一种提高奶牛配种受胎率的卵泡发育处理方法

技术领域

本发明涉及奶牛繁殖技术领域，提供一种用免疫抑制素重组蛋白结合孕酮阴道栓(CIDR)-同期发情处理(Ovsynch)(CIDR-Ovsynch)提高奶牛受胎率的方法。

背景技术

近年来，伴随着产奶量的稳步上升，奶牛机体负荷增加，代谢旺盛，生殖激素代谢消耗加快，影响到卵巢发育和功能，使经产母牛繁殖性能逐年下降。此外，环境不利因素，如夏季高温热应激和养殖环境细菌超标等，均可影响下丘脑-垂体-性腺轴造成奶牛内分泌机能紊乱，抑制卵泡发育，降低奶牛发情和配种受胎率，从而降低奶牛繁殖性能。目前，生产上多采用PMSG、GnRH、PGF2α等药物处理调控发情和排卵周期，即Ovsynch技术。然而常规Ovsynch技术只能实现同期发情和排卵，不能控提高卵子质量(如卵子成熟率)和配种后形成的胚胎的质量(如胚胎卵裂率、囊胚率、胚胎等级等)。

抑制素是调控卵泡发育的重要因子。排卵前优势卵泡的颗粒细胞分泌大量的抑制素，一方面通过负反馈作用抑制垂体FSH的分泌，也可通过旁分泌和自分泌的方式拮抗活化素(activin)对卵泡颗粒细胞增殖和功能的促进作用，抑制小卵泡的发育。通过主动或被动免疫抑制素中和内源性抑制素的生物活性，可促进垂体FSH的分泌、强化activin的生物活性进而促进卵泡发育，提高配种后胚胎质量。基于免疫抑制素的方法，专利CN201010618516.4公开了将猪抑制素重组融合蛋白油乳剂疫苗在促进母猪发情和提高产仔数方面的应用，专利CN104012466A则公布了免疫抑制素与Ovsynch/TAI技术结合提高奶牛受胎率的方法。然而，抑制素同时促进卵泡膜粒细胞雄烯二酮分泌，而雄烯二酮是颗粒细胞合成E2的底物，因此，免疫抑制素会抑制卵泡膜细胞雄烯二酮的合成，导致这些现有方法不能完全发挥免疫抑制素促进颗粒细胞的E2合成和卵泡发育，以及后续提高奶牛受胎率的作用。

在生产中，补充P4可以轻微的提高奶牛受胎率，例如：(1)通过双同期技术(Double-ovsych,DO)在第一个同步发情周期诱导的1至2个黄体可以分泌P4，促进第二个同步发情周期中的卵泡发育，进而提高奶牛受胎率；(2)通过CIDR-Ovsych技术同期发情，CIDR也能缓释P4进入血液,进而轻微提高奶牛受胎率。上述DO和CIDR-Ovsych技术轻微提高奶牛受胎率的原理是，在卵泡期补充P4可为卵泡膜细胞提供合成雄烯二酮的底物，促进卵泡膜细胞功能，促进卵泡的发育。相比于CIDR-Ovsych在Ovsych处理开始时埋置CIDR、在7天后撤除CIDR的简单操作，DO技术需要在为期25天的时间内开展6轮次的同期发情药物注射，费时费力增加成本，进而限制了该方法在生产中的应用。

发明内容

针对目前经产奶牛受胎率下降，以及环境不利因素，如热应激和养殖环境细菌超标等，造成的奶牛受胎率下降问题，本发明提供一种提高奶牛配种受胎率的卵泡发育处理方法，可显著提高奶牛受胎率，提高奶牛繁殖性能。

具体而言，上述发明的目的是通过如下技术方案实现的：

一种提高奶牛配种受胎率的卵泡发育处理方法，包括免疫抑制素技术和CIDR-Ovsynch技术，即对母牛(优选母奶牛)开始Ovsynch处理的同时，于阴道置入孕酮阴道栓(CIDR)处理7天，同时按1ml/头的剂量注射抑制素重组融合蛋白油乳剂疫苗(1-1.5mg/mL蛋白)，具体而言，步骤为：

A)Ovsynch处理

首次注射：对母牛肌肉注射100μg GnRH，首次注射日即视为开始进行Ovsynch处理；

自开始进行Ovsynch处理后第7天，对母牛肌肉注射0.3mg氯前列烯醇；

自开始进行Ovsynch处理后第9天，对母牛肌肉注射100μg GnRH,然后于注射后18-20小时内进行人工授精；

本步骤涉及的Ovsynch处理方法为本领域常规方法，如专利CN 104012466 A中所公开的处理方式。

B)在步骤A)母牛开始进行Ovsynch处理的同时进行肌肉注射1mL抑制素重组融合蛋白油乳剂疫苗；

该抑制素重组融合蛋白油乳剂疫苗和对照疫苗制备方式同样为本领域常规疫苗，本发明实施例依照专利CN201010618516.4实施例1制备猪抑制素疫苗，疫苗中猪抑制素重组融合蛋白的浓度为1-1.5mg/mL，使用时1mL/头；

C)在步骤A)母牛开始进行Ovsynch处理的同时埋置CIDR，处理7天后撤除；

D)在步骤A)母牛开始进行Ovsynch处理后的第45天进行B超妊娠诊断，统计母牛受胎率。

本申请在对奶牛免疫抑制素的同时，结合简单可行的促进卵泡膜细胞功能的技术措施，即CIDR-Ovsych处理，免疫抑制素可以促进奶牛卵泡发育、提高卵子质量、提高胚胎质量，结合CIDR-Ovsynch方法可以实现同期发情和排卵，并且解决免疫抑制素对卵泡膜细胞功能的抑制问题，促进卵泡发育，进一步提高卵子质量和配种后胚胎质量，最终大幅提高母牛配种受胎率，降养殖成本，易于推广应用。

