海风藤及其制剂的检测方法和质量控制方法

技术领域

本发明涉及中药检测技术领域，具体涉及海风藤及其制剂的检测方法和质量控制方法。

背景技术

海风藤为胡椒科植物海风藤Piper kadsura(Choisy)Ohwi的干燥藤茎，气辛，味苦，有祛风湿，通经络，止痹痛的功效，用于风寒湿痹，肢节疼痛，筋脉拘挛，屈伸不利。

《中国药典》(2020年版)收载有海风藤药材质量标准，但未对其有效成分及含量进行规定，仅以性状和浸出物作为质量检测项目，性状鉴别一方面依赖经验，具有一定的主观性，另一方面配方颗粒经过煎煮、浓缩、制粒等过程，已失去外观性状这一特点，而浸出物不能体现药材的专属性。

有文献采用气相色谱法测定海风藤中的挥发油成分，但海风藤临床用药多采用汤剂的形式，挥发油经煎煮后几乎无保留，因此挥发油测定不适用于海风藤配方颗粒的质量检测。也有学者以海风藤酮为检测指标对海风藤药材进行质量检测，但该方法需使用海风藤酮对照品作为外标对照，而海风藤酮对照品的获取难度较大，而且针对单一成分的质量控制存在一定片面性。亦有部分学者使用高效液相法建立海风藤药材指纹图谱，但是所用时间较长，为60分钟以上，导致检测效率较低，而且所得到的海风藤药材指纹图谱中无已知峰作为参照，无法对特征峰位置进行精准定位，导致检测结果精确度较差。此外，尚未见针对海风藤制剂，例如海风藤配方颗粒，进行质量检测的相关报道。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有海风藤药材质量检测方法得到的海风藤药材指纹图谱中无已知峰作为参照，无法对特征峰位置进行精准定位的缺陷，从而提供一种海风藤及其制剂的检测方法和质量控制方法。

为此，本发明提供了一种海风藤及其制剂的检测方法，采用超高效液相色谱法进行检测，检测时所采用的供试品溶液中添加有羌活醇。

可选的，所述供试品溶液的制备过程可以为：取供试品，加第一内标溶液，经提取、过滤后取液体；其中，所述第一内标溶液为含有羌活醇的溶液。

可选的，所述第一内标溶液为羌活醇与溶剂的混合液，所述溶剂为甲醇或者甲醇体积百分含量不小于50％的甲醇水溶液；所述第一内标溶液中的羌活醇的浓度为10～50μg/mL；所述提取为超声提取，超声功率为300W～500W，超声时间为20～40min；针对1g供试品，所述第一内标溶液的加入量为5～50mL。

可选的，所述供试品溶液的制备方法可以包括：取本品适量，研细，取0.5～5g，精密称定，加入第一内标溶液5～50mL，密塞，超声处理(功率300W，频率40kHz)20～40分钟，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

可选的，所述供试品溶液的制备过程还可以为：取供试品，加溶剂，提取，过滤后取液体，加第二内标溶液；其中，所述第二内标溶液为含有羌活醇的溶液。

可选的，所述第二内标溶液为羌活醇与溶剂的混合液，所述溶剂为甲醇或者甲醇体积百分含量不小于50％的甲醇水溶液；所述第二内标溶液中的羌活醇的浓度为10～500μg/mL；所述提取为超声提取，超声功率为300W～500W，超声时间为20～40min；针对1g供试品，溶剂的加入量为5～50mL，所述第二内标溶液的加入量为0.5～10mL。

可选的，所述供试品溶液的制备方法还可以包括：取本品适量，研细，取0.5～5g，精密称定，加入溶剂5～50mL，密塞，超声处理(功率300W，频率40kHz)20～40分钟，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，加入第二内标溶液0.5～10mL，摇匀，作为供试品溶液。

