血清代谢标志物及其评估颅内动脉斑块稳定性的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及生物代谢标志物及其在评估脑梗死患者颅内动脉粥样硬化斑块稳定性应用。

背景技术

生物标志物(Biomarker)是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标。Biomarker相关研究在科研领域极受欢迎，既可以平衡临床工作，又能兼顾基础研究，具有非常广泛的用途。代谢组学(Metabolomics)是1990年新兴的一项技术，是基因组学、转录组学、蛋白质组学的延伸，位于系统生物学最下游，目的在于考察生物体系受到各种内外环境扰动后，其代谢产物的变化规律，揭示机体正在发生什么，反映所有生命现象所导致的分子结果，通过筛选不同组别不同个体间的表型差异，揭示其参与的生物过程及可能的分子机制，是筛选各类生物标志物的有效方法。

人体的代谢物种类繁多、浓度范围分布广泛，目前多采用联用技术，即液质联用(LC-MS/MS)技术，提高了色谱法的重复性和分辨率。代谢物被定义为小分子，它们是细胞内发生的众多酶催化的代谢反应的中间产物。

动脉粥样硬化疾病是一种复杂的代谢紊乱，是全球最大的死亡原因之一。越来越多的证据表明，颅内斑块增强与急性缺血性卒中密切相关，斑块增强是动脉粥样硬化斑块易损的关键因素之一。但目前对斑块增强的代谢物改变的研究较少。基因-环境相互作用可能导致各种代谢途径的调节，从而导致各种代谢物水平的改变。因此，鉴定代谢物有助于破译可能参与动脉粥样硬化病理生理学的途径。随着LC-MS/MS的方法的出现，现在可以筛选数千种代谢物，从而可以识别潜在的疾病代谢标志物。

斑块强化是卒中复发的独立危险因素，这也促进了斑块明显增强可能作为预测卒中复发的潜在影像学标志物本实验通过对颅内动脉粥样硬化斑块明显强化和不明显强化人群的血清样本进行研究，运用超高效液相色谱、与高分辨质谱联用技术，并运用多元统计分析结合机器学习算法的数据处理模式，找出斑块明显强化和不明显强化组之间有统计学意义的差异代谢物，从而探讨斑块明显强化的分子机制，生物标志物的发现可能有助于斑块稳定性及脑梗死发病风险预测。生物标记物筛选流程图，如图1。

代谢组学数据一般样本量比较小，具有高维、高噪声等复杂的特性，数据分析工作受到一定的限制，常规方法分析易出现假阳性结果，需要专门的数学、生物信息学和统计学来处理数据。提取有价值信息、筛选潜在生物标志物是代谢组学数据处理要解决的主要问题。

随机森林(Random forest，RF)是一个包含多个决策树的集成分类器，RF的算法优势在于样本差异的可视化，判断特征的重要度，具有可靠的分类预测能力和较高的正确率，不易出现过拟合，可以筛选高维度的数据，且不需要预先进行降维处理，对噪声和异常数据具有较高的容忍度。RF采用重复10次交叉验证获取模型的最优参数，类似于传统统计方法中的logistic回归，RF模型也通过自变量X对应变量Y进行有效的解释，即在构建分类树的时候，模型采用自助法(Bootstrap)重采样技术，有放回随机抽样，随机选择自变量和应变量，按照平均精确度下降(Mean decrease accuracy)重要评分和基尼指数(Mean decreaseGini)进行数据分裂创建不同的分类树，同时确保每颗树的枝叶能够得到最大的生长。在构建模型的过程中，根据变量的重要度，对预测变量的重要性排序剔除一些无效的变量，提高模型的分类精度，得到潜在的差异代谢物。

最小绝对收缩和选择算子(Least absolute shrinkage and selectionoperator，LASSO)回归是一种广义线性回归模型，Robert Tibshirani首次于1996年提出，通过在最小二乘的基础上增加一个L1惩罚函数(L1

penalization)，有效地解决共线性的影响，让模型更稳定、泛化能力更强，通过将一些无意义或意义很小的自变量系数压缩至0，将回归系数非0的变量纳入最终模型，根据10重交叉验证和最佳λ值，得到一个简化后的模型，进一步缩小目标代谢物范围，如果样本量不能远远大于变量数，而且多数变量与结果没有什么关系的情况下，最小二乘法多元回归将不能得到较好的预测结果。在这些情况下，LASSO回归模型可能既提高预测的精度，又通过变量筛选来简化模型，以确定重要的目标代谢物。

