一种蝴蝶兰茎尖生长点培养脱病毒技术

技术领域

本发明涉及植物营养、栽培技术，具体是指一种蝴蝶兰(Phalaenopsis)茎尖生长点培养脱病毒技术。

背景技术

蝴蝶兰作为高产值花卉，是目前温室生产的主力产品。但在蝴蝶兰产业快速发展之时，兰花病毒问题日渐突出，严重影响蝴蝶兰的生长和观赏性。感染病毒的兰株叶片分泌蜜露易为灰霉菌侵染，叶片老化加速，有效光合能力降低终影响成花品质。且叶片灰霉菌和病毒造成的叶面成斑都降低商品苗的品质，造成商品损耗和生产成本上升。

兰花病毒有记录的有28种，蝴蝶兰中影响最大的病毒为建兰花叶病毒(CyMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)两种。症状隐秘而严重兰株感染有时看不出病征，严重时多表现嵌纹与轮状斑。人工栽培中当蝴蝶兰植株同时被这2种病毒复合感染后，其危害比单一病毒感染更为严重。同时因为兰花病毒寄主的非单一性，会在管理疏漏或品种交流时交叉传播感染而危及其他园艺作物，因此研发脱病毒技术势在必行。

病毒对寄主植物可造成毁灭性危害，导致大幅度减产，甚至全株死亡。①一旦染毒终生带毒；②难用药剂控制；③通过嫁接或虫媒传播，随着无性繁殖系数增大而传播加快；④严重影响产量与产品质量；

无毒种苗培育途径：①群体中未受病毒侵染的植株无性繁殖获得；②种子繁殖获得，但后代往往会发生变异；③组培脱毒培育无病毒苗，能相对保持物种遗传稳定性。

植物茎尖组培脱毒原理为：染病植株体内病毒的分布不均匀，越靠近茎顶的感染程度越低，生长点(约0.1－1.0)附近因为无维管束病毒只能通过胞间连丝传递不及细胞不断分裂和生长的速度，几乎不含或含病毒很少。在切取茎尖时越小越好，但太小则不易成活，过大又不能保证完全除去病毒。茎尖组培脱毒，由于其脱毒效果好，后代稳定，所以是目前培育无病毒苗最广泛和最重要的一个途径。

兰花病毒CyMV为杆状病毒，胞外耐热60-70℃。感染兰株会出现叶片黑斑、坏疽条纹、花朵不平整、坏疽斑点(该点为CyMV特有之病征)等有时会被误认为真菌感染造成；ORSV，短杆状病毒，可于胞外95℃下存活一定时间。茎尖生长点组织培养脱毒最可行，可辅助以抗病毒化学试剂处理作为脱病毒方法运用。在茎尖脱毒培养研究中，培养基的优化度和茎尖外植体取材是技术的关键，但对蝴蝶兰的脱病毒研究少见有系统的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对以上问题提供一种蝴蝶兰茎尖生长点培养脱病毒技术。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种蝴蝶兰茎尖生长点培养脱病毒技术，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、对预选取材的绽开3-4朵的株蝴蝶兰植株单株编号，取材进行兰花病毒检测；

步骤2、取材携带病毒建兰花叶病毒CYMmV和齿舌兰环斑病毒ORSV母株的蝴蝶兰花梗；

步骤3、对取材花梗按照组织培养外植体处理方法在超净工作台上消毒后接种在潜伏芽诱导培养基，培养室温度25度，光照1600-2000lux，12h/d光周期；

步骤4、接种材料在培养室内培养待营养芽长出来，根据材料数量增殖2-3次以多获得无根芽苗，培养室控制如步骤3；

步骤5、将获得的无根芽诱导生根，生根诱导过程中结合抗病毒剂处理，培养室控制如上；

步骤6、以经抗病毒预处理的再生苗作为材料，在超净工作台上借助放大倍数8-40倍的冷光源解剖镜下用镊子和手术刀、解剖针，剥取外部叶片和叶原基，漏出茎尖生长点，用消毒过的手术刀或解剖针切取携带一个叶原基的茎尖生长点，接种在准备好的诱导培养基上，在培养室内培养，一个培养容器中只接种一个茎尖生长点外植体，接种后每个外植体独立编号；

步骤7、对茎尖生长点培养获得的分化苗取材进行兰花病毒检测，将检测结果无病毒的芽体进行组培增殖扩繁，增殖4次，周期50天，每次增殖前进行病毒检测，避免病毒表现空窗期的疏漏；

