一种黄土高原地区金银花专用肥及其应用

技术领域

本发明属于肥料技术领域，具体涉及一种黄土高原地区金银花专用肥及其应用。

背景技术

金银花(Lonicera japonica Flos)是一种喜肥的药用植物，施肥对其生长发育、产量提升有着重要作用。同时，施肥也会对土壤环境产生较大影响，当土壤环境发生改变时，金银花的次生代谢过程也会相应变化，进而影响金银花质量。因此，科学合理的施肥方法是促进金银花高产、稳产、质优的关键，是金银花栽培管理中的一项重要措施。近年来，由于金银花优越的经济价值和生态价值使其需求量不断增加，除平邑、封丘、巨鹿等道地产区大量种植外，以陕、甘、宁为代表的黄土高原地区也开始了大规模种植。其中甘肃通渭就是典型的黄土高原种植区，目前通渭地区已推广种植金银花12万亩。然而，相关检测结果表明，黄土高原地区土壤肥力不足，从而导致金银花产量较低，这严重制约了当地金银花产业的发展。肥料作为植物生长发育所需养分的重要来源，是创造中药材优质高产的必需物质条件。近年来，有许多学者对施肥与中药材产量和质量之间的相关性开展了科学研究，研究结果均表明合理施肥对提高药材产量，改善药材品质，减少肥料浪费，减轻环境污染有着重要意义。但此类研究多针对于药材的传统产区，目前对黄土高原金银花新产区的相关研究尚无相关报道。

本研究以地处黄土高原地区的甘肃省定西市通渭县为试点。采用“3414”试验设计，以金银花产量为指标，建立肥料效应模型。同时考察了不同施肥方法对金银花产量、质量以及土壤理化性质和土壤微生物的影响，并对其可能的相关性进行探究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适合黄土高原地区金银花专用肥，该专用肥可以有效的提高金银花产量、质量以及改善土壤理化性质和土壤微生物含量。

为了实现上述目的，本发明的技术方案概述如下：

一种黄土高原地区金银花专用肥，所述专用肥的由以下重量比的成分组成，生物有机肥∶N∶P

其中，所述生物有机肥由放线菌细黄链霉菌菌剂和牛粪以1∶99的重量比组成。具体地，由放线菌细黄链霉菌菌剂和腐熟发酵后的牛粪按1∶99的比例混合均匀，再发酵3～5天，即得。

本发明以地处黄土高原地区的甘肃省定西市通渭县为试点。在初春萌芽时施入生物有机肥0.5kg/株，同时采用“3414”试验设计，以产量和质量为指标筛选氮磷钾肥最佳配比。初步确定最佳施肥处理后，采集对应地块的土壤即有机+氮磷钾肥组(OF+NPK)，同时采集单施生物有机肥组(OF)、单施氮磷钾肥组(NPK)和不施肥的空白组(CK)进行理化性质和细菌丰度检测。并对土壤细菌丰度与理化性质及金银花产量、质量进行Spearman相关性分析。

通过实验可以得出，施肥处理对金银花产量影响显著，处理6(OF+NPK)可使产量最高为229.26g，比不施化肥产量增加了48.2％；拟合了金银花单株产量与氮、磷、钾肥的肥料效应方程，其推荐施肥量为N、P

黄土高原地区金银花最佳施肥方式为：于金银花开春萌芽时施入生物有机肥0.5kg/株，同时施入N：30g/株、P

本发明还保护该专用肥的应用，包括提高金银花产量、提高金银花有效成分含量以及改善土壤微生态。

所述有效成分包括绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C以及木犀草苷，所述改善土壤微生态包括土壤中的嗜热油菌纲、芽单胞菌纲和脱卤球菌纲的丰度显著升高。

本发明的优点：

本发明的专用肥，是针对黄土高原地区特殊的土壤和环境，通过合理的实验得出来的适合金银花生长的肥料配比，其能够有效的提高该地区金银花的产量、提高金银花有效成分含量以及改善土壤微生态，对于黄土高原地区种植金银花，如何合理施肥具有十分重要的指导价值。

附图说明

图1是不同施肥处理对微生物群落组成的影响；

其中，图1A：CK、OF、NPK和oF+NPK组Sobs指数α多样性的差异检验；图1B：CK、OF、NPK和OF+NPK组土壤微生物门水平的种类组成；图1C：CK、OF、NPK和OF+NPK组在纲水平的土壤微生物群落组成。n＝6，x±sd；

