一种异环磷酰胺原料药中起始物料、杂质D、杂质F的检测方法

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种异环磷酰胺原料药中起始物料、杂质D、杂质F的检测方法。

背景技术

异环磷酰胺(Ifosfamide)属于氮芥类烷化剂，也是一种潜活化药物，在体外无抗肿瘤活性，需进入人体内先经肝中微粒体功能氧化酶转化为醛磷酰胺，醛磷酰胺在肿瘤内分解成磷酰胺氮芥及丙烯醛，磷酰胺氮芥显现出药理活性作用。在原料药生产中可能会带入一些有关物质如起始原料、实际、中间体、副产物和异构体等物质，这类物质会降低疗效和影响稳定性，有的甚至对人体健康有害或产生其他不良反应。因此，对异环磷酰胺的有关杂质进行检测，控制药物的纯度以控制药物质量至关重要。目前，异环磷酰胺的分析检测大多数是基于液相色谱法和气相色谱法测定血液、尿液样本中异环磷酰胺及有机溶剂残留量，但尚未对异环磷酰胺原料药生产过程中有效成分及有关物质建立可靠的质量控制标准。因此本发明提供一种异环磷酰胺原料药中起始物料3-氨基丙醇、杂质D、杂质F的检测方法，该方法具有良好的精密度、线性关系和准确度，能够满足异环磷酰胺原料药中起始物料3-氨基丙醇、杂质D、杂质F的检测要求。

发明内容

本发明针对异环磷酰胺原料药中起始物料3-氨基丙醇、杂质D、杂质F的检测，提出了一种快速、便捷的气相色谱方法，有助于异环磷酰胺原料药中有关物质的质量标准的建立，该检测方法具有良好的精密度、线性关系和准确度等，能够满足异环磷酰胺原料药中有关物质的检测要求，具体技术方案如下：

一种异环磷酰胺原料药中起始物料、杂质D、杂质F的检测方法，是基于气相色谱法对溶液进行检测并记录，所述起始物料、杂质D、杂质F结构分别如式I、II、III所示：

进一步的，所述一种异环磷酰胺原料药中起始物料、杂质D、杂质F的检测方法步骤如下：

(1)配制空白溶液、对照品储备液、对照品溶液、供试品溶液，其中：

空白溶液：HPLC级甲醇作为稀释剂；

对照品储备液：精密称定异环磷酰胺起始物料3-氨基丙醇、杂质D、杂质F，分别置于10mL棕色容量瓶中，加稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得对照品储备液；

对照品溶液：精密量取对照品储备液，置于10mL棕色容量瓶中，加稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得对照品溶液；

供试品溶液：精密称定异环磷酰胺原料药，置于10mL棕色容量瓶中，加稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得供试品溶液；

(2)采用气相色谱法对上述空白溶液、对照品溶液、供试品溶液进行检测并记录色谱图。

进一步的，所述对照品储备液中精密称定100mg异环磷酰胺起始物料3-氨基丙醇、100mg杂质D、10mg杂质F制备获取10.0mg/mL起始物料3-氨基丙醇、10.0mg/mL杂质D、1.0mg/mL的杂质F对照品储备液。

进一步的，所述对照品溶液中精密量取0.1mL异环磷酰胺起始物料3-氨基丙醇、杂质D、杂质F对照品储备液，制备获取100.00μg/mL起始物料3-氨基丙醇、100.00μg/mL杂质D、10.00μg/mL杂质F的对照品溶液。

进一步的，所述供试品溶液中精密称定1.0g异环磷酰胺原料药，制备获取100.0mg/mL异环磷酰胺的供试品溶液。

进一步的，所述色谱柱：HP-5 30m×320μm×0.25μm，检测器：FID，流速：2mL/min；分流比：5:1，进样体积：1μL，运行时间：36min，柱温：程序升温：50℃，5℃/min，保持2min→180℃，20℃/min，保持1min→260℃，保持3min，进样口温度：380℃；检测器温度：380℃。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：