步骤8、将获得的无病毒苗再生驯化后在温氏移栽，专门区域专人管理，避免栽培过程中交叉感染。

作为改进，步骤4花梗潜伏芽的诱导、增殖技术所用的培养基如下：基本培养基：1/3MS培养基大量元素+MS培养基无机微量元素+MS培养基有机物+白砂糖20gL

潜伏芽诱导培养基：基本培养基+白砂糖20gL

侧芽增殖培养基：基本培养基+萘乙酸0.1mgL

作为改进，步骤5蝴蝶兰无根苗生根诱导技术所痛的培养基如下：基本培养基+去皮香蕉30gL

作为改进，步骤5诱导生根过程中结合抗病毒剂处理方法如下：生根培养基高温灭菌后，在超净工作台上待培养基冷却温度降至60度以下时，用过滤灭菌方式加入三氮唑核苷(ribavirin)浓度5mgL-1，待培养基冷却凝固后可接种无根苗诱导生根同时抑制病毒。

作为改进，步骤6操作步骤如下：在超净工作台上借助放大倍数8-40倍的冷光源解剖镜下用镊子和手术刀、解剖针，将苗切掉根和外部叶片放在经过消毒的，浸湿100mgL

作为改进，步骤6取材茎尖生长点诱导的培养基。MS基本培养基+NAA(萘乙酸)0.1mgL

作为改进，步骤7、步骤8将经茎尖生长点培养所获的再生苗经过定期病毒检测，淘汰病毒携带苗，将脱病毒彻底的再生苗栽培于专人、专区管理，无毒苗区域覆盖防虫网，养护管理中所用水肥工具专用，避免病毒因机械损伤交叉感染，工具在两株苗间使用需要先经过4％氢氧化钠溶液消毒。

本发明与现有技术相比的优点在于：蝴蝶兰的两种病毒CYyMV和ORSV，生理耐高温，常规的热处理难奏效，本研究中将抗病毒物质和茎尖生长点取材培养脱病毒两种技术集合起来，可以相对取材大一点，提高了生长点取材培养的成活率又提高了病毒脱除效果。

具体实施方式

下面对本发明做进一步的详细说明。

本发明在具体实施时，步骤1、对预脱病毒的蝴蝶兰选花朵绽开3-4朵的植株单株编号，取叶片材料用ELISA病毒检测技术行兰花病毒检测(后期的定期检测皆用ELISA技术检测)。

步骤2、按照编号取材携带病毒建兰花叶病毒CYMmV和齿舌兰环斑病毒ORSV母株的蝴蝶兰花梗，用花梗潜伏芽作为材料诱导。

步骤3、对取材花梗按照组织培养外植体处理方法用75％乙醇溶液震荡消毒45秒后用无菌水冲洗。在超净工作台上用有效氯含量1.5％的漂白水溶液+TWEEN-20(3滴/升漂白水溶液)消毒18-22分钟。消毒期间频繁震荡容器使消毒剂充分渗透。然后用无菌水冲洗3-5次，每次2分钟，后用无菌滤纸将消毒茎残余水分吸干。用消毒过的镊子和手术刀仔细将带芽节段切下，接种到诱导培养基。

花梗潜伏芽诱导培养基：1/3MS培养基大量元素+MS培养基无机微量元素+萘乙酸1mgL

消毒后接种在潜伏芽诱导培养基。培养室温度25度，光照1600-2000lux，12h/d光周期。

步骤4、接种材料在培养室内培养待营养芽长出来，根据材料数量增殖2-3次以多获得无根芽苗。

增殖培养基：1/3MS培养基大量元素+MS培养基无机微量元素+萘乙酸0.1mg

步骤5、将获得的无根芽诱导生根，生根诱导过程中结合抗病毒剂处理。培养室控制如上。

生根诱导及抗病毒剂处理：1/3MS培养基大量元素+MS培养基无机微量元素+MS培养基有机物+去皮香蕉30gL

生根培养基高温灭菌后，在超净工作台上待培养基冷却温度降至60度以下时，用过滤灭菌方式加入三氮唑核苷(ribavirin)浓度5mgL

步骤6、抗病毒预处理的再生苗作为材料，在超净工作台上借助放大倍数8-40倍的冷光源解剖镜下用镊子和手术刀、解剖针，将苗切掉根和外部叶片放在经过消毒的，浸湿100mgL