附图说明

图1为本申请实施例重组抑制素融合蛋白免疫结合CIDR-Ovsynch技术对奶牛处理方法流程示意图。

图2为实施例试验组和对照组处理后0-40天抗体效价，以及血液雄烯二酮、FSH、Activin、E2和P4等激素水平检测结果示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围：

实施例中涉及的试剂来源：

抑制素重组融合蛋白油乳剂疫苗(实施例中简称为“抑制素疫苗”)为根据中国专利CN201010618516.4实施例1公开方法制备的猪免疫抑制素疫苗，疫苗中猪抑制素重组融合蛋白的浓度为1mg/mL(在具体实施中，该蛋白浓度在1-1.5mg/mL范围内，均可实现发明目的)。

生理盐水油乳剂疫苗(实施例中简称为“对照疫苗”)则是在依照中国专利CN201010618516.4实施例1公开方法制备中猪免疫抑制素疫苗时，将抑制素重组蛋白替换成同等体积的生理盐水获得。

GnRH和氯前列烯醇购于宁波三生药业有限公司。

CIDR(商品名为赛得宝，货号CIDR-1380)购于硕腾。

实施例1

试验地点和分组：在位于广州和东营的两个牧场，于夏季对生产性能正常的荷斯坦奶牛进行免疫抑制素和CIDR-Ovsynch处理。其中东营牧场雌性奶牛32头，分为试验组17头、对照组15头；广州牧场雌性奶牛119头，分为试验组62头，对照组25头。

本实施例中，试验组流程图如图1所示，具试验方法如下：

试验第1天试验组和对照组每头奶牛均首次肌肉100μg GnRH、同时埋置CIDR；同时，试验组每头奶牛肌肉注射1mL抑制素疫苗；对照组每头奶牛肌肉注射1mL对照疫苗。

自首次GnRH注射后第7天每头奶牛肌肉注射0.3mg氯前列烯醇，间隔48h后(即自首次注射日起第9天)第二次每头奶牛肌肉注射100μg GnRH。在第二次注射完成后的18-20h内，对发情的牛进行人工输精，若超过24h奶牛仍未有发情表现，应对剩余未发情的试验牛进行定时人工输精。

在配种后35天检测牛受胎情况。从试验(首次注射GnRH)第1天开始，连续采集血液，分离血浆测定抗体效价和激素浓度等指标。

试验结果：

1、受胎率统计如下表1所示：

表1免疫抑制素和CIDR-Ovsynch处理对夏季经产奶牛配种受胎率的影响

a，受胎率是指每组的妊娠母牛数/每组的奶牛总数×100％；

b,提高受胎率是指(试验组受胎率-对照组受胎率)/对照组受胎率×100％

**表示差异极显著。

由表1可见，东营牧场试验组为受胎率为64.7％，对照组的受胎率为26.7％，受胎率提高142％；广州牧场试验组受胎率为43.9％，对照组为8.1％，受胎率提高442％。结果表明，在夏季免疫抑制素能够大幅提高奶牛的受胎率。

图2为试验组和对照组免疫抑制素CIDR-Ovsynch处理检测结果，其中A-F分别为奶牛血液中抗抑制素抗体效价、FSH、Activin、雄烯二酮、E2和P4检测结果示意图。图2中，“●”和“▇”对应的线条分别代表试验组和对照组；图2F中“●”和“▇”对应的虚线代表试验组和对照组的空怀母牛；“↓”代表试验第1和9天注射GnRH，“▼”代表试验第7天注射PGF2α，“★”代表注射抑制素疫苗或对照疫苗。*和**表示差异显著和差异极显著，图2F中§和§§表示试验组和对照组未受胎母牛之间P4差异显著和差异极显著。

由图2可见，免疫组抗抑制素抗体效价在第6天开始显著上升，对应的FSH和activin开始显著上升，E2则在第10天排卵时达到顶峰，也显著高于对照组。值得注意的是，雄烯二酮水平在第6天开始显著低于对照组，说明免疫抑制素的确会抑制卵泡膜细胞功能，因此有必要在免疫抑制素后通过CIDR缓释P4为膜细胞合成雄烯二酮提供底物，间接促进卵泡膜细胞功能。

实施例2免疫抑制素和CIDR-Ovsynch处理对春季经产奶牛配种受胎率的影响

试验地点和分组：在山东东营、于春季对对生产性能正常的荷斯坦奶牛进行免疫抑制素和CIDR-Ovsynch处理，试验组45头，对照组43头。

试验方法：试验开展于2020年4月，山东东营。方法同实施例1。统计受胎率，不采集血液测定血液指标。

试验结果如下表2所示：

表2免疫抑制素和CIDR-Ovsynch处理对春季经产奶牛配种受胎率的影响

a，受胎率是指每组的妊娠母牛数/每组的奶牛总数×100％；

b,提高受胎率是指(试验组受胎率-对照组受胎率)/对照组受胎率×100％

*，表示差异显著。

由表2可见，在春季，对照组的受胎率达到44.2％，免疫抑制素后受胎率可以进一步提高60.8％至71.1％。结果表明，在对照组受胎率较高的春季，免疫抑制素也能够显著提高奶牛的受胎率。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。