发明内容

本发明的目的是提供几种血清代谢标志物，及其用于评估颅内动脉粥样硬化斑块稳定性的方法。

血清生物标志物的应用，用于评估颅内动脉斑块的稳定性，所述血清生物标志物选自磷脂酰胆碱PC(15:0/15:1)、磷脂酰胆碱PC(14:0/18:2)、磷脂酰乙醇PE(18:2/18:3)、磷脂酰乙醇PE 18:1e/18:1、5α-二氢睾酮即5α-Dihydrotestosterone、D-果糖6-磷酸即D-Fructose 6-phosphate、磷脂酰胆碱(14:0/18:2)、鞘磷脂SM(d28:0/14:1)、磷脂酰胆碱PC(20:3/22:6)、磷脂酰胆碱PC(20:3/20:4)其中的一种或几种组合。

本发明技术方案的进一步改进在于：所述的血清生物标志物为5α-二氢睾酮、D-果糖6-磷酸和磷脂酰胆碱PC(14:0/18:2)的组合。

本发明技术方案的进一步改进在于：所述血清生物标志物来自于受试者的血清。

本发明技术方案的进一步改进在于：磷脂酰胆碱PC(15:0/15:1)、磷脂酰胆碱PC(14:0/18:2)、磷脂酰乙醇PE(18:2/18:3)、PE(18:1e/18:1)、5α-Dihydrotestosterone、D-Fructose 6-phosphate这6种血清代谢物任一种含量降低指示所述受试者颅内动脉斑块容易出现明显增强，存在斑块不稳定的风险。

本发明技术方案的进一步改进在于：鞘磷脂SM(d28:0/14:1)、PC(20:3/22:6)、PC(20:3/20:4)这3种血清代谢物任一种含量升高指示所述受试者颅内动脉斑块容易出现明显增强，存在斑块不稳定的风险。

本发明技术方案的进一步改进在于：5α-二氢睾酮、D-果糖6-磷酸和磷脂酰胆碱PC(14:0/18:2)的组合血清生物标志物浓度含量降低指示所述受试者颅内动脉斑块容易出现明显增强，存在斑块不稳定的风险。

本发明技术方案的进一步改进在于：5α-二氢睾酮、D-果糖6-磷酸和磷脂酰胆碱PC(14:0/18:2)的组合血清生物标志物浓度含量降低指示所述受试者颅内动脉斑块容易出现明显增强，斑块增强作为斑块不稳定和发生卒中风险的标志物，可以帮助识别缺血事件的复发。

本发明技术方案的进一步改进在于：权利要求1或2所述的血清生物标志物，在调整混杂因素后脑动脉斑块明显强化是脑梗死复发的独立危险因素，用于预测受试者脑梗死复发的早期诊断。

本发明技术方案的进一步改进在于：权利要求1或2所述的血清生物标志物，用于鉴定和评估药物和/或手术治疗对治疗脑梗死复发的效果的应用。

由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术效果如下：

本发明提供了可以评估颅内动脉粥样硬化斑块稳定性的血清代谢标志物，通过检测受试者血样中磷脂酰胆碱PC(15:0/15:1)、磷脂酰胆碱PC(14:0/18:2)、磷脂酰乙醇PE(18:2/18:3)、磷脂酰乙醇PE(18:1e/18:1)、5α-二氢睾酮即5α-Dihydrotestosterone、D-果糖6-磷酸即D-Fructose6-phosphate、磷脂酰胆碱PC(14:0/18:2)、鞘磷脂SM(d28:0/14:1)、磷脂酰胆碱PC(20:3/22:6)、磷脂酰胆碱PC(20:3/20:4)其中的一种或几种的浓度，运用超高效液相色谱(UHPLC)与高分辨质谱联用技术，并运用多元统计分析结合机器学习算法的数据处理模式，找到简单高效且容易被患者接受的血清学筛查方法，来判断受试者颅内动脉粥样硬化斑块的稳定性，早期识别易损斑块，为动脉粥样硬化的治疗或干预提供新方向，为寻找脑梗死复发提供线索，为制定预防脑梗死复发的策略提供依据。