图2是土壤微生物与土壤理化因子的相关性分析，

图3是土壤微生物与金银花产量和质量的相关性分析，

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但下述实施例中所涉及的具体实验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商说明书建议的条件实施。

若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以从市场中购买获得。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本研究以地处黄土高原地区的甘肃省定西市通渭县为试点。采用“3414”试验设计，以金银花产量为指标，建立肥料效应模型。同时考察了不同施肥方法对金银花产量、质量以及土壤理化性质和土壤微生物的影响，并对其可能的相关性进行探究，具体实验过程如下：

1材料与方法

1.1试验地概况

试验地设在甘肃省定西市通渭县李店金银花种植基地，该地位于黄土高原南部地带，属黄土高原丘陵沟壑区，海拔1600-1800米，气候类型属温带半干旱大陆性气候，四季分明，干旱少雨，光照丰富，年降水量为300mm，年均温为8.2℃，无霜期145天。试验前，测定土壤的全氮、碱解氮、有效磷、速效钾、有机质含量及pH值，见表1。

表1试验地土壤理化性质

1.2试验材料

供试作物：长势基本一致的北花一号3年生金银花树。

试验肥料：生物有机肥(将放线菌细黄链霉菌菌剂和腐熟发酵后的牛粪按1∶99的比例混合均匀，再发酵3～5天，即得)；尿素(中国石油天然气股份有限公司，N≥46％)；过磷酸钙(云南省昆明市海口宏宝磷肥厂，P

仪器与试剂：岛津高效液相色谱仪(SPD-M20A光电二极管阵列紫外可见光检测器，日本岛津公司)；十万分之一电子天平(ME155DU，梅特勒-托利多仪器有限公司)；高功率数控超声波清洗器(KQ-400KDE，昆山市超声仪器有限公司)。乙腈、磷酸(色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司)；甲醇(分析纯，北京市通广精细化工公司)；水为娃哈哈纯净水。绿原酸(批号：Y22M8K36544)、木犀草苷(批号：Y13J10H93050)购自上海源叶生物科技有限公司；异绿原酸A(批号：PS0066-0025MG/PS001052)、异绿原酸C(批号：PS0068-0025MG/PS001057)购自成都普思生物科技有限公司；以上标品纯度均≥98％。

1.3试验设计

开春萌芽前施入生物有机肥0.5kg/株，同时施入适量氮磷钾肥，氮磷钾肥的施入量采用“3414”肥料效应试验方案确定。设计了N、P

表2氮、磷、钾肥“3414”试验方案(单位：g/株)

按“3414”试验方案肥料用量表，进行氮磷钾肥配比试验，每个处理6株金银花树，随机区组排列，施肥方式为沟施。

1.4测定项目与方法

1.4.1产量

当金银花花蕾由绿变白，上白下绿，上部膨胀，尚未开放时进行采摘。每个处理选择3株长势基本相同的金银花进行摘花计产，一次采完后以第一茬花的产量为单株总产量。

1.4.2有效成分含量

采用HPLC法进行金银花有效成分含量测定，具体方法如下：

混合对照品制备：分别精密称取绿原酸13.94mg、木犀草苷0.37mg、异绿原酸A8.48mg、异绿原酸C 2.24mg置于10mL容量瓶中，加70％甲醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照溶液，备用。

供试品溶液制备：精密称取各处理金银花粉末0.5g，置具塞容器中，加入70％甲醇25mL，混合均匀，称定重量，超声处理45min，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足其减失的重量，摇匀，离心，取上清液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液即得。

色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18(250×4.6mm，5um)；流动相：0.2％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，洗脱条件如表3所示。记录时间为50min。体积流量：1.0mL/min；柱温：35℃；检测波长：327nm(酚酸类)、350nm(黄酮类)；进样量：10μL。

表3 HPLC梯度洗脱程序

对此方法重复性、精密性、稳定性、加样回收率进行方法学考察，RSD均＜5％，符合相关要求，表明方法可行。对照品线性关系如表4所示。

表4对照品的浓度范围、线性方程及相关系数

1.4.3土壤理化性质

对具代表性的土壤理化性质进行检测，其中pH值使用pH计测定；全氮测定采用重铬酸钾硫酸消化法；碱解氮测定采用碱解扩散法；有效磷测定采用碳酸氢钠法；速效钾用醋酸铵-火焰光度计法测定；有机质用重铬酸钾容量法测定。具体检测方法参照农业行业相关标准进行。