可选的，所述超高效液相色谱法的检测条件包括如下条件中的至少一项：

1)以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0～0.04min，流动相中乙腈的体积百分比为35％；0.04～2min，流动相中乙腈的体积百分比为35％→40％；2～3min，流动相中乙腈的体积百分比为40％；3～9min，流动相中乙腈的体积百分比为40％→43％；9～15min，流动相中乙腈的体积百分比为43％→95％；

2)以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm；

3)柱温为38～42℃；

4)流速为0.38～0.42mL/min；

5)检测波长为210～310nm；

6)进样量为1～3μl；

7)理论板数按羌活醇计算应不低于3000。

可选的，所述供试品包括海风藤药材、海风藤饮片或海风藤制剂中的任意一种；可选的，所述海风藤制剂包括海风藤配方颗粒。其中，海风藤饮片可以由海风藤药材经除杂、浸泡、润透、切厚片、晒干后所得；海风藤制剂可以由海风藤药材或海风藤饮片提取后得到的提取液(例如煎煮后得到的汤剂)按照药学上常规工艺，加入或者不加药学上常规辅料制成。优选的，海风藤制剂可以选自但不局限于干粉剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、软膏剂、溶液剂等制剂。更优选地，海风藤制剂为海风藤配方颗粒。

可选的，所述方法还包括采用海风藤对照药材制备对照药材溶液的步骤，以及按照本发明任一项所述的检测方法中的超高效液相色谱法检测所述对照药材溶液得到对照药材参照图谱的步骤。

可选的，所述采用海风藤对照药材制备对照药材溶液的步骤，可以包括：取海风藤对照药材0.5～2g，精密称定，加水10～50mL，回流提取20～60分钟，滤过，滤液回收溶剂至干，加第一内标溶液5～50mL，超声处理(功率300W，频率40kHz)20～40分钟，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材溶液。

或者，所述采用海风藤对照药材制备对照药材溶液的步骤，还可以包括：取海风藤对照药材0.5～2g，精密称定，加水10～50mL，回流提取20～60分钟，滤过，滤液回收溶剂至干，加溶剂5～50mL，超声处理(功率300W，频率40kHz)20～40分钟，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，加入第二内标溶液0.5～10mL，摇匀，作为对照药材溶液。

本发明还提供了一种海风藤及其制剂的质量控制方法，包括按照本发明中任一项所述的海风藤及其制剂的检测方法获得待测海风藤产品的特征图谱；并采用该特征图谱与对照特征图谱进行比对的步骤；

其中，对照特征图谱为使用至少一批海风藤及其制剂的标准品按照本发明中任一项所述的方法得到的特征图谱通过平均值或中位数法拟合后得到。

可选的，所述对照特征图谱至少包括1个内标参比峰和4个特征峰，所述内标参比峰为羌活醇峰，各特征峰与内标参比峰的相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.57、1.07、1.14、1.16。

可选的，所述待测海风藤产品选自海风藤药材、海风藤饮片或海风藤制剂中的任意一种。其中，海风藤饮片可以由海风藤药材经除杂、浸泡、润透、切厚片、晒干后所得；海风藤制剂可以由海风藤药材或海风藤饮片提取后得到的提取液(例如煎煮后得到的汤剂)按照药学上常规工艺，加入或者不加药学上常规辅料制成。海风藤制剂可以选自但不局限于干粉剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、软膏剂、溶液剂等制剂。

优选的，所述待测海风藤产品选自海风藤药材、海风藤饮片或海风藤配方颗粒中的任意一种。

可选的，利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件生成海风藤及其制剂的对照特征图谱。

可选的，利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件生成海风藤及其制剂的对照特征图谱后还包括标记共有特征峰的步骤。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的海风藤及其制剂的检测方法，选用羌活醇作为内标物质，检测得到的指纹图谱中具有羌活醇峰，以羌活醇峰作为内标参比峰，能够实现对指纹图谱中各特征峰位置的精准定位，显著提升了检测结果的精确度。