附图说明

图1是本发明筛选血清代谢标志物的流程图；

图2是本发明的实验流程图；

图3是本发明9种差异代谢物变化的聚类热图；

图4是与脑动脉斑块明显强化相关的血清生物标志物的ROC曲线；

图5是颅内动脉粥样硬化斑块明显强化标志物的最佳组合。

具体实施方式

为详尽本发明之技术内容、结构特征、所达成目的及功效，以下将结合说明书附图进行详细说明。

本发明通过对颅内动脉粥样硬化斑块明显强化和不明显强化人群的血清样本进行研究，运用超高效液相色谱(UHPLC)与高分辨质谱联用技术，并运用多元统计分析结合机器学习算法的数据处理模式，找出两组之间有统计学意义的差异代谢物，从而探讨斑块强化的分子机制，生物标志物的发现可能有助于改善脑血管风险预测和早期疾病筛查。

1、病历选择及样品准备

研究对象纳入标准：①年龄35-80岁，发病7天以内的经弥散加权成像(Diffusion-weighted imaging,DWI)证实的首次急性脑梗死的患者，存在颅内大动脉≥50％的狭窄；②患者一般生命体征平稳。

研究对象排除标准：①病灶同侧的颈部血管存在≥50％的狭窄；②存在房颤、瓣膜病或者其他原因导致的心源性栓塞；③颅内动脉夹层、动脉炎等非动脉粥样硬化性脑梗死患者；④DWI阴性的短暂性脑缺血发作的患者；⑤存在体内金属植入、幽闭恐惧症等与核磁成像安全性有关的相对/绝对禁忌症。

测量了HR-MRI中斑块和垂体柄增强后的信号强度，并计算两项指标的比值，斑块增强程度分为3级：0级(无强化)：强化程度类似或小于正常的颅内动脉壁；1级(轻度强化)：强化程度大于0级，但小于垂体漏斗部；2级(明显强化)：强化程度类似或高于垂体漏斗部。我们在本分析中将2级强化定义为明显强化组(HE组)，将0级和1级定义为不明显强化组(non-HE组)。分析了责任血管狭窄程度、斑块负荷、斑块增强分级等参数与脑梗死复发事件的相关性，并建立脑梗死复发风险模型。

随机从HE组和non-HE组各选取30例行代谢组学分析。用含EDTA的真空管采集外周血样本，静置30分钟后离心(4℃3000rpm 15min)，分离血清置于-80℃冷冻，将质谱检测得到的原始文件(.raw)导入Compound Discoverer3.1(CD3.1)软件中，对每个代谢物进行保留时间、质荷比等参数的简单筛选，然后设置保留时间偏差0.2min和质量偏差5ppm对不同样品进行峰对齐，使鉴定更准确，随后设置质量偏差5ppm、信号强度偏差30％、信噪比3、最小信号强度、加和离子等信息进行峰提取，同时对峰面积进行定量，再整合目标离子，然后通过分子离子峰和碎片离子进行分子式的预测并与mzCloud(https://www.mzcloud.org/)、mzVault和Masslist数据库进行比对，用blank样本去除背景离子，并对原始定量结果进行标准化处理，最后得到代谢物的鉴定和相对定量结果。分别使用3种数据库进行搜库，如KEGG数据库(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)、LIPID Maps数据库(http://www.lipidmaps.org/)和HMDB数据库(https://hmdb.ca/metabolites)注释鉴定到的代谢物，确定差异代谢物的种类。在HE和non-HE组中共检测到1404种不同的代谢物。实验流程图如图2。