1.4.4土壤微生物丰度

抽提单因素处理的土壤微生物群落总DNA，使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取量，使用NanoDrop2000测定DNA浓度和纯度；使用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)对16S rRNA基因V3-V4可变区进行PCR扩增，每个样本6个重复。将同一样本的PCR产物混合后使用2％琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrepDNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences，Union City，CA，USA)进行回收产物纯化，2％琼脂糖凝胶电泳检测，并用Quantus

1.5数据分析

采用IBM SPSS Statistics 26、Excel 2020进行数据统计分析。数据结果以x±sd表示。组间方差分析采用one-way ANOVA检验。P＜0.05具有统计学差异显著性。微生物多样性分析使用美吉生物云平台完成。

2结果与分析

2.1不同施肥方法对金银花产量的影响

由表5可知，在“3414”试验中，处理6产量最高为229.26g，而处理1产量最低为118.86g，处理6比处理1产量高110.40g；氮、磷、钾肥均能促进单株产量的增加，且随着施肥量的增加，金银花单株产量呈现先上升后下降的趋势。由处理2、3、6、11可知，当磷、钾施用量相同时，处理6产量显著高于处理2、3、11，处理3显著高于处理2，处理11与处理2差异不显著；由处理4、5、6、7可知，当氮、钾施用量相同时，处理6的单株产量显著高于处理4、5、7，处理4、5、7之间无显著性差异；由处理6、8、9、10可知，当氮、磷施肥量相同时，处理6单株产量最高，而处理8、9、10之间无显著性差异。由单因素试验可知有机肥与化肥配合施用产量显著高于其他施肥组。

表5施肥对金银花单株产量的影响

2.2金银花产量与氮、磷、钾的肥料效应模型

对“3414”试验做进一步肥料效应函数分析。将金银花单株产量(Y)与施氮量(N)、施磷量(P)、施钾量(K)进行回归分析，可得到以下关系式。

2.2.1三元二次肥料效应方程：

Y＝115.6+63.6N-13.1N

2.2.2二元二次的3个肥料方程为：

Y＝-65.5+163.3N+134.9P-20.6N

Y＝-2.3+114.7N+113.4K-20.8N

Y＝69.6+53.2P+84.5K-7.9P

表6二元二次肥料方程推荐的施肥量及目标产量/g

2.2.3一元二次的3个肥料方程为：

Y＝155.5+87.4N-27.9N

Y＝177.4+47.6P-14.5P

Y＝144.2+60K-15.5K

表7一元二次肥料方程推荐的施肥量及目标产/g

综合分析氮、磷、钾的三元二次、二元二次、一元二次肥料效应数学模型计算结果可得，黄土高原地区，3年生金银花第一茬花的目标产量为单株198.2～223.9g时，推荐施肥量分别为每株施N：19.5～30.0g；P

2.3不同施肥方法对金银花质量的影响

2.3.1施肥处理对酚酸类含量的影响

由表8可知，在“3414”试验中，处理1绿原酸含量最高为4.50％，处理6异绿原酸A和异绿原酸C含量最高分别为1.77％和0.28％，处理13可使3种酚酸总含量最高为6.11％。随着施肥量的增加，酚酸类含量总体呈现先上升后下降的趋势。由处理2、3、6、11可知，当磷、钾施肥量相同时，酚酸类含量均以处理6最高，其中处理6的绿原酸与3种酚酸总含量显著高于缺氮处理2，但与处理3、11差异不显著；由处理4、5、6、7可知，当氮、钾施肥量相同时，酚酸类含量均以处理6最高，且在异绿原酸A、异绿原酸C及3种酚酸含量中处理6均显著高于处理4、5、7，绿原酸含量处理6显著高于缺磷处理4，但与处理5、7差异不显著；由处理6、8、9、10可知，当氮、磷施肥量相同时，绿原酸含量以处理9最高，显著高于缺钾处理8，但与处理6、10差异不显著，异绿原酸A含量在不同施钾水平中差异不显著，异绿原酸C含量以处理6最高，且显著高于处理8、9、10，3种酚酸含量以处理6最高，且显著高于缺钾处理8，与处理9、10差异不显著。