本发明本申请提供的异环磷酰胺原料药中起始物料3-氨基丙醇、杂质D、杂质F的检测方法，实现了对异环磷酰胺中3-氨基丙醇、杂质D、杂质F的定性和定量分析，该方法专属性强、线性关系良好以及精密度良好，能够快速、准确地对异环磷酰胺原料药中起始物料、杂质D、杂质F进行检测，整个过程操作可靠、可控，适合实际应用和推广，具有广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例技术描述中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为空白溶液的气相色谱图。

图2为起始物料和杂质D的气相色谱图。

图3为杂质F的气相色谱图。

图4为供试品溶液的气相色谱图。

图5为起始物料的线性回归图。

图6为杂质D的线性回归图。

图7为杂质F的线性回归图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

一种异环磷酰胺原料药中起始物料、杂质D、杂质F的检测方法，是基于气相色谱法对溶液进行检测并记录，所述起始物料、杂质D、杂质F结构分别如式I、II、III所示：

作为优选方案，所述一种异环磷酰胺原料药中起始物料、杂质D、杂质F的检测方法步骤如下：

(1)配制空白溶液、对照品储备液、对照品溶液、供试品溶液，其中：

空白溶液：HPLC级甲醇作为稀释剂；

对照品储备液：精密称定100mg异环磷酰胺起始物料3-氨基丙醇、100mg杂质D、10mg杂质F，分别置于10mL棕色容量瓶中，加稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得10.0mg/mL起始物料3-氨基丙醇、10.0mg/mL杂质D、1.0mg/mL的杂质F对照品储备液；

对照品溶液：精密量取对照品储备液中0.1mL异环磷酰胺起始物料3-氨基丙醇、杂质D、杂质F对照品储备液，置于10mL棕色容量瓶中，加稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得100.00μg/mL起始物料3-氨基丙醇、100.00μg/mL杂质D、10.00μg/mL杂质F的对照品溶液；

供试品溶液：精密称定1.0g异环磷酰胺原料药，置于10mL棕色容量瓶中，加稀释剂稀释定容至刻度，摇匀制得100.0mg/mL异环磷酰胺的供试品溶液。

(2)采用气相色谱法对上述空白溶液、对照品溶液、供试品溶液进行检测并记录色谱图，所述色谱柱：HP-5 30m×320μm×0.25μm，检测器：FID，流速：2mL/min；分流比：5:1，进样体积：1μL，运行时间：36min，柱温：程序升温：50℃，5℃/min，保持2min→180℃，20℃/min，保持1min→260℃，保持3min，进样口温度：380℃；检测器温度：380℃。

实施例1：

一、溶液的配制：

(1)配制空白溶液：HPLC级甲醇作为稀释剂；

(2)对照品储备液：取异环磷酰胺杂质起始物料3-氨基丙醇、杂质D对照品100mg，杂质F对照品10mg，精密称定，分别置于10mL容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，混匀，即得起始物料和杂质D浓度为10.0mg/mL、杂质F浓度为1.0mg/mL的对照品储备液；

(3)对照品溶液：精密量取各杂质对照品储备液0.1mL，分别置于10mL容量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，混匀，即得起始物料和杂质D浓度为100.00μg/mL、杂质F浓度为10.00μg/mL的各杂质对照品溶液；

(4)供试品溶液：取异环磷酰胺原料药1.0g，精密称定，置于10mL容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，混匀，制得异环磷酰胺浓度为100.0mg/mL的供试品溶液。

二、气相色谱法检测：

采用气相色谱法对空白溶液、对照品溶液、供试品溶液进行检测，记录色谱图，其色谱图分别为图1-4所示。上述气相色谱条件为：色谱柱：HP-5 30m×320μm×0.25μm；检测器：FID；流速：2mL/min；分流比：5:1；进样体积：1μL；运行时间：36min；柱温：程序升温(50℃，5℃/min，保持2min→180℃，20℃/min，保持1min→260℃，保持3min)；进样口温度：380℃；检测器温度：380℃。

如图1-4所示，空白溶剂对检测物干扰作用，各成分色谱峰之间分离度均大于1.5，表明本发明方法的专属性良好。

实施例2：

一、定量限：

将实施例1制备的杂质F浓度为1.0mg/mL、起始物料3-氨基丙醇和杂质D浓度为10.0mg/mL的对照品储备液采用稀释剂逐级定量稀释，然后采用气相色谱法进行检测，气相色谱具体条件如实施例1所述，记录色谱图，按信噪比不得低于10：1，得到定量限，结果见表1。

