一种具备冠状动脉粥样硬化斑块内靶向给药能力的载药系统及其制备方法

技术领域

本发明属于药物载体领域，尤其涉及一种具备冠状动脉粥样硬化斑块内靶向给药能力的载药系统及其制备方法。

背景技术

冠心病(coronary heart disease，CHD)近年来发病率不断攀升，死亡率位居榜首，已严重危害人类的健康。然而，目前研究表明仅有他汀类药物具有稳定粥样硬化斑块的作用，介入治疗具有局部的治疗作用，尚没有用于治疗冠心病的靶向给药技术。

血管内超声(intravascular ultrasound，IVUS)是近年来临床上常用的技术，通过介入手段送微小的超声探头至冠心病病灶处进行超声显像，主要用于局部病灶的进一步精细检查。IVUS使用高频超声探头，临床使用时分辨力不足。目前市面上有微泡造影剂可以配合普通超声进行增强显像，提高超声分辨力，但因其属于微米级别的脂质体(体积太大，不够坚硬)，无法匹配高频IVUS使用。理论上来说，纳米级别的多聚体(体积更小，更坚硬)可与IVUS高频探头匹配使用，起到增强的效果从而提高其分辨力。

在正常情况下，纳米粒由于体内的“轴流作用”，不能很好得粘附于血管壁，而超声辐射力能够使纳米粒偏离轴流中心，向血管壁偏移实现靶向粘附。当纳米粒与超声形成良好的共振时，可以起到超声增强的效果，同时获得良好的超声辐射力。

正常组织血管内皮细胞的细胞间隙为6-7nm，而疾病(如冠心病)状态中的血管内皮间隙可允许直径小于700nm的颗粒穿过。因此，更小的纳米粒子在超声辐射力的作用下可以通过血管内皮间隙进入冠状动脉粥样硬化斑块内部。

聚氰基丙烯酸丁酯纳米粒[poly(butyl cyanoacrylate)nanoparticles，PBCANPs]是由安全无毒、易于生物降解的氰基丙烯酸正丁酯(n-butyl cyanoacrylate，BCA)单体在酸性介质中自行聚集而成，聚合过程不需要任何能量的输入并且稳定性较高。通过调整PBCA NPs制备方案中的参数，可以制备出不同理化性质的纳米级多聚体载体。

综上所述，如果能够制备出载药且匹配IVUS的纳米粒，不仅可以提高IVUS的分辨力，还可以实现冠状动脉粥样硬化斑块内的靶向给药，起到靶向治疗冠心病的效果。但截至目前，尚没有相关的技术。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述IVUS分辨力不足、冠心病尚无靶向给药治疗途径，提供一种药物载体系统，该系统能提高IVUS的分辨力，具备冠状动脉粥样硬化斑块内靶向给药能力。

本发明为解决上述提出的问题所采用的的技术方案如下：本发明所提供的药物载体系统，是以BCA为单体，通过悬浮聚合方案，制得PBCA NPs，并匹配IVUS进行使用，即IVUS-PBCA NPs靶向给药系统。

上述药物载体系统，其制备方法主要包括如下步骤：一方面，本发明提供了一种具备冠状动脉粥样硬化斑块内靶向给药能力的载药系统的制备方法，具体步骤如下：

步骤一，制备药物水溶液I

取RNA药物2OD和0.5g BCA溶解于20ml 0.01M HCL中，制备得药物水溶液I；

步骤二，制备药物水溶液II

将质量分数为1％的Poloxamer 188溶解于20ml 0.01M HCL中，制备得药物水溶液II；

步骤三，悬浮聚合制备PBCA NPs

将药物水溶液I加入到药物水溶液II中，使用高速分散器在8000-15000rpm下剪切90s，在可加热磁力搅拌器上600-800rpm下搅拌4h；用0.1M NaOH溶液中和以停止聚合，pH为6.7-7.0)，之后再搅拌1h，离心机15000rpm离心60min，超纯水重悬清洗3次，每次在转速15000rpm和时间10min的条件下离心去除上清；最后一次清洗后得到NPs，将NPs重悬于质量分数1％的海藻糖二水合物中后用冻干机冻干，最后制得载药的PBCA NPs。