2.3.2施肥处理对木犀草苷含量的影响

在“3414”试验中，由处理2、3、6、11可知，处理11木犀草苷含量最高为0.15％，显著高于不施氮肥组，其余处理间差异不显著；由处理4、5、6、7的数据可知，不同施磷水平对木犀草苷含量均无显著性影响；钾肥对木犀草苷的影响无明显规律。由此可见，氮磷钾施肥配比对木犀草苷含量无明显影响。

表8施肥对金银花质量的影响/％

2.4不同施肥方法对土壤理化性质的影响

对“3414”试验中产量最高及最低的处理，即处理6和处理1，进行土壤理化性质测定，并将处理1记为“有机肥”组(OF)，处理6记为“有机肥+氮磷钾肥”组(OF+NPK)，同时以完全不施肥的组记为“空白”组(CK)和不施有机肥，只施氮磷钾肥记为“氮磷钾肥”组(NPK)作对照。其中有机肥组为施入含有放线菌剂的生物有机肥0.5kg/株，氮磷钾肥施肥量为“3414”试验中的N

测得结果如表9所示，土壤中全氮以OF+NPK组最高但与其他各组差异不显著，碱解氮以NPK组最高，且显著高于其他各组，有效磷、速效钾和有机质均以OF+NPK组最高且显著高于其他3组(P＜0.05)，pH值OF组最高且与其他施肥组有显著性差异(P＜0.05)。由此可见，有机肥和化肥配施可有效提高土壤中的养分含量，其中以有效磷、速效钾和有机质提高效果最为显著，且施肥会使pH值略有增大。

表9施肥对土壤理化性质的影响

注：CK不施肥对照No fertilizer control；OF-有机肥Organic fertilizer；NPK-化肥氮磷钾Chemical NPK；OF+NPK--有机肥Organic fertilizer+NPK；n＝6，x±SEM；同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05)。

2.5不同施肥方法对土壤微生物物种组成的影响

Sobs指数描述的是群落丰富度的实际观测值，由图1A可知3个施肥组，即有机肥组、化肥组以及有机+化肥组的土壤细菌sobs指数均高于空白对照组(P＜0.001)，可见施肥可显著增加土壤中细菌群落的丰富度，但3个施肥组间差异不显著。再对不同施肥组的土壤细菌进行群落组成分析，结果显示，空白和施肥各组间土壤菌群结构存在显著差异。在门水平：空白组(CK)的主要优势菌为放线菌门(Actinobacteriota，32.24％)、变形菌门(Proteobacteria，34.50％)、蓝细菌门(Cyanobacteria，17.07％)，共占群落组成比重的85.81％；有机肥组(OF)、氮磷钾肥组(NPK)、有机+氮磷钾肥组(OF+NPK)的优势菌组成相似，分别为放线菌门(Actinobacteriota，27.60％vs 27.17％vs 27.59％)、变形菌门(Proteobacteria，18.76％vs 22.17％vs 19.49％)、绿弯菌门(Chloroflexi，12.75％vs15.91％vs 15.01％)和酸杆菌门(Acidobacteriota，13.24％vs 13.53％vs 15.31％)，分别占3个施肥组群落组成比重的72.35％、78.78％、77.40％(图1B)。图1C显示，在纲水平，CK组的主要优势菌为放线菌纲(Actinobacteria，29.50％)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria，12.70％)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria，21.85％)、蓝细菌纲(Cyanobacteriia，17.04％)；OF、NPK、OF+NPK组的优势菌组成较相似，分别为放线菌纲(Actinobacteria，12.13％vs 12.77％vs 9.46％)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria，10.93％vs 13.02％vs 10.91％)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria，7.83％vs 9.16％vs 8.58％)、Vicinamibacteria(8.64％vs 9.12％vs 10.09％)、嗜热油菌纲(Thermoleophilia，7.45％vs 7.01％vs 9.33％)、酸微菌纲(Acidimicrobiia，4.75％vs4.80％vs 4.63％)、芽单胞菌纲(Gemmatimonadetes，3.97％vs 4.44％vs 5.32％)、绿弯菌纲Chloroflexia(3.44％vs 5.95％vs 3.83％)。

