茄尼醇在制备预防、治疗或缓解慢性疼痛药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及茄尼醇在制备预防、治疗或缓解慢性疼痛药物中的应用。

背景技术

慢性疼痛是指持续或者反复发作超过3个月的疼痛，以躯体疼痛不适为主诉，其病程长，躯体痛苦严重，顽固不易治疗。慢性疼痛病因复杂，机制不明确。它不仅会造成患者身体不适和机体障碍，长时间发作甚至会引起患者焦虑，产生不健康的心理状态，严重干扰患者正常的工作和生活，成为一个日益严重的健康问题。

目前临床上常用非甾体抗炎药治疗慢性疼痛。非甾体抗炎药是通过抑制环氧酶-1和环氧酶-2来减少前列腺素的合成，从而降低神经末梢对缓激肽和其它疼痛介质的敏感性来减少疼痛。但是，环氧酶-1是维持肾脏和肝脏内环境稳定的主要递质，非甾体抗炎药的使用会破坏内环境稳定，引起胃肠道或过敏等一系列副反应。此外，长期服用非甾体抗炎药还会产生药物耐受性、依赖性及成瘾性，极大地限制了其临床应用。有数据显示，在长期口服非甾体抗炎药的患者中，大约有10％～25％的病人发生消化性溃疡，其中有小于1％的患者出现严重的并发症如出血或穿孔。

近年来，许多来自天然作物的药物化合物被发现是治疗疾病的基础。因此，从天然作物中寻找高效、低毒的抗炎镇痛类药物具有十分广阔的应用前景。茄尼醇是一种主要从茄科植物如烟叶、番茄、土豆、茄子和辣椒中提取45碳类异戊二烯。已证明其具有抗炎、抗菌和神经保护活性。此外，其他茄尼醇衍生物被认为可以逆转多药耐药性，并使肿瘤细胞对常规抗癌治疗敏感。然而，迄今为止还没有研究表明茄尼醇是否有助于缓解慢性疼痛。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供茄尼醇在制备预防、治疗或缓解慢性疼痛药物中的应用。

作为优选，所述慢性疼痛为静态机械性触诱发痛和热痛。

作为优选，茄尼醇通过抑制脊髓胶质细胞的激活、降低促炎因子IL-1β、TNF-α的表达来缓解慢性疼痛。

作为优选，茄尼醇还能够缓解慢性疼痛伴发的焦虑样行为。

作为优选，所述药物用于人体或动物体。动物体为各种动物包括小鼠等，当药物用于小鼠时，茄尼醇的每次有效给药量为50mg/kg。

本发明的第二个目的是提供一种预防、治疗或缓解慢性疼痛的药物，该药物有效成分包括茄尼醇。该药物可以以茄尼醇作为单一有效成分，也可以将其与其他有效成分复配。

作为优选，所述药物还包括药学上可以接受的载体。

作为优选，单位剂量药物中，茄尼醇的含量为治疗有效量；其中“治疗有效量”指的是：茄尼醇的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。

作为优选，当药物用于小鼠时，茄尼醇的每次有效给药量为50mg/kg。

作为优选，所述药物的剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、滴丸、气雾剂或注射剂。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明采用机械痛阈值和热痛阈值的测定确定茄尼醇可以缓解慢性疼痛；采用高架十字迷宫和旷场实验确定茄尼醇可以缓解慢性疼痛伴发的焦虑样行为且不影响小鼠的正常运动功能；采用westernblot检测小鼠脊髓组织中促炎因子表达情况；采用免疫应荧光染色确定茄尼醇抑制脊髓胶质细胞表达来缓解慢性疼痛为小胶质细胞特异性表达。

本发明研究茄尼醇在制备缓解慢性疼痛药物中的应用，经研究发现，茄尼醇通过抑制脊髓胶质细胞的激活、降低促炎因子的表达来缓解慢性疼痛。因此，本发明既可为慢性疼痛的治疗提供了新的思路，也可为缓解慢性疼痛药物的开发提供物质基础。

