用于医学的人血小板裂解物来源细胞外囊泡

本申请是申请号为201780035263.8、发明名称为“用于医学的人血小板裂解物来源细胞外囊泡”的中国专利申请的分案申请，该母案申请是2017年6月7日提交的PCT国际专利申请PCT/EP2017/063868进入中国国家阶段的申请。

技术领域

本发明涉及人血小板裂解物或富集人血小板裂解物来源细胞外囊泡的级分及其在医学中的用途，特别是用于预防和/或治疗炎症驱动的疾病、神经变性疾病、免疫/自身免疫病、心血管疾病、皮肤病、矫形外科疾病、组织再生医学、肿瘤疾病、感染性疾病、移植排斥、卒中、缺血或移植物抗宿主病。

背景技术

已知人血小板裂解物(human platelet lysate，hPL)是人细胞培养中胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的替代补充物。其通常出于实验和临床目的而用于补充人间充质干细胞培养中的基础培养基。与传统使用的FBS相比，hPL是有利的，因为其不含异源物(xenogen)，并因此适合于产生用于细胞治疗的治疗性产品。hPL呈现为浑浊的浅黄色液体，其获自通过冷冻/解冻循环对人血小板进行的裂解。凭借血小板的生理组织修复功能，血小板是多种生物活性分子的丰富来源，所述生物活性分子例如生长因子、细胞因子(包括趋化因子和白介素)、其他代谢物和细胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)。在储存和裂解期间，血小板释放大量生长因子和尺寸为约40至1000nm的细胞外囊泡(EV，例如外排体(exosome)、微泡(microvesicle)、凋亡小体)。这些分泌的囊泡被称为人血小板裂解物来源细胞外囊泡(human platelet lysate derived extracellular vesicle，hPLEV)。在过去数年中，数种hPL相关GMP产品进入市场，目的是用于细胞培养体系，例如，来自Stem CellTechnologies、Macopharma、COMPASS Biomedical和PL BioSciences的产品。最近，图宾根临床输血医学中心(Center for Clinical Transfusion Medicine in Tübingen)已通过图宾根当地政府机关根据德国药品法(German Drug Law，AMG)获得人血小板裂解物的制造许可证。这样的hPL制品根据其在人中使用的监管要求是干细胞培养所需的。与此同时，hPL是用于培养人干细胞(尤其是间充质干细胞)的金标准。在GMP洁净室条件下获得的人血小板裂解物被认为是用于药物制造(例如用于临床试验或用于制造许可用于细胞治疗的药物产品)的“人源原料”。

虽然hPL在干细胞培养中的价值是公认的，但hPL中单因子(例如生长因子和EV)的特性尚未得到详细分析。虽然来自hPL的EV尚未被认为具有临床意义，但来源于不同干细胞(例如MSC)的EV越来越多地成为临床和治疗兴趣的焦点。

已知EV在细胞之间、器官之间和甚至生物体之间传递信息，并且已经在多种体液(例如血液、尿、脑脊液、母乳和唾液)中检测到。外排体和微泡构成最显著描述的EV种类。其被磷脂膜包围，并且包含以下的细胞类型特异性组合：蛋白质，包括酶、生长因子、受体和细胞因子；以及脂质；编码和非编码RNA、mRNA、微RNA(miRNA)或甚至少量DNA；以及代谢物。外排体限定为内体区室的尺寸为70至170nm(+/-20nm，这根据文献和分析技术而不同)的衍生物。由于平均尺寸为100至1000nm，微泡代表通过质膜向外出芽形成的一类较大EV。在本申请中，术语EV包含所有上述囊泡。

目前，显示只有干细胞来源EV被广泛认为和讨论具有根据治疗目的的治疗潜力。WO 2012/053976公开了使用由人间充质干细胞分泌的外排体来促进毛发生长和创伤愈合。这些作用结合外排体免疫调节负荷而公开。WO 2012/053976推测了外排体制剂的免疫调节作用。

WO 2014013029 A1涉及来源于新生儿或成人组织来源间充质干细胞(mesenchymal stem-cell，MSC)的外排体制剂用于预防或治疗炎性病症例如出生前和出生后获得性脑损伤(即神经元损伤)或干细胞移植后免疫并发症(“移植物抗宿主病(Graftversus Host-Disease)”，GvHD)的用途。

由Thomas Leneret等在2015年通过ISEV(国际细胞外囊泡学会(TheInternational Society of Extracellular Vesicles))发表在Journal ofExtracellular Vesicles的最新意见论文(Applying extracellular vesicles basedtherapeutics in clinical trials.4:30087)描述了最近讨论的具有治疗潜力的EV来源。用于再生医学的正在研究的细胞来源是内皮细胞和内皮集落形成细胞，包括来自脐静脉的人内皮细胞和晚期内皮细胞。此外，能够分化成骨髓样细胞和淋巴样细胞的造血祖细胞可发挥促血管生成功能。神经干细胞(neural stem cell，NSC)已用于多种神经病症和神经炎性病症(例如卒中、多发性硬化(multiple sclerosis，MS)或脊髓损伤)的临床前模型。然而，很明显，与MSC类似，NSC也以旁分泌和全身方式而不是通过迁移到病变部位来发挥其治疗作用。在这种情况下，NSC来源EV被认为与宿主的免疫系统相互作用以介导神经保护和免疫调节。神经保护和神经再生也可由从神经系统的驻留胶质细胞释放的EV介导。最后，非常新近的研究描述了从诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)的EV分离，其将RNA和蛋白质转移到心脏细胞中的能力，以及其在缺血性心肌中的体内治愈能力。此外，iPSC可用作以扩展方式培养体干细胞用于大规模EV产生的来源，或者用作获得很难从主要供体材料获得的作为EV来源的细胞(例如人NSC)的来源。在这种情况下，来自iPSC来源MSC的EV已显示使肢体缺血减轻。讨论了iPSC和EV技术的组合可能在未来提供新的治疗选择。

为了概述上述近期意见论文(Journal of Extracellular Vesicles 2015,4:30087)中给出的内容，必须强调的是，来源于hPL的EV的治疗潜力未被考虑。

来源于人干细胞(例如MSC、NSC或iPSC)的EV不易获得，因为干细胞培养复杂、昂贵并且用于药物大规模制造的来源有限。

在Torreggiani等的出版物(2014,European Cells and Materials第28卷,137-151)中讨论了hPL来源外排体可能被认为是人血小板裂解物活性的新效应物。Torreggiani等讨论了血小板来源外排体用于骨再生的用途。在他们的研究中，结合MSC细胞培养支持研究了PL来源外排体的作用。然而，Torreggiani等中描述的制剂显示不符合可靠提取EV的品质标准。

此外，在大多数使用MSC来源EV的临床研究中，MSC在补充hPL的培养基中培养，其中未提出或讨论hPLEV的潜在协同效应。在现有技术中，将在MSC来源EV研究中观察到的作用归因于MSC来源EV，即使hPL用作间充质干细胞培养中基础培养基的补充物。

此外，有许多关于富血小板血浆(Platelet Rich Plasma，PRP)之用途的科学论文、专利申请和专利，例如，Eppley BL等(2006),Plast Reconstr Surg 118(6):147e-159e；Mishra AK等(2012),Curr Pharm Biotechnol 13(7):1185-1195；以及Carlson NE等(2002),J Am Dent Assoc 133(10):1388-1386。PRP由从患者全血经离心以去除红细胞和其他不想要组分而获得的浓缩活血小板和血浆组成。其比全血具有更高浓度的生长因子，并且已在多个学科(包括牙科、骨外科(orthopedic surgery)和运动医学)中用于组织注射。

然而，直至现在2016年，基础科学和临床前试验的结果尚未在大规模随机化对照试验中得到确定。在2009年的综述中，对科学文献进行了系统筛选，并且发现只有少数随机化对照试验充分地评价了PRP治疗的安全性和效力。PRP被认为是“关节、肌腱、韧带和肌肉损伤的有前途但未经证实的治疗选择”(另参见Foster等(2009).Am J Sports Med 37(11):2259-72)。

关于PL的使用，如在WO20130765507中已经描述了其在创伤愈合领域中的具体应用，该申请描述了包含血小板裂解物的药物组合物及其用于治疗创伤、肛裂、阴道萎缩或皱纹的用途。在Fontana等(2016)ASC Appl Mater Interfaces 8(1):988-996中描述了用于在创伤愈合应用中提高细胞增殖的经PL-修饰硅微粒。

总之，显示在PRP相关的现有技术中，未描述将hPL或hPLEV用于创伤愈合应用之外的临床应用。

因此，就本领域而言，迫切需要允许使用PRP和PL作为来源进行简单、廉价、可靠且高效的治疗的手段和方法。同样适用于不基于复杂且昂贵的干细胞培养体系的基于EV的治疗。

本发明的目的是满足上述需求并且提出将hPL来源EV作为医学中(特别是治疗、再生和预防医学中)的新工具。

发明内容

本发明涉及包含人血小板裂解物或富集人血小板裂解物来源细胞外囊泡的级分(该级分在下文中也缩写为hPLEV)的药物制剂，其用于医学，特别是用于预防和/或治疗急性或/和慢性炎性疾病和免疫病(还包括自身免疫病和由移植排斥引起的疾病(例如GvHD))、神经疾病和神经变性疾病(卒中、缺血)、皮肤病、心血管疾病、矫形外科疾病(orthopaedic disease)、感染性疾病、癌症疾病、组织再生(实体器官、中空结构、损伤)。

本发明还涉及人血小板裂解物或富集人血小板裂解物来源细胞外囊泡的级分的美容应用。这些应用包括：美容皮肤相关的抗炎治疗、损伤或烧伤后皮肤再生、皮肤抗衰老治疗、以及脱发的预防和治疗。