与CK组相比，OF、NPK和OF+NPK组均提高了土壤中嗜热油菌纲、芽单胞菌纲和绿弯菌纲的相对丰度，而放线菌纲、γ-变形菌纲、蓝细菌纲的相对丰度均有所降低。

2.6不同施肥处理土壤理化性质与土壤微生物的关联性分析

将土壤中全氮、碱解氮、有效磷、速效钾、有机质和pH与土壤细菌纲水平相对丰度前30名的种群进行Spearman相关分析，结果显示，土壤细菌丰度与土壤理化性质有显著相关性(图2)，其中嗜热油菌纲(Thermoleophilia)与全氮、有效磷、速效钾、有机质和pH呈显著正相关关系，脱卤球菌纲(Dehalococcoidia)、Methylomirabilia与全氮、有效磷、有机质和pH呈显著正相关关系，且在3个施肥组中嗜热油菌纲(Thermoleophilia)、脱卤球菌纲(Dehalococcoidia)和Methylomirabilia的相对丰度较空白对照组显著升高(图1C)。放线菌纲(Actinobacteria)与有效磷和有机质呈显著负相关，蓝细菌纲(Cyanobacteriia)与全氮、有效磷呈显著负相关，且在施肥组中放线菌纲(Actinobacteria)和蓝细菌纲(Cyanobacteriia)相对丰度减少(图1，c)。

2.7不同施肥处理金银花产量、有效成分含量与土壤微生物的关联性分析

将金银花产量、绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸c、3种酚酸总量和木犀草苷含量与土壤细菌纲水平相对丰度前30名的种群进行Spearman相关分析，结果显示，土壤细菌丰度与产量、异绿原酸A、异绿原酸c和3种酚酸总量有显著相关性，与绿原酸和木犀草苷相关性不显著(图2)，其中嗜热油菌纲(Thermoleophilia)、脱卤球菌纲(Dehalococcoidia)、芽单胞菌纲(Gemmatimonadetes)相对丰度与产量、异绿原酸A、异绿原酸c和3种酚酸总量有显著正相关关系，且在3个施肥组中嗜热油菌纲(Thermoleophilia)、脱卤球菌纲(Dehalococcoidia)、芽单胞菌纲(Gemmatimonadetes)的相对丰度较空白对照组显著提高(图1c)。γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)和蓝细菌纲(Cyanobacteriia)的相对丰度与产量、异绿原酸A、异绿原酸c和3种酚酸总量有显著负相关关系，且在3个施肥组中这两种菌的相对丰度较CK组减少(图1C)。

2.8综合分析

随着氮、磷、钾施肥量的增加，金银花产量基本呈先上升后下降的趋势，在处理6水平时达到峰值。施肥量对酚酸类成分含量有显著影响，且以处理6水平施肥效果最佳，但施肥对木犀草苷含量影响效果不明显。由此可见，以产量为指标的最佳施肥处理和以质量为指标的最佳施肥处理具有一致性，均以施生物有机肥0.5kg/株+N

本研究对“3414”试验中的处理1(OF)、处理6(OF+NPK)的土壤理化性质进行测定，同时还测了单施氮磷钾肥(NPK)和不施肥的空白(CK)土壤，结果显示，OF+NPK土壤中有效磷、速效钾和有机质含量均显著高于其他各组。同时对上述4组土壤进行微生物丰度和群落结构检测，并对土壤细菌与土壤理化性质及金银花产量、品质指标之间的相关性进行了探究。结果表明，放线菌门、变形菌门、绿弯菌门和酸杆菌门为土壤中的优势菌群，施肥后土壤中嗜热油菌纲、芽单胞菌纲和脱卤球菌纲的相对丰度显著高于不施肥的空白组，且这些菌与土壤全氮、有效磷和有机质以及金银花产量、异绿原酸A、异绿原酸C和3种酚酸总量均成显著正相关关系。

当生物有机肥和化肥合理配施时，土壤中有效磷、速效钾和有机质会显著增加，同时嗜热油菌纲、芽单胞菌纲和脱卤球菌纲会随之增加，且这些菌种可显著促进金银花产量和酚酸类有效成分含量的增加。

综上，黄土高原地区金银花最佳施肥方式为：于金银花开春萌芽时施入生物有机肥0.5kg/株，同时施入N：30g/株、P

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。