caaacacagg acttcccctc a 21

<210> 229

<211> 23

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 229

atttaccatg gagatgaggt ggc 23

<210> 230

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 230

aatgcggcgt acaacaccaa 20

<210> 231

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 231

ccctggagac tagtcacact t 21

<210> 232

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 232

acccattgag gtacggagga 20

<210> 233

<211> 25

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 233

cctctagcaa gctcttctgt tactc 25

<210> 234

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 234

aacactgcat gggggagttc t 21

<210> 235

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 235

atcgacttcc tcagctccct 20

<210> 236

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 236

gaagactcct gccccatgtc 20

<210> 237

<211> 17

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 237

ctggctcagc ggtctcg 17

<210> 238

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 238

caccagctcc tagctcacag 20

<210> 239

<211> 16

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 239

cgtcacgtga acggcg 16

<210> 240

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 240

gacccagctc taggcagtc 19

<210> 241

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 241

cctgtttggc acaagagccg 20

<210> 242

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 242

agggtggttg ttggtgaact t 21

<210> 243

<211> 24

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 243

tttgttttcg atcgttaagt gggc 24

<210> 244

<211> 25

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 244

tagccacata tagaaagcac actac 25

<210> 245

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 245

agctcccaga gttcccatct 20

<210> 246

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 246

actgtaaagg gctgggcaaa 20

<210> 247

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 247

gcagggatcg cgcctagt 18

<210> 248

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 248

tggggcctta tgaccttcgg 20

<210> 249

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 249

taggcacagc tgtcaccaag 20

<210> 250

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 250

ggactttgct catgtctccc t 21

<210> 251

<211> 17

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 251

ggattggacg ggcgctt 17

<210> 252

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 252

cttgaaaggc caagccgaag 20

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 253

atttggtgag gattcactgg gt 22

<210> 254

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 254

cctttgaaca atggctacta cc 22

<210> 255

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 255

cggggtctgt gagttggac 19

<210> 256

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 256

ggacgaaaag aggggacgc 19

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 257

gagagcacga tggctactgg 20

<210> 258

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 258

cctcttctct ccctgtgcct 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 259

ccctgagtgg aaatctcggg 20

<210> 260

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 260

ccagcaatcc aagcccgta 19

<210> 261

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 261

ttgcgtagtg aaccgctgag 20

<210> 262

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 262

gaggtcctac aagacggagc 20

<210> 263

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 263

tttgcgacct gttcgagtcc 20

<210> 264

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 264

gaaggcgtag cagctctgg 19

<210> 265

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 265

gggaagcgtt gggctgtaaa 20

<210> 266

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 266

caatccagct ctgctgcac 19

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 267

cattggtcag ttgctcgctg 20

<210> 268

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 268

ctccaaatat cccgggacgc 20

<210> 269

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 269

gttctgcagg gcagtcctc 19

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 270

aatctagaat gaggatccag gct 23

<210> 271

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 271

gtaccgaatc acaaagctag ga 22

<210> 272

<211> 23

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 272

acctgttttg agtcatgtga tcc 23

<210> 273

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 273

ggctgatgcc agcgtttta 19

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 274

accctctttc ctgcatccac 20

<210> 275

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 275

cgattggcag tcgcgtagg 19

<210> 276

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 276

cctgatcctg aggggacaca 20

<210> 277

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 277

ctagcaacca gcctgaggtc 20

<210> 278

<211> 18

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 278

ccgcctccgg gcttctaa 18

<210> 279

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 279

aagcatggtc tcccttaggc 20

<210> 280

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 280

gaatcggggt gcagatgaga 20

<210> 281

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 281

gaatcggggt gcagatgaga 20

<210> 282

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 282

actaggagcg ctagtcctgg 20

<210> 283

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 283

tggcaactga agacatcccg 20

<210> 284

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 284

tcatctcaga tcccgccca 19

<210> 285

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 285

ccgttgctat gacagtacgc 20

<210> 286

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 286

aagccctttc tcaccaggag 20

<210> 287

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 287

atcccaggga gccgcaattc 20

<210> 288

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 288

tgctgattgg ctttttgctt ca 22

<210> 289

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 289

acctccttaa ggtgatgccc a 21

<210> 290

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 290

aagacctctt accactgaag gg 22

<210> 291

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 291

gacccagcag tctggttct 19

<210> 292

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 292

gataggaggg gagacaggca t 21

<210> 293

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 293

tctcctggac caacactaac tc 22

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 294

ggatggatgg atcaccactc agt 23

<210> 295

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 295

gctcggattg gtcgattcca 20

<210> 296

<211> 20

<212> DNA

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<400> 296

tttccccgtc ttgaggttcg 20

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<211> 25

<212> DNA

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<400> 297

cgtacttcct tgagattact acttg 25

<210> 298

<211> 24

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 298

atgcatatac cttagtctag ccgt 24

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<211> 21

<212> DNA

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<400> 299

tacagtctaa gggacgacac g 21

<210> 300

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 300

ctctactctt aggaggactg cg 22

<210> 301

<211> 20

<212> DNA

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<400> 301

gaacgtgaag aacgtggtgc 20

<210> 302

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 302

cagagcccct caccatctg 19

<210> 303

<211> 17

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 303

aattccgacg gggacgc 17

<210> 304

<211> 17

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 304

gaaccgacag cgcaggg 17

<210> 305

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 305

cgcctggata gtcacgcat 19

<210> 306

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 306

gctgccagct gtaatcgcta 20

<210> 307

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 307

ttcccgcgta cacctcctac 20

<210> 308

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 308

tgcctatcac tccgcctctt 20

<210> 309

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 309

tgtttggcat ctttcaccag t 21

<210> 310

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 310

tcagactaat gacttgccct ct 22

<210> 311

<211> 25

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 311

ccagtggttt caaagtgaat ctgtt 25

<210> 312

<211> 23

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

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acctctcacc aagccatttt tcc 23

<210> 313

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 313

ggacaactgg cctttattgg ag 22

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 314

aagctaaagc cagaggcaga ata 23

<210> 315

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 315

tcaaacgtaa gggactgaca ga 22

<210> 316

<211> 21

<212> DNA

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<400> 316

agccctgaac agacctctca t 21

<210> 317

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 317

catggtgggg tgtgttttgt aa 22

<210> 318

<211> 22

<212> DNA

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<400> 318

tggttaaaca agttaggtgg gc 22

<210> 319

<211> 19

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 319

cagggcctcc gtttccttg 19

<210> 320

<211> 21

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 320

aaggccattg aggtaaatgc t 21

<210> 321

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<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 321

tgcttttaga atctgaacgg aaaa 24

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 322

acattcctca ttcctcgcgt 20

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 323

ggagagtggc ttcttcccat tt 22

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<212> DNA

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agaaaagttt ctaacgaggt tcctg 25

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<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 325

aggagtaagc tcaaagcggc 20

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<211> 20

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<400> 326

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