本发明还涉及人血小板裂解物或富集人血小板裂解物来源细胞外囊泡的级分的诊断应用。

本发明还涉及制备药物制剂或诊断制剂或美容制剂的方法，其包括以下步骤：向药物制剂或诊断制剂或美容制剂添加人血小板裂解物或富集人血小板裂解物来源细胞外囊泡的级分。

尽管通过用hPLEV替代干细胞来源EV在生物学意义、成本和努力方面存在许多优点，但这样的替代在现有技术中从未被建议过。由于hPL来源于人血液/血浆，因此与MSC、ESC、NSC或其他干细胞类型相比，其来源是可再生且易于获得的。因此，hPLEV比来源于干细胞培养物的EV更容易获得且更廉价。本发明相对于对应的干细胞培养物来源EV的另一个优点是以下事实：血小板不需要洁净室条件并且不需要对细胞实体进行耗时且昂贵的流式细胞术表征。另外，产生用于医院和诊所应用并且在数天后过期的过多人血小板浓缩物制品仍然可用于产生hPL而不是将其丢弃。

此外，本发明涉及这样的hPL，其由过期、冷冻和储存的血小板产生，特别地不晚于收集之后七天，所述hPL立即而不是以活血小板的延缓释放方式提供血小板的活性组分。因此，本发明的一个重要方面涉及hPL或hPLEV用于医学或美容治疗的用途，作为相对于活血小板使用(例如富血小板血浆治疗)显示出令人惊讶的优点的使用替代，hPL或hPLEV治疗具有令人惊讶的优点。

值得注意的是，本发明首次描述了将人血小板裂解物或富集人血小板裂解物来源细胞外囊泡的级分直接用于医学，特别是用于预防和/或治疗急性或/和慢性炎性疾病和免疫病(还包括自身免疫病和由移植排斥引起的疾病(例如GvHD))、神经疾病和神经变性疾病(卒中、缺血)、皮肤病、心血管疾病、矫形外科疾病、感染性疾病、癌症疾病、组织再生(实体器官、中空结构、损伤)和其中抗微生物治疗有利的疾病。

本发明首次教导了将人血小板裂解物或富集人血小板裂解物来源细胞外囊泡的级分直接用作药物并用于美容应用。这些应用包括美容皮肤相关的抗炎治疗、抗微生物治疗、损伤或烧伤后的皮肤再生、皮肤抗衰老治疗、以及脱发的预防和治疗。

本发明首次提出了hPL或hPLEV作为药物的新用途，其可以以低成本制造，是具有高度医疗品质的无异源和细胞的产品，而不需要临床细胞培养中间体。

具体实施方式

为了支持对本发明的理解，下面限定了数个术语。除非另外限定，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文中描述的那些类似或等同的任何方法和材料均可用于权利要求书的实践或测试，但本文中描述了一些示例性方法和材料。

此外，除非上下文明确要求存在一个且仅一个要素，否则通过没有数量词修饰的名词来提及要素并不排除存在多于一个要素的可能性。因此，没有数量词修饰的名词通常意指“至少一个/种”。

术语“约”意指在一个或更多个值例如所述的浓度、长度、分子量、pH、时间框架、温度、压力或体积的统计学上有意义的范围内。这样的值或范围可在给定值或范围的数量级内，通常在20％内，更通常在10％内，并且甚至更通常在5％内。“约”所涵盖的可允许变化取决于所研究的特定系统。

除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。

除非本文中另有说明，否则本文中对数值范围的记载仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且包括限定该范围的端点边界，并且每个单独值并入本说明书中，如同其在本文中单独记载一样。

在本发明的背景下，hPL意指具有有益的治疗或美容作用的任何种类的人血小板裂解物/人血小板裂解物的合并物。血小板(也称为凝血细胞)是血液中不规则的圆盘状元件，其有助于凝血。在正常凝血期间，血小板通过聚集而凝集。虽然血小板通常被归类为血细胞，但其没有细胞核。其来源于位于/定位于骨髓中的称为巨核细胞的大细胞。为了产生hPL，将血小板裂解并且借此将其内容物释放到周围的血浆中。血小板的裂解可通过冷冻和解冻循环实现。在现有技术中可找到合适的方案。

在人血小板裂解物中含有高含量的一种生物组分是EV。由于EV存在于大多数体液中，因此血浆来源EV可来源于不同的细胞类型，例如白细胞、红细胞、树突细胞(dendriticcell，DC)、血小板、肥大细胞、上皮细胞、内皮细胞和神经元。在一方面，hPL可含有血浆来源EV，这些EV在献血时已经存在于血浆中。在另一方面，hPL可能含有大量的特异性血小板来源EV，其在血小板浓缩物制品的储存时间期间由活凝血细胞分泌。在20℃至24℃下近一周的储存时间期间，细胞继续将其特异性EV分泌到周围的血浆中。当达到凝血细胞浓缩物的有效期并且血液制品可用于其他目的(例如血小板裂解物制品的产生)时，这种特异性EV富集应仍然存在于裂解物中，可将裂解物进一步加工以获得hPLEV富集级分。另外，血小板通过裂解而破裂并且将其可溶性内部组分释放到血浆中。

EV的蛋白质谱根据其细胞来源而不同。

用于表征血小板的特异性CD标志物是在激活之前出现在血小板表面上的表面标志物CD9、CD41b、CD42a、CD42b和CD61。

还有在激活期间出现在血小板表面上的标志物，例如PAC-1、CD62P、CD31、CD63和内居蛋白(Syntenin)。

来自血小板或内皮细胞的外排体可例如通过典型表面标志物(例如CD31＝血小板内皮细胞黏附分子-1或CD62P＝P-选择素)的表达来鉴定。这些标志物对应于分泌细胞实体上的表面标志物。血浆EV可来源于不同的细胞亚群，并因此也可包含不同的标志物子集。

另一点是hPL含有在凝血细胞浓缩物储存期(20℃至24℃)期间在4至6天后到达有效期之前从活凝血细胞释放的EV。因此，hPL含有很大一部分来源于人血小板的EV。与正常血浆制品相比，由已过期凝血细胞浓缩物产生的血小板裂解物高度富集血小板EV。在随后用处理进行裂解的时间点时，在去除细胞和其他细胞组分的同时，浓缩物的所有可溶性旁分泌因子被保留。

EV用作多种生物分子的载体，所述生物分子包括脂质、蛋白质(例如转录因子、细胞因子、生长因子)和核酸(例如mRNA、微RNA(miRNA)或甚至少量DNA)。

外排体的脂质组分包括膜脂，例如鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、神经节苷脂(GM3)、磷脂酰肌醇、前列腺素和溶血双磷脂酸(lysobisphosphatidicacid)。

此外，除脂质和蛋白质之外，外排体还可含有核酸，包括mRNA、miRNA和多种其他小非编码RNA物类，包括与蛋白质编码区重叠的RNA转录物、重复序列、结构RNA、tRNA、rRNA、穹窿体RNA(vault RNA)、Y RNA和小干扰RNA(siRNA)以及线粒体DNA和反转录转座子(retrotransposon)的短DNA序列。

如本文中使用的术语“核酸”通常包含各自为单链和/或双链形式、线性或环状的多核糖核苷酸(RNA)和多脱氧核糖核苷酸(DNA)，或其混合物，包括杂交分子。RNA可包括但不限于信使RNA(mRNA)、非编码RNA(nc-RNA，包括反义RNA)、沉默RNA、微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、重复相关的小干扰RNA(rasiRNA)、ptwi相互作用RNA(piRNA)、Y RNA、长非编码RNA(长ncRNA、lncRNA))、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁核糖核酸(snoRNA)、剪接前导RNA(SL RNA)。所有上述RNA原则上都可考虑作为EV组分，并且可在本发明的方法中利用。

EV还包含蛋白质和肽。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用。术语“多肽”是指通常含有至少20个(并且优选至少30个，例如至少50个)氨基酸或者由其组成的蛋白质或肽。术语“肽”是指含有至少2个氨基酸至约19个氨基酸或者由其组成的寡聚体。

最常识别的EV蛋白质是膜转运蛋白和融合蛋白(例如，GTP酶，例如Rab5、膜联蛋白和筏蛋白(flotillin))、热休克蛋白(例如，HSC70)、四次穿膜蛋白(tetraspanin)(例如，CD9、CD63和CD81)、来自MVB-生物发生的蛋白质(例如，Alix和TSG101)、脂质相关蛋白和磷脂酶、细胞骨架蛋白(肌动蛋白、丝切蛋白-1(cofilin-1)、埃兹蛋白/根蛋白/膜突蛋白(ezrin/radixin/moesin)、组装抑制蛋白-1(profilin-1)和微管蛋白)、代谢酶和核糖体蛋白。数种蛋白质被认为是外排体标志物，其中四次穿膜蛋白(例如CD63、CD81)和TSG101(ESCRT复合物的蛋白质)是最常用的检测标志物。

虽然后者通常用作外排体的标志物，但其可以不是外排体所独有的，并且可在其他细胞外囊泡上发现。

在本发明的情况下，hPL包含任何可在治疗、诊断或美容应用方面可用的人血小板裂解物。优选地，其是根据GMP条件产生的hPL，并且优选地其是根据德国药品法(AMG)制造的。hPL的来源可来源于单供体捐献的血小板或合并的供体捐献的血小板。可优选地使用来源于特定年龄的献血者(例如来源于10至60岁、18至50岁、18至40岁、18至30岁、或18至20岁献血者)的hPL。在精确医学的背景下，可有利的是用来自患者自身血液捐献的人血小板裂解物或富集人血小板裂解物来源细胞外囊泡的级分对其进行治疗。根据本发明的一个优选实施方案，hPL来源于健康个体。