进一步地，步骤三中，用精密pH试纸检测停止聚合后的pH，若过碱溶液会呈现粉红色，需要用HCL调回至pH 6.7-7.0。

进一步地，一次能够制备出100mg PBCA NPs。

进一步地，制备出的PBCA NPs平均粒径216nm，表面带稳定的负电位-22.2mV，安全无毒。

进一步地，步骤一中，所述RNA药物为任何分子大小在纳米级别以下的药物。

进一步地，步骤一中，所述RNA药物包括miR-126-3p antagomir和miR-126-3p。

另一方面，本发明还提供了一种具备冠状动脉粥样硬化斑块内靶向给药能力的载药系统。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明提供的药物载体系统，在使用过程中，PBCA NPs可以匹配IVUS使用，通过与超声频率共振，起到增强的效果，从而提高IVUS的分辨力。

2、本发明提供的药物载体系统，在使用过程中，PBCA NPs可以获得IVUS的超声辐射力，从而透过血管内皮间隙，进入动脉粥样硬化斑块内，多聚体自然水解，内部包裹的药物释放，实现靶向给药。

附图说明

图1为本发明中PBCA NPs药物载体的透射电子显微镜下形态(标尺1um)示意图；

图2为本发明中PBCA NPs药物载体的透射电子显微镜下形态(标尺500nm)示意图；

图3为本发明中PBCA NPs药物载体的透射电子显微镜下形态(标尺200nm)示意图；

图4为本发明中PBCA NPs药物载体的透射电子显微镜下形态(标尺100nm)示意图；

图5为本发明中PBCA NPs药物载体的透射电子显微镜下形态(标尺50nm)示意图；

图6为本发明中PBCA NPs药物载体的透射电子显微镜下形态(标尺50nm)示意图；

图7为本发明中PBCA NPs药物载体的粒径分布示意图；

图8为本发明中PBCA NPs药物载体表面电位分布示意图；

图9为本发明中PBCA NPs药物载体的毒性检测示意图；

图10为IVUS普通成像图；

图11为IVUS在本发明中PBCA NPs药物载体增强下的成像图；

图12为IVUS在本发明中PBCA NPs药物载体增强下持续1分钟以后所得成像图；

图13为本发明中IVUS-PBCA NPs靶向给药系统效果图；

图14为实施例1中载miR-126-3p antagomir PBCA NPs的透射电子显微镜下形态(标尺1um)示意图；

图15为实施例1中载miR-126-3p antagomir PBCA NPs的透射电子显微镜下形态(标尺500nm)示意图；

图16为实施例1中载miR-126-3p antagomir PBCA NPs的透射电子显微镜下形态(标尺200nm)示意图；

图17为实施例1中载miR-126-3p antagomir PBCA NPs的透射电子显微镜下形态(标尺100nm)示意图；

图18为实施例1中载miR-126-3p antagomir PBCA NPs的透射电子显微镜下形态(标尺50nm)示意图；

图19为实施例1中载miR-126-3p antagomir PBCA NPs的透射电子显微镜下形态(标尺50nm)示意图；

图20为实施例1中载miR-126-3p antagomir PBCA NPs的粒径分布示意图；

图21为实施例1中载miR-126-3p antagomir PBCA NPs的表面电位分布示意图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面将结合实施例进一步阐明本发明的内容。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中涉及的PBCA NPs、载药PBCA NPs可以采用如下方法制备，也可以采用其他方法制备。

1、制备药物水溶液I

取0.5g BCA(2-氰基-2-丙烯酸丁酯，B895525麦克林，Shanghai，China)溶解于20ml 0.01M HCL中，制备得药物水溶液I。

2、制备药物水溶液II将质量分数1％的Poloxamer 188[聚(乙二醇)-block-聚(丙二醇)-block-聚(乙二醇)，P131347阿拉丁，Shanghai，China)]溶解于20ml 0.01M HCL中，制备得药物水溶液II。