表1

从表1可以看出，定量限溶液中，起始物料、杂质D、杂质F色谱峰S/N均大于10；起始物料、杂质D、杂质F保留时间RSD均≤2.0％；起始物料、杂质D、杂质F峰面积RSD均≤15％。

二、线性关系：

将实施例1制备的杂质F浓度为1.0mg/mL、起始物料和杂质D浓度为10.0mg/mL的对照品储备液采用稀释剂稀释，制备得到不同浓度的线性溶液。

将上述制备的线性溶液采用气相色谱法进行检测，气相色谱的条件如实施例1，记录色谱图。以各组分浓度为X轴，响应为Y轴绘制线性曲线，计算相关系数R，斜率和线性方程，结果见表2，线性图如图5-7所示。

表2

从表2可以看出，起始物料在39.80μg/mL～199.00μg/mL范围内(相当于供试品溶液的0.04％～0.2％，相当于起始物料限度浓度的40％～200％)线性方程为y＝3.1581x-108.55，相关系数为0.9991，＞0.990；杂质D在39.48μg/mL～197.40μg/mL范围内(相当于供试品溶液的0.04％～0.2％，相当于起始物料限度浓度的40％～200％)，线性方程为y＝3.5951x-45.912，相关系数为0.9997，＞0.990；杂质F在2μg/mL～20μg/mL范围内(相当于供试品溶液的0.02％～0.2％，相当于起始物料限度浓度的20％～200％)，线性方程为y＝18.762x+5.4378，相关系数为0.9999，＞0.990。表明本发明申请的检测方法线性关系良好。

三、精密度：

平行配制6份100％浓度的起始物料、杂质F的对照品溶液以及100％加标供试品溶液，按照实施例1所述异环磷酰胺原料药中起始物料以及杂质D、杂质F的检测方法，采用气相色谱法进行检测，气相色谱的具体条件如实施例1所述，结果如表3所示。

表3

从表3中可以看出，起始物料峰面积RSD为7.4％；杂质D峰面积RSD为7.0％；杂质F峰面积RSD为7.9％，表明本发明的检测方法精密度良好。

四、准确度：

起始物料、杂质D、杂质F的准确度试验以回收率(％)表示。

杂质D100％加标供试品溶液的配制：取异环磷酰胺约1.0g，精密称定，精密量取0.1mL杂质D对照品储备液，置于同一10mL容量瓶中，加稀释剂稀释定容至刻度，摇匀，制得异环磷酰胺为0.1g/mL，杂质D100μg/mL的加标供试品溶液。

取杂质D100％加标供试品溶液和起始物料、杂质F的对照品溶液，按照实施例1所述异环磷酰胺原料药中起始物料以及杂质D、杂质F的检测方法，采用高气相色谱法进行检测，气相色谱的具体条件如实施例1所述，结果如表4所示。

表4

从表4可以看出，起始物料回收率在90.09％～103.31％范围内，RSD为4.8％，＜10％；杂质D回收率在92.95％～98.26％范围内，RSD为2.3％，＜10％；杂质F回收率在95.95％～115.90％范围内，RSD为7.2％，＜10％，表4表明本发明申请的检测方法准确度良好。

五、溶液稳定性：

起始物料、杂质D、杂质F溶液稳定性：取对照品溶液，分别于室温下放置不同时间后测定，计算起始物料、杂质D、杂质F的色谱峰面积的RSD，结果见表5。

表5

从表5可以看出，起始物料、杂质D在8h内稳定，杂质F在9h内稳定。表明本发明申请的检测方法溶液稳定性较好。

实施例3：

一、样品测定：

按照实施例1提供的异环磷酰胺原料药中起始物料以及杂质D、杂质F的检测方法，检测3批异环磷酰胺原料药样品中的起始物料以及杂质D、杂质F的含量，结果见表6：

表6

从表6中可以看出，3批异环磷酰胺原料药中杂质D均有检出，起始物料和杂质F未检出。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。