为了避免误解，与进行任何EV富集、分离或纯化方法之前的血浆EV相比，hPL通常富集人血小板来源细胞外囊泡。在本发明的背景下，术语“富集人血小板裂解物来源细胞外囊泡的级分”意指通过EV富集、分离或纯化方法中的至少一个步骤对hPL进行处理。在该富集、分离或纯化步骤之后，“富集人血小板裂解物来源细胞外囊泡的级分”含有较少的非EV污染物。

hPL或富集hPL的级分可从已在裂解之前用来自现有技术(例如与PRP治疗相关的现有技术)的一种或更多种已知为凝血细胞激活剂的化合物孵育的血小板获得，所述化合物激活血小板并因此提高本发明制剂的品质。

根据本发明的一个实施方案，hPL可来源于人脐带血。人脐带血血小板裂解物制剂是现有技术已知的(例如US 8501170 B2；Parazzi,V.,C.Lavazza,等(2015)；或Forte,D.,M.Ciciarello,等(2015))。

出于本发明的目的，术语“分离”以其所有语法形式涉及使EV与其环境(例如，血清或血浆样品)分开或者从其环境中回收EV的行为。所有语法形式的术语“纯化”涉及从所期望的EV中(基本上)降低/耗尽(非EV)污染物的行为。所有语法形式的术语“富集”意指提高EV在其相应溶剂中的比例。

本发明描述的hPL或富集hPLEV的级分可用于医学。根据本发明的一个实施方案，hPL或富集hPLEV的级分用于预防和/或治疗炎症驱动的疾病(inflammatory drivendisease)。炎性异常包含构成多种人疾病之基础的一大组病症。免疫系统常常参与表现出变态反应和一些肌病二者的炎性病症，其中许多免疫系统病症导致异常炎症。病因起源于炎性过程的非免疫性疾病包括癌症、动脉硬化和缺血性心脏病。很多种蛋白质参与炎性过程。其中任一种都可能由于基因突变而被修饰，导致正常蛋白质功能或蛋白质表达受损或调节异常。与炎症相关的病症的一些实例包括：寻常痤疮、哮喘、自身免疫病、乳糜泻、慢性前列腺炎、肾小球肾炎、超敏反应、炎性肠病、盆腔炎性疾病、再灌注损伤、类风湿性关节炎、结节病、移植排斥、血管炎和间质性膀胱炎。许多疾病被认为伴随着炎症或被归类为自身免疫病。一些不同类型的炎性疾病包括：痛风、狼疮、哮喘、胸膜炎、湿疹、关节炎、胃炎、脾炎、窦炎、肝炎、肾炎、银屑病、血管炎、喉炎、甲状腺炎、前列腺炎、咽炎、结节病、动脉粥样硬化、变态反应、多发性硬化、一些肌病、类风湿性关节炎、脂溢性皮炎、韦格纳肉芽肿病(Wegener’sgranulomatosis)、肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS；克罗恩病(Crohn’s disease))、溃疡性结肠炎、憩室炎。

根据本发明的一个实施方案，hPL或富集hPLEV的级分用于预防和/或治疗神经变性疾病，例如但不限于阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease)、肌萎缩侧索硬化、皮质基底节变性、额颞痴呆、HIV相关性认知损伤、亨廷顿病(Huntington’s disease)、路易体痴呆(Lewy body dementia)、轻度认知损伤、后皮质萎缩、原发性进行性失语、进行性核上性麻痹和血管性痴呆。

根据本发明的一个实施方案，hPL或富集hPLEV的级分用于预防和/或治疗免疫/自身免疫病，例如但不限于艾迪生病(Addison disease)、乳糜泻-口炎性腹泻(sprue)(麸胶敏感性肠病)、皮肌炎、格雷夫斯病(graves disease)、桥本甲状腺炎(Hashimotothyroiditis)、多发性硬化、重症肌无力、恶性贫血、反应性关节炎、类风湿性关节炎、舍格伦综合征(

根据本发明的一个实施方案，hPL或富集hPLEV的级分用于预防和/或治疗心血管疾病，例如但不限于冠心病、脑血管病、外周动脉疾病、风湿性心脏病、先天性心脏病、深静脉血栓和肺栓塞。

根据本发明的一个实施方案，hPL或富集hPLEV的级分用于预防和/或治疗皮肤病，例如但不限于痤疮、湿疹(特应性湿疹)、指甲真菌感染、疱疹和银屑病。

根据本发明的一个实施方案，hPL或富集hPLEV的级分用于预防和/或治疗矫形外科疾病，例如但不限于类风湿性关节炎、滑囊炎、肘部疼痛和问题、肘管综合征、外上髁炎(网球肘)、内上髁炎(高尔夫球球员肘或棒球肘)、纤维肌痛、足部疼痛和问题、骨折、髋部骨折、下背痛、手部疼痛和问题、腕管综合征、膝疼痛和问题、膝韧带损伤、半月板撕裂、脊柱后凸、颈部疼痛和问题、骨质疏松症、佩吉特骨病(paget’s disease of the bone)、脊柱侧弯、肩部疼痛和问题、软组织损伤。

根据本发明的一个实施方案，hPL或富集hPLEV的级分用于组织再生医学的预防和/或治疗。组织工程从生物材料开发领域发展而来，并且是指将支架、细胞和生物活性分子组合为功能性组织的实践。组织工程的目标是组装恢复、维持或改善受损组织或整个器官的功能性结构体。人工皮肤和软骨是已经被FDA批准的工程化组织的实例，然而，其目前在人患者中的使用有限。再生医学的领域广泛，其包括组织工程，但也并入对自愈的研究，在自愈中身体使用其自身的系统来再产生细胞并且重建组织和器官，有时由外来/同种异体生物材料支持。术语“组织工程”和“再生医学”在很大程度上是可互换的，因为该领域希望集中于对复杂且通常是慢性的疾病的治愈而不是治疗。

根据本发明的另一个实施方案，hPL或富集hPLEV的级分用于预防和/或治疗肿瘤疾病，例如但不限于膀胱癌、骨癌、乳腺癌、结肠/直肠癌、霍奇金病(Hodgkin disease)、白血病、肝癌、肺癌、皮肤淋巴瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkinlymphoma)、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤-成人软组织癌、皮肤癌、小肠癌和胃癌。

根据本发明的另一个实施方案，hPL或富集hPLEV的级分用于预防和/或治疗移植排斥。根据本发明的另一个实施方案，hPL或富集hPLEV的级分用于预防和/或治疗卒中、缺血或移植物抗宿主病。

根据一个优选实施方案，所述疾病可选自目前通过细胞治疗进行治疗的疾病的组群，所述细胞治疗例如但不限于同种异体细胞治疗、人胚胎干细胞治疗、神经干细胞治疗、间充质干细胞治疗的应用和造血干细胞移植应用。

同种异体细胞治疗试图开发这样的产品以治疗包括克罗恩病和多种血管疾病在内的病症。人胚胎干细胞研究已被用作许多治疗应用(包括可能的糖尿病和帕金森病(Parkinson’s disease)治疗)的基础。在神经干细胞治疗中，神经干细胞(NSC)是可能的治疗应用(例如治疗许多神经病症(例如帕金森病和亨廷顿病))的持续研究的主题。间充质干细胞治疗用于广泛多种治疗，包括免疫调节治疗、骨和软骨再生、心肌再生以及胡尔勒综合征(Hurler syndrome)、骨骼和神经病症的治疗。

根据本发明的另一个实施方案，hPL或富集hPLEV的级分可用于预防或治疗感染性疾病，特别是由细菌、病毒、真菌或寄生物引起的感染性疾病。一个优选实施方案是治疗皮肤病学中的感染性疾病，例如蜂窝织炎、丹毒、化脓性汗腺炎、脓疱病和臁疮、淋巴结炎、淋巴管炎、坏死性皮肤感染或葡萄球菌性烫伤样皮肤综合征。

本发明制剂的另一个优选应用是在其中现有技术中描述了血小板治疗或富血小板血浆治疗具有积极作用的适应证的背景下的应用。从现有技术中已知，血小板在健康和疾病二者中的重要免疫和炎症相关功能越来越受到重视。许多研究已表明，血小板对炎性过程的影响范围从动脉粥样硬化到感染性疾病，使血小板成为具有免疫功能的数量最多的循环细胞类型。血小板通过接触依赖性机制直接地和通过分泌的免疫介质的机制间接地与白细胞和血管内皮细胞相互作用。因此，血小板介导的免疫作用在血小板激活和沉积部位处局部发生，或者在远离血小板激活本身的位置处全身性地发生。

血小板公知为血栓形成的细胞介质(参见Craig N.Morrell等2014.“Emergingroles for platelets as immune and inflammatory cells”Blood:123(18))。在该文章中，描述了现在越来越多地认识到血小板在健康和疾病二者中的重要免疫和炎性作用。许多研究已表明，血小板对炎性过程的影响范围从动脉粥样硬化到感染性疾病，使血小板成为具有免疫功能的数量最多的循环细胞类型。血小板通过接触依赖性机制直接地和通过分泌的免疫介质驱动的机制间接地与白细胞和血管内皮细胞相互作用。因此，在血小板激活和沉积部位处局部地或者在远离血小板激活本身的位置处全身性地注意到血小板免疫作用。Craig N.Morrell等得出结论，血小板与炎性细胞的相互作用可介导促炎结果，但这些相互作用可能已经演变为对限制感染有益。例如，对于皮肤中的裂口，其暴露于病原体，并且通过将血栓形成功能和免疫募集功能组合，血小板可帮助局灶止血和针对潜在感染原的免疫应答以防止病原体入侵。然而，血小板与白细胞或内皮细胞的持续或长期相互作用可导致来自过度免疫刺激和炎性损伤的不良作用，参见Craig N.Morrell等(2014)。从现有技术中已知，血小板在轴突再生、创伤愈合和疼痛减轻的背景下具有积极作用(Kuffler DP等,Mol Neurobiol.2015年10月；52(2):990-1014)。