2.本发明提供的海风藤及其制剂的检测方法，选择羌活醇作为内标物质：(1)羌活醇的最大吸收波长为250nm和310nm，其中250nm与本发明中超高效液相色谱法的最优检测波长相近，因此选择羌活醇作为本发明的内标物质，能够确保内标物质在检测条件下具有较大吸收；(2)羌活醇具有适宜的极性条件，一方面使得其在本发明的梯度洗脱中能够保留并被检测，另一方面使得其色谱峰与本发明检测出的各特征峰良好分离，再一方面使得其色谱峰位于各特征峰之间，更适宜作为参照峰，确保各特征峰的相对保留时间稳定；(3)羌活醇对照品供应稳定，较易获得，且应用广泛，能够降低检测成本，提升检测方法普适性。

3.本发明提供的海风藤及其制剂的检测方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，选用特定的洗脱程序，得到4个共有特征峰，并实现了这些共有特征峰以及内标参比峰的良好分离，洗脱程序简单，得到的特征图谱基线平稳，各特征峰以及内标参比峰的峰形好、各特征峰以及内标参比峰之间分离度高，且能够准确定位4个特征峰的峰位置，为海风藤及其制剂的质量检测和控制提供了依据。

4.本发明提供的海风藤及其制剂的检测方法，洗脱时间短，具有较强的可操作性；流动相为乙腈-水，毒性小，对检测系统的腐蚀性小，对色谱柱的损伤小；同时，方法稳定、精密度高、耐用性强、重现性较好，为海风藤及其制剂质量提供快速、全面的检测手段。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1中内标溶液、对照药材溶液与供试品溶液的图谱对比结果；

图2是本发明实施例2中内标溶液、对照药材溶液与供试品溶液的图谱对比结果；

图3-5是本发明实施例3中三批次海风藤配方颗粒的液相图谱；

图6是本发明实施例3中得到的海风藤配方颗粒对照特征图谱；

图7是本发明实施例4中不同流速检测得到的特征图谱对比结果；

图8是本发明实施例4中不同柱温检测得到的特征图谱对比结果；

图9是本发明实施例4中利用Waters ACQUITY UPLC

图10是本发明实施例4中利用Waters ACQUITY UPLC

图11是本发明实施例4中利用；Waters CORTECS

图12是本发明对比例1中测得的海风藤配方颗粒的液相图谱。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例中涉及的仪器、试药及试剂如下所示：

仪器：Waters ACQUITY

试药：羌活醇(批号：111820-201705，中国食品药品检定研究院)；海风藤配方颗粒(批号：19031461、19046531、20032261)，北京康仁堂药业有限公司提供；海风藤对照药材(批号：121635-201603，中国食品药品检定研究院)。

试剂：乙腈为色谱纯，甲醇为分析纯，水为屈臣氏纯化水。

海风藤配方颗粒的制备方法如下：取海风藤饮片适量，加水煎煮，滤过，滤液浓缩成清膏，加入糊精适量，干燥，再加入糊精适量，混匀，制粒，即得。

实施例1

海风藤配方颗粒(批号：20032261)的检测方法，包括：

(1)参照物溶液的制备：包括内标溶液和对照药材溶液的制备。取羌活醇对照品适量，加甲醇制成每1mL含25μg的内标溶液，备用。取海风藤对照药材约1g，精密称定，加水50mL，回流提取30分钟，滤过，滤液回收溶剂至干，加内标溶液10mL，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材溶液。

(2)供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取约1g，精密称定，加入内标溶液10mL，密塞，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

(3)超高效液相色谱法检测：以十八烷基硅烷键合硅胶为充剂(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm)；以乙腈为流动相A，以水为流动性B，按照表1进行梯度洗脱；流速为每分钟0.4mL；柱温为40℃；检测波长为254nm。理论板数按羌活醇计算应均不低于3000。

分别精密吸取内标溶液、对照药材溶液与供试品溶液各2μl，注入超高效液相色谱仪，测定，即得。

表1梯度洗脱表

检测结果如图1所示，图1是内标溶液、对照药材溶液与供试品溶液的图谱对比，如图1所示，供试品图谱中呈现4个特征峰，并与对照药材图谱中的4个特征峰相对应，且供试品图谱与对照药材图谱中均存在羌活醇内标峰，计算供试品图谱中各特征峰与羌活醇内标峰的相对保留时间为：0.57(峰1)、1.07(峰2)、1.14(峰3)、1.16(峰4)。