因此，本发明具有以下有益效果：

本发明采用的茄尼醇是来源自茄科植物中的提取物，原材料常见，因而可以推动相关产业的发展；茄尼醇具有潜在的临床治疗价值，显著拓展了安全治疗窗，可能无耐受性，成瘾性且副作用小，其作用机制不同于临床常用的阿片类或阿司匹林类镇痛药：茄尼醇通过抑制脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞的激活，降低炎性因子IL-1β、TNF-α的表达，从而显著抑制了机械性触发痛和热痛。本发明首次证实茄尼醇具有干预慢性疼痛所致的机械性触诱发痛和热痛的作用，可用于制备慢性疼痛的治疗药物。

附图说明

图1为本发明流程图；

图2为实施例1茄尼醇缓解慢性疼痛示意图，其中：(A)茄尼醇的化学结构式；(B)茄尼醇对小鼠机械缩足反射阈值(PWT)的影响；(C)茄尼醇对小鼠热刺痛阈值(PWT)的影响。每组n＝11，数据为平均值±s.e.m.*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001；注：BS:baseline BF:before。

图3为实施例2茄尼醇缓解慢性疼痛伴发焦虑样行为示意图，其中：(A)两组小鼠高架十字迷宫轨迹；(B)两组小鼠在开臂的时间；(C)两组小鼠进入开臂的次数；(D)两组小鼠活动总路程；(E)两组小鼠旷场实验轨迹；(F)两组小鼠在中央区的活动总路程；(G)两组小鼠活动总路程。每组n＝11，数据为平均值±s.e.m.*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。

图4为实施例3茄尼醇减少脊髓胶质细胞的激活免疫荧光结果图。(A)两组小鼠脊髓Iba1和GFAP荧光强度示意图；(B)两组小鼠脊髓Iba1荧光强度；(C)两组小鼠脊髓GFAP荧光强度。每组n＝5，数据为平均值±s.e.m.*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。

图5为实施例3茄尼醇降低脊髓炎症因子的表达蛋白质印迹结果图。(A)两组小鼠脊髓TFN-α表达量；(B)两组小鼠脊髓IL1-β表达量。每组n＝5，数据为平均值±s.e.m.*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。

具体实施方式

下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。下述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于下述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

本发明实施例流程图如图1所示，茄尼醇的结构式如图2A所示。

实施例1：茄尼醇缓解慢性疼痛

为了验证茄尼醇对慢性疼痛的缓解作用，本发明通过机械痛阈值的测定和热痛阈值的测定检测茄尼醇对慢性疼痛的缓解作用。具体操作如下：

1)CFA疼痛模型建立

将小鼠置于瑞沃德小动物麻醉机的诱导麻醉箱里，待其浅麻醉后,迅速取出小鼠，给予左侧后肢足底皮下注射10ul CFA(50％)。注射30min后，可观察小鼠注射足底出现明显的红、肿，视为慢性炎症疼痛模型建立成功。

2)药物处理

将茄尼醇溶解于DMSO中制成100mg/ml的溶液，用生理盐水稀释为5mg/ml，按照50mg/kg剂量腹腔给予茄尼醇。SOL组连续6天注射50mg/kg茄尼醇，COL组每天注射同等剂量的生理盐水。

3)机械痛阈值的测定

将小鼠放置于疼痛测试架(带有金属网眼)上，用直径为10cm、特制塑料桶将其罩住，其足部暴露于金属网眼中，待动物理毛、舔足以及大小便完毕后开始试验。从最小刺激强度0.008g开始，用纤维丝刺激小鼠后足底拓中部，阳性反应定义为纤维丝弯曲成S形，持续5s内其后足缩回，或者撤去纤维丝后小鼠后足立即缩回。若没有反应，则更换高一级纤维丝，直到有阳性反应。每只后足测试5次，每次间隔5s，左足和右足测试至少间隔3min。5次刺激中至少出现3次缩足的所用纤维丝级别定义为小鼠机械痛阈值。结果见图2B。

4)热痛阈值的测定

测定前，将小鼠置于热刺痛测定仪上适应20min，待动物安静后开始测试。将小鼠放置于玻璃板上，将辐射光源隔玻璃照射小鼠足底拓中部，预先调整热刺激强度，调整正常小鼠缩足阈值大约为8～12s，以20s为其最长照射时间的上限，若20s小鼠仍没有缩足反应，仪器自动停止，记录阈值为20s。只有出现明显缩足为阳性反应，连续测试3次，间隔时间为10min，热痛阈值取平均值。结果见图2C。