根据本发明，已发现，通过使用hPL或hPLEV代替活血小板，血小板的重要免疫和炎性作用可被部分替代，并且可改善再生特性。

一些优选的适应证因此包括创伤愈合、组织再生、神经损伤、腱炎、骨关节炎、心肌损伤、骨修复和再生以及整形外科和口腔外科。

根据本发明的另一个实施方案，该制剂是无细胞的。在本发明的背景下，无细胞意指制剂基本上不含活的完整细胞和细胞碎片。本发明的hPLEV-级分优选地是无细胞制剂，其富集EV，而其他组分降低。

根据本发明的另一个实施方案，hPL或富集hPLEV的级分是制剂中的必需药物活性成分。

必需药物活性成分意指hPL或富集hPLEV的级分在施用于人时具有治疗价值或其他价值。必需药物活性成分还意指除人血小板裂解物、hPL-组分或富集人血小板来源细胞外囊泡的级分之外，制剂基本上不含其他药物活性成分。

除人血小板裂解物或富集人血小板裂解物来源细胞外囊泡的级分之外，根据本发明的制剂还可包含一种或更多种赋形剂。这样的赋形剂可以是与活性成分一起配制的天然或合成物质，例如为了长期稳定化，使含有强效活性成分的固体制剂体积增大(因此通常称为“膨胀剂”、“填充剂”或“稀释剂”)，或对最终剂型中的活性成分赋予治疗性增强，例如促进药物吸收、降低黏度或提高溶解度。赋形剂也可用于制造过程，以有助于处理有关的活性物质，例如通过促进粉末流动能力或不黏特性；此外还有助于体外稳定性，例如防止在预期的货架期中变性或聚集。对合适赋形剂的选择还取决于施用途径和剂型，以及活性成分和其他因素。

根据本发明的另一个实施方案，富集人血小板裂解物来源细胞外囊泡(外排体)的级分中的细胞外囊泡的尺寸为约70至200nm，优选约70至140nm，或更优选约70至120nm。“约”应意指+/-20％的偏差。还优选的是，外排体对特征性EV-或外排体-标志物呈阳性，并且甚至还优选的是，药物制剂的蛋白质含量高于0.5mg/ml，优选高于1mg/ml。

hPLEV标志物包括热休克蛋白(例如，HSC70)、四次穿膜蛋白(例如，CD9、CD10、CD26、CD53、CD63、CD82)、来自MVB-生物发生的蛋白质(例如，Alix和TSG101)、EpCAM或Rab5，但基本上缺乏CD81(其通常是一般的EV表面标志物)、CD2、CD8、CD11a和CD25(Koliha等，2016)。

根据本发明的另一个实施方案，细胞外囊泡对以下至少一种EV标志物或外排体标志物呈阳性：CD9、CD41a、CD41b、CD42b、CD61、CD62P和CD63。优选地，细胞外囊泡对上述EV标志物或外排体标志物中的2、3、4、5、6或7种呈阳性。

根据本发明，呈阳性意指当根据Koliha,Nina等(2016)描述的方法进行基于珠的多重平台分析时上述阳性表面标志物之一的背景介质荧光强度高于来源于NK细胞的细胞外囊泡的比较例。

或者，可应用用于上述标志物的特异性蛋白质检测的其他技术，例如Western印迹分析。

根据本发明的另一个实施方案，细胞外囊泡对以下至少一种表面标志物呈阴性：CD81、CD3、CD4、CD19、CD20、CD2、CD8、CD11a和CD25。优选地，细胞外囊泡对上述细胞外排体标志物中的2、3、4、5、6、7、8或9种呈阴性。

为了证明hPLEV富集级分的品质，应满足关于所包含EV的生物和生物物理特性的数个一般表征标准。用于这样的表征的现有技术是由国际细胞外囊泡学会(InternationalSociety for Extracellular Vesicles，ISEV)推荐的准则和标准。基于EV领域的最新科学知识，这些标准应用于将任何特异性生物负荷或功能归因于EV。

1.使用BCA测定、如Bradford-测定的类似测定、或基于光谱测定的仪器(如“NanoDrop”)通过标准蛋白质定量方法确定蛋白质含量[mg/ml]。

2.使用纳米颗粒追踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis，NTA)平台(例如Nanosight和Zetaview)或图像流流式细胞术(例如“Amnis”，其允许在单颗粒水平上对EV进行分析)来确定平均颗粒尺寸[nm]和尺寸分布[曲线]。

3.包括EV-或外排体蛋白质的典型EV标志物蛋白的半定量检测(SDS-PAGE、Western印迹、用特异性抗体检测、信号检测)。一般来说，EV含量高度依赖于细胞来源，产生细胞系的预处理和制备方法。然而，EV(例如外排体)提供了可用于其表征的一组常见的通常预期的标志物。最常用的标志物是四次穿膜蛋白(CD9、CD63、CD81)、内体来源蛋白或膜结合蛋白(TSG101、膜联蛋白、Rab、内居蛋白、筏蛋白)和伴侣蛋白(HSC70、HSP90)。在PL-EV的情况下，特征性地，其缺少CD81。

4.通过细胞裂解物和PL-EV级分的半定量比较确定纯度。PL-EV级分应不含有细胞残余物，例如来自内质网(例如Grp94、钙连蛋白)、高尔基体(例如GM130)或线粒体(例如抗增殖蛋白(prohibitin)、细胞色素C)的蛋白质。这样的标志物可用作阴性标志物。另外，核蛋白(组蛋白、argonaute/RISC复合物)可用作阴性对照的实例。

对于3+4：用于检测典型EV标志物的分析方法可包括Western印迹(WB)、(高分辨率)流式细胞术或使用质谱技术的全蛋白质组学分析。对PL-EV富集级分的另外的表征基于以下方法：

蛋白质组学

用于hPLEV的蛋白质谱分析的分析方法(包括Western印迹(WB)、(高分辨率)流式细胞术或使用质谱的全蛋白质组学分析)也是用于表征其他EV标志物(例如免疫标志物、信号传导标志物、细胞因子和其他相关生物活性蛋白内容物)的现有技术。

来自hPLEV的RNA的微阵列分析

对于hPLEV RNA的谱分析，可应用微阵列技术。微阵列是用于使用基于载片或芯片的介质分析已知核酸片段的表达的已充分确立的技术。微阵列可用于筛选mRNA、miRNA和长非编码RNA(lncRNA)物类。

脂质组学

囊泡膜中的脂质和脂筏相关蛋白提供具有稳定性和结构完整性的细胞外囊泡。与其来源细胞相比，hPL-EV应存在类似的脂质组成。

PL-EV可富含磷脂酰丝氨酸、二饱和磷脂酰乙醇胺、二饱和磷脂酰胆碱、鞘磷脂、神经节苷脂和胆固醇。为了确定脂质组成和比例，可使用质谱、流式细胞术或其他常规测定。

细胞因子阵列

基于ELISA测定的EV富集级分的细胞因子分析

可通过使用例如可商购获得的基于膜的细胞因子阵列来半定量分析含hPLEV级分的细胞因子谱。细胞因子包括趋化因子、肿瘤坏死因子、白介素、干扰素和集落刺激因子。该技术提供了非常灵敏的方法来并行检测许多不同的确定蛋白质(例如200种细胞因子)。可检测到仅数皮克的蛋白质的量。该测定基于其上结合有固定的特异性一抗的膜。包含在周围液体中的细胞因子在孵育期间与这些一抗结合。在随后的反应中，形成所谓的“夹心复合物”，其中生物素结合的二抗与一抗结合。结果，抗体-细胞因子-复合物是生物素标记的。HRP结合的链霉亲和素或其他标志物分子可与生物素结合，并且由此使得可通过化学发光、量热法(calometrie)或IR光检测复合物。可将检测信号与来自已知标准品的信号进行比较，在化学发光的情况下，可进行信号的密度测量以比较被分析的蛋白质。

功能性体外测定

分析hPLEV对免疫细胞的影响的体外测定

富集的EV级分的潜在免疫调节能力应使用来自人免疫系统的细胞(例如PBMC)至少在一种功能性体外测定中确定。这样的测定的原理是分析在存在或不存在hPLEV的情况下对免疫细胞的免疫调节作用。对于该问题，使用流式细胞术分析。为了诱导免疫应答，通过添加例如PHA(植物血凝素)、PMA(豆蔻酸乙酸佛波醇酯(phorbolmyristateacetate))、离子霉素、单克隆抗体、抗原(例如念珠菌属(candida)或细菌蛋白质)或其他甚至来自可商购获得激活试剂盒的可能组分来刺激细胞。此外，例如混合淋巴细胞反应(mixed-lymphocyte-reaction，MLR)的方法可以是适用的。可在所有PBMC上非特异性地(使用例如PHA)，或者仅在T细胞或其他限定的PBMC亚群上特异性地(例如选择性地)诱导激活。通过刺激，免疫细胞被激活，其可尤其通过细胞表面标志物的表达谱变化检测到。随后，如果刺激足够强，还可检测到提高的增殖活性(例如在T细胞的情况下)。在存在hPLEV富集级分的情况下，应可检测到与没有EV的细胞对照的差异(例如T细胞增殖的抑制和激活标志物的表达)。

这样的测定的实例：“PBMC-CFSE-PHA-测定”：

“PBMC-CFSE-PHA-测定”可用于分析存在hPLEV富集级分的情况下的PHA诱导的细胞增殖。CFSE(羧基荧光素-琥珀酰亚胺基酯)是荧光染料，其可用于使用流式细胞仪进行细胞追踪以进行分析。前体分子CFSE-SE(羧基荧光素-二乙酸酯-琥珀酰亚胺基酯)被动地扩散到细胞中，被胞内酶切割并且可通过荧光进行检测。由于每次细胞分裂，增殖的经CFSE标记细胞的荧光强度衰减50％。