2、血清标志物筛选及预测模型建立

由于代谢组数据变量间高度相关，运用传统的单变量统计方法无法准确地挖掘数据信息。需要运用多元统计的方法，对采集的多维数据进行降维和回归分析，筛选差异代谢物。应用metaX软件对数据进行转换后再行偏最小二乘法判别分析(Partial leastsquare-discriminant analysis,PLS-DA)，PLS-DA一种有监督的判别分析统计方法，该方法运用偏最小二乘回归建立代谢物表达量与样品类别之间的关系模型，来实现对样品类别的预测。通过PLS-DA得到每个代谢物的第一主成分的变量投影重要度(Variableimportance in the projection,VIP)值。VIP表示各代谢物对两组分类判别的影响强度和解释能力。将VIP＞1作为差异代谢物筛选标准。单变量分析部分，基于t检验来计算各代谢物在两组间统计学显著性(P值)，并计算代谢物在两组间的差异倍数(fold change)即FC值，FC为正值表示代谢物相对含量升高；负值表示代谢物相对含量降低。差异代谢物筛选的标准为VIP>1，P值<0.05且将FC＞1.2或<0.833。共鉴定出ESI+模式下的169种差异内源性代谢物和ESI-模式下的110种代谢物，总计279个变量，其中125种变量上调，而154种变量下调。

标准分析获得相对较多的差异代谢物，进一步采用机器学习算法的数据处理方法，通过有监督机器学习模型随机森林(Random Forests，RF)及最小绝对收缩率和选择算子(Least absolute shrinkage and selection operator，LASSO)回归分析，利用交叉验证的方法，找出两组之间有统计学意义的差异代谢物，进一步缩小代谢物个数，采用二分类Logistic回归构建脑动脉斑块强化风险预测模型，以斑块不明显强化的研究对象为参照对象，纳入机器学习和非机器学习共同筛选出的预测因子，并找到特异性及灵敏性较高的预测斑块明显强化的潜在生物标志物，绘制ROC曲线评价模型预测效果，找出具有较强判别能力的代谢物组合，通过代谢通路解释代谢物的生物学意义，以确定生物标记物。

本申请应用随机森林的方法并经交叉验证后筛选出16个差异代谢物，通过LASSO回归模型选择24个差异代谢物。具体差异代谢物见表1和表2。

表1随机森林经交叉验证后的16个差异代谢物

表2通过LASSO回归筛选出24种差异代谢物

进一步从中选择了FC＞2或＜0.5的9种差异代谢物：4种磷脂酰胆碱、1种鞘磷脂、2种磷脂酰乙醇胺、1种雄性激素、1种糖类。与non-HE组相比，HE组患者血清样本中磷脂酰胆碱(PC)(15:0/15:1)、PC(14:0/18:2)、磷脂酰乙醇(PE)(18:2/18:3)、PE(18:1e/18:1)、5α-Dihydrotestosterone、D-Fructose 6-phosphate6种血清代谢物含量降低，鞘磷脂(SM)(d28:0/14:1)、PC(20:3/22:6)、PC(20:3/20:4)3种血清代谢物含量升高。见表3。

表3两组间与颅内动脉粥样硬化斑块明显增强相关的血清代谢标志物

利用筛选到的Biomarker进行层次聚类分析，将Biomarker的相对定量值进行归一化转换并聚类，验证其判别能力。9种差异代谢物表达差异的聚类热图，详见图3。本申请发现的潜在生物标志物参与了甘油磷脂代谢、雄激素的转运和代谢、糖酵解及鞘脂代谢，为更加深入了解颅内动脉粥样硬化斑块强化的代谢机制提供了新的方向。

将代谢物相对定量值经Z-score标准化后采用二分类的logistic回归分析，logistic回归分析，可以得到自变量的权重，该权值可以用于衡量生物分子区分不同分组的能力。校正了2个临床变量和9个血清代谢物水平对斑块明显强化的影响。通过正向逐步变量选择分析(Wald试验)，发现5α-二氢睾酮、PC(14:0/18:2)和D-果糖6-磷酸与颅内动脉粥样硬化斑块明显强化显著相关。5α-二氢睾酮(OR:0.044；95％CI:0.004-0.542)、D-果糖6-磷酸(OR:0.062；95％CI:0.005-0.789)、PC(14:0/18:2)(OR:0.031；95％CI:0.001-0.894)浓度升高，斑块不易出现明显增强，详见表4。