茎尖生长点诱导培养基：MS基本培养基+NAA 0.1mgL

步骤7、对茎尖生长点培养获得的分化苗取材进行兰花病毒检测，将检测结果无病毒的芽体进行组培增殖扩繁，增殖4次，周期50天，每次增殖前进行病毒检测，避免病毒表现空窗期的疏漏。为避免组培中的交叉感染，在转接无病毒苗前将工具如刀、镊子、火焰灼烧30秒以上待凉后使用用。切苗盘每次清洗后用3％氢氧化钠溶液浸泡5分钟后，清水洗净再晾干后高温灭菌后施用。

步骤8、将获得的无病毒苗再生驯化后在温氏移栽，专门区域专人管理，避免栽培过程中交叉感染。放置时株间不要接触到，操作台面用4％氢氧化钠溶液或0.5％次氯酸钠容易消毒。工作人员最好戴经消毒后的手套。专人操作。无病毒苗专区管理，区内严格控管人员出入，并严禁任何人为接触植株造成感染之机会。从外面引入的苗也必须经过严格检测或确认是没有病毒的。

本发明的工作原理：

实施例：蝴蝶兰红花品种‘大辣椒’(Dtps.Big Chilli)的茎尖生长点培养脱病毒。该品种是蝴蝶兰红花中最受欢迎的经典品种。

2013年1月份从市场购买开花4-6朵的蝴蝶兰‘大辣椒’，经ELISA病毒检测，复合携带CYyMV和OVSV两种病毒。从花梗基部第一个芽上剪取花梗。从第一朵花以上的部分切掉不要，将下面的部分先用棉花蘸75％的酒精溶液擦拭消毒。后将每个潜伏芽截下，按照生理学方向保持下端1-1.5厘米，上端0.5厘米。在超净工作台上用有效氯含量1.5％的漂白水溶液+TWEEN-20(3滴/升漂白水溶液)消毒16-20分钟。消毒期间频繁震荡容器使消毒剂充分渗透。然后用无菌水冲洗5次，每次2分钟，后用无菌滤纸将消毒茎残余水分吸干。用消毒过的镊子和手术刀将上下端各切掉0.2厘米以减少接种培养后消毒剂的副作用。接种到蝴蝶兰花梗潜伏芽诱导培养基1/3MS培养基大量元素+MS培养基无机微量元素+萘乙酸1mgL

35天为周期，增殖2次后，取个体健壮的芽接种到过滤灭菌添加三氮唑核苷(ribavirin)浓度5mgL

接种后在培养室培养1个月后移至温室内，光照3000lux，温度24-28度驯化培养。驯化30-45天后长成健壮的，3-4天根系的再生苗可以生长点培养取材。因为这是无菌苗，无需重新消毒灭菌。在超净工作台上将再生苗从组培瓶中取出后切去根和叶片，保留从根萌点向上1.5厘米的茎段。

在8-40倍的冷光源解剖镜下用镊子和手术刀、解剖针，将苗切掉根和外部叶片放在经过消毒的，浸湿100mgL

茎尖生长点诱导培养基：MS基本培养基+NAA 0.1mgL

待发育、分化长出叶片后，可根据独立的编号取叶片为材料进行病毒检测。根据检测结果，将分化出的芽按照独立编号进行ELISA病毒检测，只留检测结果银杏的芽进行丛生芽增殖，培养基同前面。病毒检测定期3个月检测一次，检测3次，避免病毒表现空窗期的疏漏。以确保所保留的材料是脱净病毒的。将获得的无病毒苗再生，生根诱导培养基同前面。驯化后在温室内出瓶栽培管理。栽培期间专门区域专人管理，避免栽培过程中交叉感染。放置时株间不要接触到，操作台面用4％氢氧化钠溶液或0.5％次氯酸钠容易消毒。工作人员最好戴经消毒后的手套。专人操作。无病毒苗专区管理，区内严格控管人员出入，并严禁任何人为接触植株造成感染之机会。从外面引入的苗也必须经过严格检测或确认是没有病毒的。栽培期间定期病毒检测避免交叉感染。

在茎尖生长点取材时取材个体大小影响生长点培养的成活率和脱病毒效果。本研究中取材<0.3毫米，携带一个叶原基，成活率可达20％，存活生长点脱毒率可达30％。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征，在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征之“上”或之“下”可以包括第一和第二特征直接接触，也可以包括第一和第二特征不是直接接触而是通过它们之间的另外的特征接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”包括第一特征在第二特征正上方和斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”包括第一特征在第二特征正下方和斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”，“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。