在存在或不存在EV的情况下，将分离的经CFSE染色PBMC在用于悬浮细胞的24孔板中在RPMI培养基+10％人AB-血清中培养5天。在开始培养之后通过每孔200至300ng PHA(第0天)直接诱导细胞刺激。每孔培养体积为400μl的200 000个细胞。5天后，可对细胞进行流式细胞术分析。与第0天相比，荧光降低表明增殖速率高，稳定的荧光表明由于EV作用而抑制增殖。另外，还可在不同时间点分析激活标志物的表达。通过特异性缀合抗体染色，可对免疫细胞的细胞亚群进行区分和单独分析。

分析hPLEV对血管生成的影响的体外测定：

血管生成是生长和发育的所有阶段中以及创伤愈合和缺血性血管疾病中组织再生中的基本过程。在血管生成过程中，新毛细血管由预先存在的血管系统产生，并且该过程由促血管生成因子和抗血管生成因子的敏感平衡控制。内皮细胞响应于血管生成刺激(例如损伤、炎症和缺氧)而被激活。

管样形成测定

用于模拟血管生成的重组阶段的最广泛使用的体外测定之一是管形成测定。该测定测量内皮细胞形成毛细血管样结构(管)的能力。通常通过测量培养皿的二维显微镜图像中这些毛细血管样结构的数量、长度或面积来对管形成进行量化。

创伤愈合测定

擦伤测定用于测量体外细胞迁移。基本步骤包括在同质群体的细胞单层中产生“擦伤”，在开始时和在细胞迁移以使擦伤闭合期间以有规律的间隔捕获图像，以及用生命成像显微术比较图像以对细胞的迁移率(migration rate)进行量化。

这些测定可用于研究hPL-EV对血管生成对细胞间相互作用以及细胞迁移的作用，所述细胞迁移可模拟体内创伤愈合期间的细胞迁移。

在临床中使用hPLEV的基本安全准则/标准：

为了在临床中应用hPLEV，需要监测其安全性、潜在毒性和免疫原性。根据有关组织和细胞的立法以及ATMP(“先进治疗药物产品(Arzneimittel für neuartigeTherapien)”)，在用于临床试验之前需要考虑用于表征基于人细胞的药物产品的最低标准的平台。总之，必须解决产品：(a)是自体来源的、是同种异体来源的还是异种来源的；(b)在体外是广泛操作还是最低限度地操作；以及(c)是免疫活性的还是中性的。此外，必须确定(d)细胞的增殖能力，以及(e)细胞或组织样组织以及细胞与结构组分之间的动态相互作用，以及(f)预期用途。

一般来说，根据本发明的hPL来源于任何可想到的包含血小板的人血液样品。根据本发明的另一个实施方案，人血小板裂解物来源于血小板浓缩物，例如所谓的富血小板血浆(PRP)。PRP是由患者全血经离心以去除红细胞和其他不想要组分而获得的在血浆中的血小板浓缩物。其比全血具有更高浓度的生长因子，并且已在多个学科(包括牙科、骨外科和运动医学)中用作组织注射剂。血小板浓缩物可例如来源于血沉棕黄层(buffy-coat)提取的血小板浓缩物或来源于血小板单采血液成分术(platelet apheresis)。

根据本发明，细胞外囊泡可包含生物因子，例如遗传物质，例如mRNA、微RNA(miRNA)、少量DNA；脂质；以及蛋白质，包括转录因子、细胞因子和生长因子。

由于本发明的药物制剂来源于血小板，其通常包含多种生长因子，特别是以下生长因子中的一种或更多种，优选所有：PDGF、VEGF、FGF、EGF、TGF，尤其是TGF-β和CTGF。该组合物优选地包含这些生长因子中的2、3、4、5或6种。血小板来源生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)促进细胞生长和产生、血管修复和胶原产生。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)促进血管内皮细胞的生长和产生。成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)促进组织修复、细胞生长、胶原产生和透明质酸产生。上皮生长因子(epithelial growth factor，EGF)促进上皮细胞生长、血管生成和创伤愈合。转化生长因子(transforming growth factor，TGF)(尤其是TGF-β)促进上皮细胞的生长和新生以及创伤愈合。结缔组织生长因子(connective tissue growthfactor，CTGF)促进创伤修复。因此，本发明的药物制剂促进新成纤维细胞的形成。这些新成纤维细胞开始时具有弹性且健康，产生新的胶原和较少的金属蛋白酶。成纤维细胞(合成、维持和提供结构框架的主要细胞)的恢复使得产生更健康的恢复皮肤。PDGF还已显示提高成纤维细胞的运动性，使成纤维细胞重新安置至施用部位。在血小板的α-颗粒中发现的天然生长因子(例如PDGF、VEGF、FGF、EGF和TGF)促进胶原和透明质酸的产生、组织修复、内皮细胞和上皮细胞的生长和再生、以及新血管形成(其恢复氧并且去除不期望的分子)。所有这些因子都有助于使起皱和受损的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)再生回至其健康状态。这些生长因子中的每一种单独地和相互协同相加地在皮肤再生和恢复中发挥作用。刺激新的非片段化胶原之产生的治疗将提供外观和健康年龄的显著改善。

根据另一个实施方案，本发明的制剂(例如本发明的hPLEV富集级分)包含生物因子，例如蛋白质、细胞因子(例如IFN-γ、IL-8、IL-10、TGF-β1和HLA-G、RANTES、Nap-2)和/或核酸例如微RNA。

根据本发明的制剂可含有具有抗微生物特性的细胞因子。与其他存在的细胞因子的水平相对地比较，本发明制剂可特别地包含大量的细胞因子RANTES或细胞因子NAP-2或这两种细胞因子。

细胞因子RANTES和NAP-2的抗微生物特性已描述于例如文章Mariani等(2015)(BMC Microbiology 15:149)中。根据本发明的制剂的抗微生物特性可根据Mariani等的图2至图7所示的方法来测量，并且将该方法用作参考方法。

在本发明的情况下，考虑该制剂适于例如静脉内施用或输注，或者适于腹膜内注射、皮下注射、骨内注射、脑室内注射、肌内注射、眼内注射，或者适于表面施用(topicaladministration)。

本发明还涉及包含人血小板来源细胞外囊泡之富集级分的药物制剂，其可通过包括以下步骤的方法获得：

a)提供人血小板裂解物，其来自单供体捐献的血小板或者来自至少15个供体(优选至少20个或至少30个或至少40个供体)的合并的供体捐献的血小板；

b)富集来源于人血小板裂解物的细胞外囊泡；

c)任选地，通过例如降低的IL-1β、TNF-α、T细胞增殖来确定所述富集的细胞外囊泡的体外作用，例如免疫调节作用，特别是抗炎作用和/

或免疫抑制作用；以及

d)任选地，选择表现出所述体外作用(例如免疫调节作用，特别是抗炎作用和/或免疫抑制作用)的那些富集的细胞外囊泡级分；

e)任选地，选择步骤b)中表现出对EV/外排体标志物CD81呈阴性且对EV/外排体标志物CD9呈阳性的细胞外囊泡的那些富集的细胞外囊泡；以及

f)任选地，将步骤b)、d)或e)的所述富集的细胞外囊泡与至少一种合适的药用赋形剂和/或载体混合。

根据本发明的一个实施方案，步骤a的hPL可来源于已在裂解之前用来自现有技术(例如与PRP治疗相关的现有技术)的一种或更多种已知为凝血细胞激活剂的化合物孵育的血小板，所述化合物激活血小板并因此提高本发明制剂的品质。

根据本发明的一个实施方案，步骤a的hPL可来源于人脐带血。人脐带血血小板裂解物制剂是现有技术已知的(例如US 8501170 B2；Parazzi,V.,C.Lavazza,等(2015)；或Forte,D.,M.Ciciarello,等(2015))。

在如上限定的本发明方法的步骤a)中，应使用来源于单供体捐献的血小板或者来源于合并的供体捐献的血小板的人血小板裂解物，所述合并的供体捐献的血小板是至少15个供体(优选至少20个或至少30个或至少40个供体)的合并的供体捐献的血小板。

如果期望精确的药物治疗，则使用来源于患者自身血液的人血小板裂解物可以是有利的。如果期望一般治疗，则使用至少15个供体(优选至少20个或至少30个或至少40个供体)的合并物以与来源于至少40个供体的合并物的人血小板裂解物相比避免可能的人血小板裂解物的个体偏差是有利的。

可优选的是，如上所述的来自方法步骤a)的hPL由血小板单采血液成分术或由血沉棕黄层血小板提供，更优选地由血小板单采血液成分术提供。

由hPLEV富集级分介导的免疫调节作用可以是免疫抑制作用，其可用下述体外测定和相应的读出检测。观察到hPLEV级分具有抑制免疫细胞增殖的能力，并因此其是免疫抑制性的。在这样的体外测定中可观察到对受刺激PBMC的增殖的抑制作用，对于如CD3阳性细胞(T细胞)和CD3阴性细胞(包括例如B细胞、NK细胞)的亚群也可观察到。另外，在存在hPLEV级分的情况下，对T细胞激活标志物谱的表达具有抑制作用(CD69或CD25的下调)。

用于产生根据本发明的药物制剂的方法包括对EV进行特异性富集的步骤。如先前所述，发现EV在许多身体组织和体液中丰富，并且已经使用差速超速离心成功地对其进行纯化(Raposo,G.等J.Exp.Med.1996；183(3):1161-1172)。另一些研究还表明，可在蔗糖的连续密度梯度中使用超速离心来分离EV(Escola JM等,J Biol Chem.1998年8月7日；273(32):20121-7)。还已通过免疫亲和捕获方法使用凝集素或针对外排体普通标志物(例如CD63、CD81、EpCAM或Rab5)的抗体来分离外排体(Barrès C等,Blood.2010年1月21日；115(3):696-705；和Chen,Lab Chip.2010年2月21日；10(4):505-11)。