实施例2

海风藤配方颗粒(批号：20032261)的检测方法，包括：

(1)参照物溶液的制备：包括内标溶液和对照药材溶液的制备。取羌活醇对照品适量，加甲醇制成每1mL含250μg的内标溶液，备用。取海风藤对照药材约1g，精密称定，加水50mL，回流提取30分钟，滤过，滤液回收溶剂至干，加甲醇10mL，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，摇匀，滤过，续滤液加入内标溶液1mL，摇匀，作为对照药材溶液。

(2)供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取约1g，精密称定，加入甲醇10mL，密塞，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，摇匀，滤过，续滤液加入内标溶液1mL，摇匀，作为供试品溶液。

按照实施例1中步骤(3)的方法进行超高效液相色谱检测，检测结果如图2所示，图2是内标溶液、对照药材溶液与供试品溶液的图谱对比，如图2所示，供试品图谱中呈现4个特征峰，并与对照药材图谱中的4个特征峰相对应，且供试品图谱与对照药材图谱中均存在羌活醇内标峰，计算供试品图谱中各特征峰与羌活醇内标峰的相对保留时间为：0.560(峰1)、1.084(峰2)、1.052(峰3)、1.175(峰4)。

实施例3

本实施例用于说明海风藤配方颗粒对照特征图谱的建立：

取三批次海风藤配方颗粒(批号：19031461、19046531、20032261)，分别按照实施例1中步骤(2)的方法制备供试品溶液，按照实施例1中步骤(3)的方法进行超高效液相色谱检测，分别得到液相图谱，如图3-5所示。

将图3-5所示的液相图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012.1版本)进行数据匹配，以S1液相图谱为参照图谱，按中位数计算，得出对照特征图谱，并进行共有特征峰的标识，共标识4个共有特征峰，如图6所示。

实施例4

本实施例用于对实施例1中的检测方法进行方法学验证：

(1)精密度验证

取海风藤配方颗粒(批号：20032261)6份，分别按照实施例1中步骤(2)的方法制备供试品溶液，按照实施例1中步骤(3)的方法进行超高效液相色谱检测，获得其特征图谱，以羌活醇峰为参照峰，计算各特征峰(峰1-峰4)的相对保留时间，并计算RSD，计算结果如表2所示。

表2特征图谱精密度验证保留时间及相对保留时间表

结果显示，各特征峰的相对保留时间RSD在0.06％～0.09％范围内，表明该特征图谱的精密度良好。

(2)重复性验证

取海风藤配方颗粒(批号：20032261)1份，按照实施例1中步骤(2)的方法制备供试品溶液，按照实施例1中步骤(3)的方法进行超高效液相色谱检测，连续进样6次，获得其特征图谱，以羌活醇峰为参照峰，计算各特征峰(峰1-峰4)的相对保留时间，并计算RSD，计算结果如表3所示。

表3特征图谱重复性验证保留时间及相对保留时间表

结果显示，各特征峰的相对保留时间RSD在0.02％～0.05％范围内，表明该特征图谱的重复性良好。

(3)稳定性验证

取海风藤配方颗粒(批号：20032261)1份，按照实施例1中步骤(2)的方法制备供试品溶液，并分别于0、3、6、9、12、15、18、21、24h，按照实施例1中步骤(3)的方法进行超高效液相色谱检测，以羌活醇为参照峰，计算各特征峰(峰1-峰4)的相对保留时间，并计算RSD，计算结果如表4所示。