如图2所示，图中SOL为茄尼醇处理组，CON为CFA模型组。测试数据使用two-wayANOVA方法进行分析，P＜0.05被视为有统计学意义。

结果显示，注射CFA后，小鼠注射侧缩足潜伏期明显降低；连续6天腹腔注射茄尼醇后，小鼠注射侧缩足潜伏期明显升高，对热痛和机械痛相对不敏感。因此，这些结果表明茄尼醇能够缓解慢性疼痛引起的机械性触发痛和热痛。

实施例2：茄尼醇缓解慢性疼痛伴发的焦虑样行为

为了检测茄尼醇对慢性疼痛伴发焦虑样行为的影响，本发明进行了高架十字迷宫和旷场试验，通过机械痛阈值的测定和热痛阈值的测定检测茄尼醇对慢性疼痛的缓解作用。具体操作如下：

1)高架十字迷宫

将小鼠从饲养笼中取出，实验动物尽量背向实验员，将动物轻轻放在仪器宫体的中央区域，动物面向开臂，然后实验员迅速安静的离开。打开Anymaze动物行为分析软件，跟踪动物在高架十字迷宫仪器内的轨迹运动，自动计算指标，实验时长为5分钟。

2)旷场实验

将实验动物从饲养笼中轻轻取出，注意背向实验者，将实验动物迅速放置于实验箱的中央区域，并立即离开；打开动物行为学分析软件并设置好相应的参数，自动记录动物在箱体内的活动，实验时间为15分钟。

结果如图3所示，经过茄尼醇处理后，小鼠的焦虑样行为明显减少，且运动功能基本不受影响，表明茄尼醇能够给有效缓解慢性疼痛伴发的焦虑样行为。

实施例3：茄尼醇缓解慢性疼痛的分子机制

为了研究茄尼醇缓解慢性疼痛的分子机制，本发明通过免疫荧光染色、WesternBlot来检测。具体操作如下：

1)免疫荧光

将小鼠脊髓组织置于4％PFA中2天，在30％蔗糖中脱水直至沉到底部，然后使用Thermo冷冻切片机切成10μm冠状切片。将切片置于98℃恒温浴中的1×柠檬酸钠抗原修复溶液中30分钟后，将切片在室温下用0.3％Triton X-100的含5％BSA的PBS封闭和透化1小时。随后，切片与GFAP抗体(1:200；3670,CST)和IbaI抗体(1:200,66827-1-Ig，Proteintech)在4℃下孵育过夜。第二天，切片在PBS中洗涤3次，然后在室温下用二抗洗涤1小时。最后，用封固剂密封。通过使用共聚焦显微镜(Olympus，FV3000)获得图像。通过ImageJ软件测量荧光的总密度。

结果如图4所示。本发明通过免疫荧光染色检查了小鼠脊髓炎症因子IL1-β、TNF-α的表达情况。结果显示，茄尼醇处理后，小鼠脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞激活显著减少。

2)蛋白质印迹

简而言之，用冷RIPA缓冲液裂解培养的细胞并在4℃下孵育30分钟，然后在12,000×g下离心20分钟。用BCA定量蛋白质浓度用5×上样缓冲液提取蛋白质，在100℃水中煮沸10分钟，然后使用10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Merck Millipore)上。用5％脱脂奶粉封闭1小时后，将膜与IL1-β(1:500；A16288,ABclonal)、TNF-α(1:200；A11534,ABclonal)、β-tubulin(1:2000；AC026,ABclonal)抗体在4℃下孵育过夜。在TBST中洗涤3次后，将膜与二抗在室温下孵育1小时。在TBST中再洗涤3次后，使用电化学发光成像分析系统(GelView 6000Plus，BLT)检测蛋白信号。通过Image J软件测量印迹。

结果如图5所示。本发明通过蛋白免疫印迹检查了小鼠脊髓炎症因子IL1-β、TNF-α的表达情况。结果显示，茄尼醇处理后，小鼠脊髓炎症因子TNF-α、IL1-β表达量显著下降。

综上所述，本发明提供了一种缓解慢性疼痛的新途径，茄尼醇能够缓解慢性疼痛的发生和发展，发现其缓解慢性疼痛可能的分子机制，寻找慢性疼痛的治疗药物和手段，可应用于慢性疼痛的预防、治疗及预后。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。