通常来说，可使用任何合适的纯化和/或富集方法，例如包括以下的方法：PEG沉淀、单片技术、磁性颗粒、过滤、透析、超速离心、ExoQuick

虽然如此，优选包括聚乙二醇沉淀的方法。

为了产生根据本发明的药物制剂，优选这样的方法，其中在微生物测试、毒力测试、蛋白质含量、热原测试和颗粒尺寸中进一步分析EV富集级分，以确定根据本发明的最合适级分。

可发现，富集hPLEV的级分如果其在体外活性测试中表现出强免疫调节作用则在根据本发明的方法中特别地可用。

还可发现，富集hPLEV的级分如果其表现出供体效应细胞的降低的IL-1β、TNF-α和/或IFN-γ细胞因子应答则在根据本发明的方法中特别地可用。

还优选的是这样的根据本发明的方法，其中所述外排体的尺寸为约70至200nm，优选约70至140nm，或更优选约70至120nm。“约”应意指+/-20％的偏差。还优选的是，外排体对EV/外排体标志物呈阳性，并且甚至还优选的是，药物制剂的蛋白质含量高于0.5mg/ml并且还优选高于1mg/ml(取决于最终的重悬/洗脱体积和所处理的初始PL体积)。

发现，hPLEV富集级分如果其在活性测试中表现出强体外免疫调节作用并且在添加所述EV级分之后可发现供体效应细胞的降低的IL-1β、TNF-α和/或IFN-γ细胞因子应答则在根据本发明的方法中特别地可用。ELISpot测定显示，在存在含外排体级分的情况下，效应细胞的IL-1β、TNF-α和/或IFN-γ细胞因子应答针对同种异体细胞受损。可用于分析潜在体外免疫调节作用的其他方法包括例如Luminex、ELISA和/或流式细胞术。

因此，本发明基于改善疾病预防和治疗的新概念，特别是在遭受炎症驱动的疾病、神经变性疾病、免疫/自身免疫病、心血管疾病、皮肤病、移植排斥、GvHD、卒中、以及缺血及相关并发症的风险的患者中，例如用于避免手术前或手术期间的炎性反应，以及预防与生命支持机相连的患者的炎性病症和反应。在一个实施方案中，所述疾病可选自出生前或出生后神经系统损伤，例如与缺氧、炎症和/或缺血相关的脑损伤。在另一个实施方案中，所述疾病可分别选自移植物抗宿主病、或器官移植后的移植排斥。

在本发明的一个特别优选的实施方案中，向患者、特别是新生儿和/或接受移植物的患者和/或正经历手术的患者中预防性地和/或治疗性地输注使用聚乙二醇沉淀方案富集的来源于hPL的EV富集级分。

根据本发明的药物制剂优选地富含包含以下生物因子的EV：例如蛋白质(例如抗炎细胞因子、IL-10、TGF-β1和HLA-G)、和/或核酸(例如miRNA)。这实现根据本发明的另外的优点：a)进行多模式(复合)干预；b)使用生物生理(“自身”)物质；以及c)降低制剂的不想要副作用。

本发明构成多模式干预。因此，不仅使用特定因子(并且仅干预级联(或潜在临床表型)的一部分)，而且使用生物学上复杂且内源性的介质和调节子。这些组分存在于每个人中，并因此预期无显著的不良副作用。

本发明的另一方面涉及用于产生根据本发明的药物制剂的方法，其包括以下步骤：a)提供hPL；b)针对hPLEV对所述hPL进行富集，任选地包括聚乙二醇沉淀；c)通过例如供体效应细胞的降低的IL-1β、TNF-α、T细胞增殖和/或IFN-γ细胞因子应答来确定所述hPLEV富集级分的体外免疫调节作用，特别是抗炎作用和/或免疫抑制作用；d)选择表现出免疫调节作用(特别是抗炎作用和/或免疫抑制作用)的那些hPLEV富集级分；以及e)将步骤d)的所述富集的外排体与至少一种合适的药用赋形剂和/或载体混合。

根据本发明的另一个实施方案，施用适于例如静脉内施用或输注，或者适于腹膜内注射、皮下注射、骨内注射、脑室内注射、肌内注射、眼内注射，或者适于表面施用。表面施用可例如通过用本发明制剂预制或预处理或提供的美容皮肤产品或铺状物(pavement)、创伤垫等来施加。

本发明的另一方面是制备药物制剂或诊断制剂或美容制剂的方法，其包括以下步骤：向药物制剂或诊断制剂或美容制剂添加人血小板裂解物或富集人血小板裂解物来源细胞外囊泡的级分。

本发明在其范围内包括这样的制剂，其含有单独或者与药用载体或稀释剂组合的治疗有效量的hPL或hPLEV级分作为活性成分。根据期望的剂型，技术人员可选择合适的载体。剂型包括例如片剂、颗粒剂、胶囊剂、液体剂型、凝胶剂、栓剂、乳膏剂、软膏剂、泥敷剂(poultice)或贴剂。一个优选实施方案是hPLEV级分与合适聚合物基质的组合，例如，如WO2013076507中所述。还优选的是在0.9％ NaCl溶液中静脉内施用。

本发明制剂的美容应用可用合适的赋形剂配制。通常来说，根据本发明的人血小板裂解物或富集人血小板裂解物来源细胞外囊泡的级分在应用于美容时可替代PRP。PRP治疗已应用于许多不同的医学领域，例如美容外科、牙科、运动医学和疼痛管理。PRP已成为例如用于面部和嫩肤术的高度受欢迎的非手术操作。PRP治疗是这样的治疗，其使用献血者自己的血小板来刺激新细胞生长，帮助改善肤色、皮肤纹理并恢复失去的面部容积。

根据本发明的一个实施方案，PRP治疗可由包含hPL或hPLEV级分替代PRP的美容制剂替代。然后，将来自献血者自己的自体hPL或hPLEV级分重新注射到皮肤中以刺激胶原和新皮肤细胞。hPL或hPLEV级分利用患者自身血小板的有益功能，并因此不存在变态反应或排斥治疗的风险。hPL或hPLEV级分还可成功地用于治疗头发稀疏和脱发，特别是男性型秃发。患者提早开始治疗可很重要。

本发明的一个优选实施方案是hPL或hPLEV级分在以下中的应用：皮肤再生例如抗衰老治疗、晒伤、昆虫叮咬后变态反应、自身免疫反应或变应性皮肤反应、痤疮炎症。hPL或hPLEV级分可以是用于皮肤或毛发处理的美容组合物的一部分。本发明提供了再生治疗，其直接解决与皱纹相关的每个问题并且增强皮肤和在下方的支架。用本发明所述的制剂进行治疗使受损皮肤的退行性循环逆转为见于正常皮肤的健康生理机能。本发明的制剂通过重新平衡结缔组织内的细胞、平衡分子信号传导和恢复细胞外基质来发挥作用。自然愈合和组织再生过程导致胶原合成提高、胶原细胞外基质的再生和基质内成纤维细胞的增殖。

诊断用途

根据基于hPLEV的本发明，可建立体外诊断测试以用于疾病的诊断应用和实时监测。hPLEV可通过非侵入性血液测试用作疾病的诊断生物标志物。个体供体的hPLEV制剂的具体内容物可用作肿瘤疾病或炎性疾病相关疾病的生物标志物。

为了更好地理解本发明及其优点，提及以下实施例仅用于举例说明性目的。实施例并不旨在以任何方式限制本发明的范围。

实施例

除非另有说明，否则本发明的实践将采用化学、分子生物学、微生物学、DNA重组和免疫学的常规技术，这些技术在本领域普通技术人员的能力之内。这样的技术在文献中有解释。参见，例如，J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第二版，第1至3册,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel,F.M.等(1995年和定期增刊；Current Protocols in Molecular Biology,第9、13和16章,John Wiley&Sons,New York,N.Y.)；B.Roe,J.Crabtree和A.Kahn,1996,DNAIsolation and Sequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons；J.M.Polak和James O'D.McGee,1990,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IrlPress；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg,1992,Methods of Enzymology:DNA StructurePart A:Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology,AcademicPress；Using Antibodies:A Laboratory Manual:Portable Protocol第I期,EdwardHarlow,David Lane,Ed Harlow(1999,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN 0-87969-544-7)；Antibodies:A Laboratory Manual,Ed Harlow(编辑),David Lane(编辑)(1988,Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN 0-87969-314-2),1855；和Lab Ref:A Handbook of Recipes,Reagents,and Other Reference Tools for Use at theBench,Jane Roskams和Linda Rodgers编辑,2002,Cold Spring Harbor Laboratory,ISBN0-87969-630-3。这些一般文本中的每一个都通过引用并入本文。

实施例1：制备富血小板血浆的方法实施例

1.1.血小板浓缩物(PRP-PC)

在含有CPDA1抗凝剂(TERUMO PENPOL,Ltd.Puliyarakonam,Trivandrum,India)的450ml三重袋中收集450ml全血。通过Heraeus 6000i(德国)冷冻离心机以加速和减速曲线分别为5和4在21℃下以1750rpm轻旋(light spin)离心11分钟从全血中分离富血小板血浆，并通过以加速和减速曲线分别为9和5在21℃下以3940rpm重旋(heavy spin)离心5分钟并随后移除上清液血浆来浓缩血小板。使血小板浓缩物袋以标签侧朝下在室温下静止约1小时。将贫血小板血浆迅速冷冻并作为新鲜冷冻血浆(fresh frozen plasma，FFP)在-30℃或低于-30℃下储存一年。