表4对伴颅内动脉粥样硬化斑块患者的斑块明显强化的预测因素

综上所述，在脑梗死人群中HE组和non-HE组进行对比，检测磷脂酰胆碱PC(15:0/15:1)、PC(14:0/18:2)、磷脂酰乙醇PE(18:2/18:3)、PE(18:1e/18:1)、5α-Dihydrotestosterone、D-Fructose 6-phosphate其中的一种代谢物含量降低0.5倍以下，指示所述受试者颅内动脉斑块容易出现明显增强，存在斑块不稳定的风险。鞘磷脂SM(d28:0/14:1)、PC(20:3/22:6)、PC(20:3/20:4)这3种血清代谢物含量升高2倍以上，指示所述受试者颅内动脉斑块容易出现明显增强，存在斑块不稳定的风险。经过系统筛选，5α-二氢睾酮、D-果糖6-磷酸和磷脂酰胆碱PC(14:0/18:2)的组合血清生物标志物降低越明显，指示所述受试者颅内动脉斑块越容易出现明显增强。

为了评估代谢物对两个组别的诊断效能，根据Biomarker确证的机器学习模型，分别生成对应的受试者特征曲线下面积(Area under curve，AUC)分析评估生物标志物预测能力，AUC值用于评价分类模型的标准为AUC＝1模型可以完美分类，绝大多数预测的数据都不存在完美分类；0.50.5时，AUC值越接近于1，预测的准确性越高。通常来说，AUC值在0.5～0.7时预测准确性较低，AUC值在0.7～0.9时有一定预测准确性，AUC值在0.9以上时有较高预测准确性。AUC值越大说明该代谢物区分HE组和non-HE组的灵敏度越高，9种标记物，AUC的值均大于0.75，表明他们的预测能力较好。将斑块明显强化作为状态变量，3个独立危险因素作为检验变量，得到联合的ROC曲线，AUC为0.980。详见图4。

3血清代谢标志物进行评估脑梗死患者颅内动脉粥样硬化斑块稳定性的应用

对受试者进行采集血样非靶向代谢组学分析，根据目前的研究，在急性脑梗死队列中，HE组和non-HE组进行对比，检测磷脂酰胆碱PC(15:0/15:1)、PC(14:0/18:2)、磷脂酰乙醇PE(18:2/18:3)、PE(18:1e/18:1)、5α-Dihydrotestosterone、D-Fructose 6-phosphate其中的一种代谢物含量降低0.5倍以下，指示所述受试者颅内动脉斑块容易出现明显增强，存在斑块不稳定的风险。鞘磷脂SM(d28:0/14:1)、PC(20:3/22:6)、PC(20:3/20:4)这3种血清代谢物含量升高2倍以上，指示所述受试者颅内动脉斑块容易出现明显增强，存在斑块不稳定的风险。经过系统筛选，5α-二氢睾酮、D-果糖6-磷酸和磷脂酰胆碱PC(14:0/18:2)的组合血清生物标志物降低越明显，指示所述受试者颅内动脉斑块越容易出现明显增强。

根据既往研究证据表明，血管壁的强化可能是内皮细胞损伤、炎症反应、斑块内新生血管或斑块破裂引起血栓形成的结果，斑块增强通常被认为是斑块不稳定特征。我们的研究发现脑梗死年复发风险与斑块明显强化显著相关，进而本研究发现上述血清生物标记物可以应用于预测脑梗死复发风险。在脑梗死的二级预防中，HR-MRI的图像已被用作确定脑梗死患者病因、发病机制以及选择个体防治措施的可靠依据，但是依然存在成本高、普及范围小、需要静脉注射造影剂等缺点，影响其在脑梗死患者的常规筛查和推行，我们的研究发现血清生物标记物也可以预测颅内粥样硬化斑块的稳定性及脑梗死复发情况，且简单、高效、花费低，并且灵敏度高，因此血清生物标记物可以作为颅内斑块不稳定和发生脑梗死风险的标志物。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权力要求书确定的保护范围内。