表4特征图谱稳定性验证保留时间及相对保留时间表

结果显示，各特征峰的相对保留时间RSD在0.14％～0.30％之间，表明供试品溶液中特征成分在24h内稳定性较好。

(4)耐用性验证

1)流速考察

取海风藤配方颗粒(批号：20032261)1份，按照实施例1中步骤(2)的方法制备供试品溶液，分别在流速0.38mL/min、0.40mL/min、0.42mL/min下按照实施例1中步骤(3)的方法进行超高效液相色谱检测，考察实验方法对不同流速的耐用性，获得特征图谱，如图7所示，以羌活醇为参照峰，计算各特征峰(峰1-峰4)的相对保留时间，并计算RSD，计算结果如表5所示。

表5特征图谱耐用性流速考察保留时间及相对保留时间表

结果显示，各特征峰的相对保留时间RSD在1.17％～1.70％之间，表明本发明方法对不同流速的耐用性良好。

2)柱温考察

取海风藤配方颗粒(批号：20032261)1份，按照实施例1中步骤(2)的方法制备供试品溶液，分别在柱温38℃、40℃、42℃下按照实施例1中步骤(3)的方法进行超高效液相色谱检测，考察实验方法对不同柱温的耐用性，获得特征图谱，如图8所示，以羌活醇为参照峰，计算各特征峰(峰1-峰4)的相对保留时间，并计算RSD，计算结果如表6所示。

表6特征图谱耐用性柱温考察保留时间及相对保留时间表

结果显示，各特征峰的相对保留时间RSD在0.41％～0.98％之间，表明本发明方法对不同柱温的耐用性良好。

3)色谱柱考察

取海风藤配方颗粒(批号：20032261)1份，按照实施例1中步骤(2)的方法制备供试品溶液，分别利用色谱柱Waters ACQUITY UPLC

以羌活醇为参照峰，计算各特征峰(峰1-峰4)的相对保留时间，并计算RSD，计算结果如表7所示。

表7特征图谱耐用性色谱柱考察保留时间及相对保留时间表

结果显示，利用ACQUITY BEH C18柱与CORTECS T3柱检测得到的特征图谱中，各特征峰的相对保留时间与规定值的偏差较大，因此，建议采用Waters ACQUITY UPLC

实施例5

本实施例用于验证实施例1的方法对多批次海风藤配方颗粒的检测效果：

取三批次海风藤配方颗粒(批号：19031461、19046531、20032261)，分别按照实施例1中步骤(2)的方法制备供试品溶液，按照实施例1中步骤(3)的方法进行超高效液相色谱检测，分别得到三批次海风藤配方颗粒的特征图谱，以羌活醇为参照峰，计算各特征峰(峰1-峰4)的相对保留时间，并计算三个批次之间各特征峰(峰1-峰4)的相对保留时间的RSD值，计算结果如表8所示。

表8三批次海风藤配方颗粒保留时间及相对保留时间表

由表8可知，每个批次供试品色谱中均有4个共有特征峰，且不同批次间各特征峰的相对保留时间差异较小，均在±10％范围内，符合质量控制要求，选择相对保留时间的平均值作为测定值为：0.57(峰1)、1.07(峰2)、1.14(峰3)、1.16(峰S)。

且通过实施例1中图1的检测结果可知，海风藤饮片与海风藤配方颗粒图谱中各特征峰对应良好，故本方法能快速、全面的检测海风藤与海风藤配方颗粒，为海风藤与海风藤配方颗粒的质量控制提供了更科学的依据。

对比例1

按照如下色谱条件，利用高效液相色谱法对实施例1中制备得到的供试品溶液进行检测：

Kromasil C18(250mm*46mm，5μm)色谱柱；流动相：乙腈-含3％四氢呋喃的水溶液；梯度洗脱程序：0-10min，乙腈-含3％四氢呋喃的水溶液(35:65)等度洗脱，10-60min，乙腈体积百分含量由35％增至50％，60-70min，乙腈-含3％四氢呋喃的水溶液(50:50)等度洗脱；柱温25℃，进样量15μl，流速每分钟1.0mL，检测波长280nm。

检测结果如图12所示，由图12可以看出，利用本对比例的方法，无法实现特征峰1与周围物质峰的有效分离。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。