用于制备血沉棕黄层-血小板浓缩物(buffy coat-platelet concentrate，BC-PC)的方法

在含有63ml CPD抗凝剂和添加物溶液(SAGM)的450ml四重袋中收集450ml全血。(TERUMO PENPOL,Ltd.,Puliyarakonam,Trivandrum,India)。首先以加速和减速曲线分别为9和4将全血在21℃下以3940rpm“硬旋(hard spin)”离心5分钟。全血根据比重分离成不同的组分。

·顶层-贫血小板上清液血浆(150至200ml)。

·中间层-血沉棕黄层，其含有约90％的血小板、70％的WBC和10％的红细胞。

·底层-浓缩红细胞。

将贫血小板上清液转移到一个随体袋(satellite bag)中并将血沉棕黄层转移到另一个随体袋中。将约20至30ml的血浆放回血沉棕黄层，目的是清洗管中的残留细胞并在BC中获得适量的血浆。将SAGM溶液添加至红细胞。然后，移除含有红细胞和血浆的袋。将红细胞置于4℃下的冷室中，并将贫血小板血浆作为新鲜冷冻血浆(FFP)置于-40℃深度冷冻器中。将血沉棕黄层与血浆轻轻混合，并再次将其连同一个空随体袋一起以加速和减速曲线分别为5和4在21℃下以1,100rpm进行“轻旋”离心6分钟。将上清液富血小板血浆转移到空的血小板储存袋中，并随后将管密封。弃去具有残余WBC和红细胞的袋。

1.2.单供体血小板(single donor platelet，SDP)-单采血液成分术-PC

自动化细胞分离器设备可以是使用单或双静脉通路的间歇流或连续流细胞技术。可使用连续流、双静脉通路的自动化细胞分离器-

1.在详细解释操作、所用时间以及可能的危险和益处之后，获得供体的书面同意。

2.静脉通路是单采血液成分术供体的重要考虑因素，并且由于以下原因在选择时对静脉进行检查：

·操作持续时间长

·延长的流量(flow rate)

·经常需要用连续流设备进行两次静脉穿刺。

3.记录供体的年龄。

4.在单采血液成分术操作之前，对血小板单采术供体进行ABO/Rh分型和感染性疾病标志物(HIV、HBV、HCV、VDRL和疟疾)的测试。

5.已服用阿司匹林或其他可能影响血小板功能的NSAID的供体被推迟。

6.对血小板计数>1.5×10

1.3.操作

该操作在封闭系统中进行。将一次性套件安装至连续流分离器，然后启动机器。通过用必达净(betadine)清洁两臂肘前区域的两个静脉穿刺部位来对供体做准备，并且对供体进行创伤最小的精神静脉切开术(spirit phlebotomy)。在操作期间，以受控方式在抽出点对血液进行抗凝，并且使全血和抗凝剂(ACD)的比例维持在9:1至11:1。将抗凝血泵入到旋转分离容器中。红细胞通过离心力朝向容器的外边缘浓集，且随后红细胞离开分离容器。通过血浆泵移出较低密度的组分，例如血浆、血小板或WBC，并使其进入旋转收集容器，在其中血小板通过离心力朝向容器的外边缘浓集。分离的血小板在容器中保持浓集，而血液的其他成分返回至供体。在收集操作结束时，剧烈摇动血小板收集袋以使血小板从袋壁上分离并将其在室温下保持1小时以使其成为均匀的悬液。这整个操作需要1.5至2.5小时。单采血液成分术-PC的最终体积为200至300ml。

实施例2：人凝血细胞裂解物(hPL)的产生

人凝血细胞裂解物(＝人血小板裂解物(hPL))的产生基于对已过期人凝血细胞浓缩物(＝人血小板浓缩物(hPC/hTC)的进一步处理。为了获得hTC，通常使用两种不同的处理方法。一种是通过使用来自数个供体的全血捐献物的合并的血沉棕黄层制品来限定，在另一种中使用单采血液成分术浓缩物。在该技术中，将供体与体外细胞分离器连接并且将凝血细胞过滤出，而其他血液组分(例如红细胞、白细胞和血浆)被送回供体。在这两种情况下，产生的血液制品都是白细胞耗尽的TC。这些制品含有活凝血细胞持续至少4至5天，并且可用于例如在患有血小板减少症的患者中替代缺少的凝血细胞。

在到期日之后，过多的制品可用于产生hPL。通过冷冻和解冻循环(-20℃和RT)，血小板破碎/破裂并将其内容物释放到周围液体(血浆)中。存在不同的方案，包括在3200至10000g下持续约1小时的离心步骤。通过离心清除裂解的细胞、细胞碎片和其他碎片。结果是由血小板裂解物和血浆组成的澄清的黏性黄色液体。为了在处理之后对制品进行灭菌，可另外地任选地使用200nm过滤器。并行地，去除大于200nm的颗粒，包括不具有外排体尺寸的细胞外囊泡。

实施例3：使用Ficoll密度梯度离心和体外细胞培养的外周单个核细胞(peripheral mononuclear cell，PBMC)的分离

外周单个核细胞是从来自全血捐献物的血沉棕黄层制品获得。根据以下描述，通过使用Ficoll密度梯度离心进行PBMC的分离：

1.将约100ml血沉棕黄层制品以等份分配在三个50ml聚丙烯管上。

如有必要，用PBS(磷酸缓冲盐水)替代缺失的体积。

2.向另外三个50ml PP管装入10ml Ficoll。

3.通过将35ml血液小心地倒到10ml Ficoll上，形成两个分离的层。

4.在10℃的温度下以900g进行密度梯度离心持续20分钟(间断设定在0或1)。

5.在形成梯度之后，将含有PBMC的中间相转移到新的50ml PP管中。

6.使用PBS将收集的具有PBMC的级分填充至50ml体积。

7.为了消除血小板，以650g进行离心持续5分钟。

8.弃去含有血小板的上清液。

9.为了裂解红细胞，将细胞重悬于20至25ml的裂解缓冲液中，然后在4℃下孵育7分钟。

10.通过将PBS填充至50ml的体积来通过PBS停止裂解反应。

11.通过以900g离心5分钟来耗竭裂解的碎片。

12.弃去上清液，并将细胞重悬于50ml PBS中。

13.使用Neubauer室人工地或者作为替代地自动地例如通过使用Sysmex-血细胞计来对细胞进行计数。

14.将PBMC重悬于培养基(RPMI，10％热灭活hAB-血清，1％ PSG(青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺))中，并根据以下体外测定设定合适的浓度。

实施例4：在分子水平上的细胞外囊泡制剂的分析和表征

1.使用BCA-测定(或作为替代的标准方法，例如Bradford-测定)确定总蛋白质浓度

可通过使用标准方法确定EV富集级分的总蛋白质浓度。为此目的，可使用多种商业化试剂盒和试剂。例如，使用来自Thermo Scientific的BCA蛋白质测定试剂盒。两个二辛可宁酸(bicinchoninacid，BCA)分子与一个铜离子(1+)一起形成螯合络合物。在碱性环境中，蛋白质的存在引起铜还原。螯合络合物的形成对应于所分析液体从绿色至紫色的颜色变化。可在562nm的吸收下通过光度测定测量颜色变化的强度。与不同BSA浓度的校准值的已知值相比，可确定EV级分的蛋白质浓度。

2.平均颗粒尺寸[nm]和尺寸分布[曲线]以及颗粒数(使用NTA平台，例如Nanosite或Zetaview)的确定

为了表征细胞外纳米囊泡，使用纳米颗粒追踪分析(NTA)。该物理技术适用于从比光的波长更小的尺寸追踪颗粒。该方法基于电场的感应，颗粒在电场中开始运动。由于这种运动，可在其通过分析吸收池的扩散期间追踪其布朗运动(Brownian motion)。可确定级分中颗粒的尺寸和尺寸分布，并且还给出颗粒浓度的值。可在与视频显微镜连接的屏幕上密切注意布朗运动的追踪分析。资料由软件以数字方式转换为数据。通过颗粒扩散常数计算尺寸的确定结果并将其转换成流体动力学颗粒尺寸。颗粒浓度是从对视频部分的分析推导出来的，并且与所测量的散射光的量相关。

分离方法

分离方法可基于超速离心(差速离心)、尺寸排阻色谱(Izon和Exospin柱)、基于聚合物的沉淀(PEG 1000、PEG 6000、PEG 8000EV、Exoquick-Qiagen)、膜亲和力(Exoeasy-Qiagen)和流动过滤。对于治疗应用或基础研究而言，没有标准化的现有技术来分离EV。用于选择纯化方法的标准是必须处理的血小板裂解物的初始体积以及富集的PL-EV级分的高纯度和回收率。

关于再现性、纯度、杂质和hPLEV功能特性的维持，需要对纯化方法的选择进行标准化。应用的方法应在其可扩展性和再现性方面进行评价。由于以下事实产生最高hPLEV纯度的方法对于回收在治疗上最有效的EV级分不一定是最佳的：附着于hPLEV表面的组分或共分离的非hPLEV相关辅因子可能在纯化期间损失。

EV储存

对于EV的储存，目前没有标准化方案可用。储存条件必须进行验证，因为其可影响EV的稳定性。许多常用的溶剂和缓冲剂的范围从氯化钠至PBS、TRIS-HCl、HEPES和甘油。

实施例5：离心原理

离心用于分离组分、细胞以及用于分离细胞器。其基于由离心力引起的液体中颗粒的运动。该技术的主要组件是转子。存在不同类型，例如固定角转子、垂直转子或摆动转子。超速离心机属于高速离心机的类别。为了避免由于空气动力阻力产生的摩擦热，设置真空。根据物理原理，由于尺寸和密度而发生组分分离。颗粒通过向外方向的离心力加速。该加速取决于颗粒的角速度及颗粒与旋转轴的距离。加速涉及重力g。

通过Svedberg方程，描述了黏性流体中球形颗粒的沉降速度。来自生物材料的S值(Svedberg单位)：沉降系数s定义为在离心场中在特定几何条件下实现的沉降速度。沉降系数s的单位定义为S值。存在多种离心技术：差速离心、区带离心、等密度离心、密度梯度离心。

差速离心：

差速离心基于不同的颗粒沉降速度。其用于富集颗粒并获得体积减小的更高浓度的颗粒。使用固定角转子。

因此，其要求离心颗粒的沉降速度彼此足够不同。

存在与细胞及其组分相关的以下差异，其允许分离：

首先是完全细胞沉降(1 000g，2分钟)，然后是尺寸较大的高重量细胞组分(例如细胞核)(1 000g，5至10分钟)。后来是核膜和质膜沉降(1500g，15分钟)，接着是高尔基体(2000g，20分钟)、线粒体、溶酶体和过氧化物酶体(10 000g，25分钟)。微粒体在100 000g，60分钟或更长下沉降。这些也属于EV，包括外排体。其见于最终的沉淀物中。通过差速离心获得的级分的纯度：

不能将所述组分分离并纯化至100％。由快速沉降颗粒组成的沉降物将总是包含缓慢沉降颗粒，这些颗粒置于离心管底部附近。由于这种污染，不能实现完全的纯度。

差速离心用于富集EV/外排体：

在第一离心步骤中，将含EV液体(例如细胞培养物上清液、经稀释的含血浆液体或经稀释的hPL)以2000g离心15分钟。细胞、死细胞、细胞碎片(细胞核、核膜、质膜、高尔基体)沉淀在底部并且可被去除。在4℃下以10 000g进行45分钟的第二离心步骤中，耗竭步骤1的上清液中的线粒体、溶酶体和过氧化物酶体。微粒体(例如EV(包括外排体))保留在上清液中，并且最终可通过超速离心(110 000g，1至2小时)沉淀。

PEG-沉淀

对于聚乙二醇沉淀，可使用PEG 6000。该物质是来自于乙二醇的聚合物，并且是水溶性的、惰性的且无毒的。PEG可用于沉淀高分子物质，例如蛋白质(还有病毒颗粒和EV)。在存在PEG的情况下，蛋白质沉淀，而低分子物质保持可溶。根据所选择的沉淀条件，限定高分子物质和低分子物质的边界可在一定程度上变化(PEG的分子量、PEG浓度和沉淀温度)。如果将亲水性的、不带电荷的PEG和蛋白质在水溶液中混合在一起，则同时存在蛋白质的结合水(hydration water)。如果达到限定的PEG浓度，则蛋白质以可逆的方式沉淀。这种沉淀代表非常温和的沉淀方式(首次描述：Polson等，1964)。

EV的PEG沉淀：

将经例如在0.9％ NaCl中稀释的含EV液体在存在10％v/v PEG 6000的情况下孵育过夜(16小时，4℃)以使EV沉淀。在孵育之后，将沉淀颗粒以1500g沉淀30分钟(4℃)。弃去上清液。将沉淀物重悬在例如0.9％NaCl中并进行超速离心(110 000g，约2小时)。或者，该步骤可作为附加的洗涤步骤重复进行。

在一个优选实施方案中，提供了用于预防和/或治疗选自以下的疾病的方法：再生性疾病、炎症驱动的疾病、神经变性疾病、免疫/自身免疫病、心血管疾病、皮肤病、感染性疾病、移植排斥、卒中、缺血或移植物抗宿主病，所述方法包括向所述患者施用有效量的根据权利要求1至13中任一项所述的药物制剂。

优选地，该方法是这样的方法，其中所述施用适于静脉内施用或输注，或者适于腹膜内注射、皮下注射、骨内注射、脑室内注射、肌内注射、眼内注射，或者适于表面施用。

优选地，提供了制备药物制剂或诊断制剂或美容制剂的方法，其包括以下步骤：向药物制剂或诊断制剂或美容制剂添加人血小板裂解物或富集人血小板裂解物来源细胞外囊泡的级分。

参考文献

1.Thomas Lener et al.in ISEV position paper in the Journal ofExtracellular Vesicles 2015，4：30087

2.Torreggiani et al.(European Cells and Materials Vol.28,2014 137-151

3.Foster TE，Puskas BL，Mandelbaum BR，Gerhardt MB，Rodeo SA(2009).Am JSports Med 37(11)：2259-72)

4.Koliha，Nina et al..Journal of Extracellular Vesicles，[S.I.]，Feb.2016.

5.Craig N.Morrell et al.，May 1，2014；Blood：123(18)

6.Kuffler DP etal.in Mol Neurobiol.2015Oct；52(2)：990-1014.doi：10.1007/s12035-015-9251-x.Epub 2015Jun 6

7.Raposo，G.etal.J.Exp.Med.1996；183(3)：1161-1172

8.Escola JM et al.，J Biol Chem.1998Aug 7；273(32)：20121-7).

9.Barrès C.et al.，Blood.2010Jan 21；115(3)：696-705

10.Chen，Lab Chip.2010Feb 21；10(4)：505-11).

11.Mariani et al.BMC Microbiology(2015)15：149

12.Eppley，B.L.，W.S.Pietrzak，et al.(2006)Plast Reconstr Surg 118(6)：147e-159e.

13.Mishra，A.，K.Harmon，et al.(2012)Curr Pharm Biotechnol 13(7)：1185-1195 Carlson，N.E.and R.B.Roach，Jr.(2002)J Am Dent Assoc 133(10)：1383-1386.

14.Fontana，F.，M.Mori，et al.(2016)ACS Appl Mater Interfaces 8(1)：988-996.

15.Naaijkens，B.A.，H.W.Niessen，et al.(2012)Cell Tissue Res 348(1)：119-130.

16.Govindasamy，V.，V.S.Ronald，et al.(2011)Cytotherapy 13(10)：1221-1233.

17.Parazzi，V.，C.Lavazza，et al.(2015).″Extensive Characterization ofPlatelet Gel Releasate From Cord Blood in Regenerative Medicine.″CellTransplant 24(12)：2573-2584.

18.Fore，D.，M.Ciciarello，et al.(2015).″Human cord blood-derivedplatelet tysate enhances the therapeutic activity of adipose-derivedmesenchymal stromal cells isolated.from Crohn′s disease patients ina mousemodel of colitis.″Stem Cell Res Ther6：170.

本发明还涉及以下各项实施方案(它们对应于原申请的权利要求书)：

1.用于医学的药物制剂，其包含富集人血小板裂解物来源细胞外囊泡的级分。

2.根据实施方案1所述的制剂，其用于预防和/或治疗炎症驱动的疾病、神经变性疾病、免疫/自身免疫病、心血管疾病、皮肤病、感染性疾病、移植排斥、卒中、缺血或移植物抗宿主病。

3.根据实施方案1或2所述的制剂，其中所述制剂是无细胞的。

4.根据实施方案1至3中任一项所述的制剂，其中人血小板裂解物来源细胞外囊泡的富集级分是所述制剂中的必需药物活性成分。

5.根据实施方案1至4中任一项所述的制剂，其中所述富集级分中的细胞外囊泡的尺寸为10至1000nm，特别地尺寸为50至200nm，优选70至140nm。

6.根据实施方案1至5中任一项所述的制剂，其中所述富集级分中的细胞外囊泡对以下至少一种细胞外排体标志物呈阳性：CD9、CD41a、CD41b、CD42b、CD61、CD62P、CD63和内居蛋白。

7.根据实施方案1至6中任一项所述的制剂，其中所述富集级分中的细胞外囊泡对以下至少一种细胞外排体标志物呈阴性：CD81、CD3、CD4、CD19、CD20、CD2、CD8、CD11a和CD25。

8.根据实施方案1至7中任一项所述的制剂，其用于抗微生物应用，其中所述富集级分中的细胞外囊泡对细胞因子RANTES或细胞因子NAP-2或者这二者呈阳性。

9.根据实施方案1至8中任一项所述的制剂，其中所述药物制剂的蛋白质含量高于0.5mg/ml。

10.根据实施方案1至9中任一项所述的制剂，其中所述人血小板裂解物来源于单供体捐献的血小板或合并的供体捐献的血小板。

11.根据实施方案1至10中任一项所述的制剂，其中所述人血小板裂解物来源于血沉棕黄层提取的血小板浓缩物或来源于血小板单采血液成分术。

12.根据实施方案1至11中任一项所述的制剂，其中所述细胞外囊泡包含生物因子，例如遗传物质，例如mRNA、微RNA(miRNA)、少量DNA；脂质；以及蛋白质，包括转录因子、细胞因子、生长因子。

13.根据实施方案1至12中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含可药用载体，优选可药用聚合物。

14.根据实施方案1至13中任一项所述的制剂，其中所述制剂适于静脉内施用或输注，适于腹膜内注射、皮下注射、骨内注射、脑室内注射、肌内注射、眼内注射，或者适于表面施用。

15.根据前述实施方案中任一项所述的包含人血小板来源细胞外囊泡之富集级分的药物制剂，其可通过包括以下步骤的方法获得：

a.提供人血小板裂解物，其来自单供体捐献的血小板或者来自至少15个供体、优选至少20个或至少30个或至少40个供体的合并的供体捐献的血小板；

b.富集来源于人血小板裂解物的细胞外囊泡；

c.确定体外作用，例如免疫调节作用；以及

d.任选地，选择表现出所述体外作用例如免疫调节作用、特别是抗炎作用和/或免疫抑制作用的那些富集的细胞外囊泡；以及

e.任选地，选择步骤b)中表现出对细胞外排体标志物CD81呈阴性且对细胞外排体标志物CD9呈阳性之细胞外囊泡的那些富集的细胞外囊泡；以及

f.任选地，将步骤a)的所述人血小板裂解物或者步骤b)、d)或e)的所述富集的细胞外囊泡与至少一种合适的药用赋形剂和/或载体混合。