3、悬浮聚合方案制备PBCA NPs

将药物水溶液I加入到药物水溶液II中，使用手提式高速分散器(S10型，宁波新芝)8000-15000rpm剪切90s，在可加热磁力搅拌器(MS-H280-pro大龙)上600-800rpm搅拌4h。用0.1M NaOH溶液中和以停止聚合(pH 6.7-7.0)(用精密pH试纸检测pH，若过碱溶液会呈现粉红色，需要HCL调回至pH6.7-7.0)，再搅拌1h。离心机15000rpm离心60min，超纯水重悬清洗3次，每次在转速15000rpm和时间10min的条件下离心去除上清。最后一次清洗后得到NPs，将纳米粒子(NPs)重悬于质量分数1％的海藻糖二水合物(G8570索莱宝，Beijing，China)中后用冻干机冻干，最后制得PBCA NPs药物载体。

图1-6为本发明中PBCA NPs药物载体的透射电子显微镜下形态，由图1-6可知PBCANPs是形态呈圆形的中空纳米粒子。

图7为本发明中PBCA NPs药物载体的粒径分布，由图7可知PBCA NPs平均粒径216nm左右，粒径分布集中。

图8为本发明中PBCA NPs药物载体表面电位分布，由图8可知PBCA NPs表面带稳定的负电位-22.2mV。

图9为本发明中PBCA NPs药物载体的毒性检测，在孔板中加入不同浓度的PBCANPs(分别为0、0.1、0.5、1、2、4、10mg/ml)，培养48小时后，细胞存活率都超过了100％，由图9可知PBCA NPs安全无毒。

4、IVUS-PBCA NPs靶向给药系统的实施

在猪主动脉血管内实施IVUS操作，通过指引导管在靠近成像导管处推注PBCA NPs2ml，使成像导管保持在固定的位置上，持续1-2分钟。

图10为IVUS普通成像图，以猪主动脉为实验血管，注入新鲜血液，实施IVUS操作，由图10可知在普通IVUS操作下，成像较为模糊，血管边缘显示不清。

图11为IVUS在本发明中PBCA NPs药物载体增强下的成像图，以猪主动脉为实验血管，注入新鲜血液，实施IVUS操作前加入PBCA NPs，由图11可知在PBCA NPs药物载体的增强作用下，图像的清晰度较普通成像明显提高，由此可知，PBCA NPs药物载体和IVUS可以匹配共振，从而达到增强的效果。

图12为IVUS在本发明中PBCA NPs药物载体增强下持续1分钟以后所得成像图，以猪主动脉为实验血管，注入新鲜血液，实施IVUS操作前加入PBCA NPs药物载体，再持续IVUS操作1分钟，由图12可知在持续IVUS操作后，血管中央的增强作用有所减弱，但血管边缘的增强效果进一步增强，血管边缘显示较刚加入PBCA NPs时更为清晰，由此可见，PBCA NPs药物载体可以获得IVUS的超声辐射力，浓聚向血管边缘，并可透过血管内皮间隙，进入血管内。而当PBCA NPs内部载药时，所载药物可以在PBCA NPs自然水解后释放，从而达到靶向给药的效果。

图13为本发明中IVUS-PBCA NPs靶向给药系统效果图。在PBCA NPs药物载体内部载入药物，配合IVUS使用，载药PBCA NPs可获得超声辐射力，从而浓聚在血管边缘，并透过病变处的血管内皮间隙，进入病变部位，而后PBCA NPs自然水解，内部药物得到释放，实现靶向给药。

实施例1

IVUS-载miR-126-3p antagomir PBCA NPs靶向给药，其实施步骤如下：

1、制备药物水溶液I

取miR-126-3p antagomir 2OD(29*2ug)和0.5g BCA(2-氰基-2-丙烯酸丁酯，B895525麦克林，Shanghai，China)溶解于20ml 0.01M HCL中，制备得药物水溶液I。

2、制备药物水溶液II

将质量分数1％的Poloxamer 188[聚(乙二醇)-block-聚(丙二醇)-block-聚(乙二醇)，P131347阿拉丁，Shanghai，China)]溶解于20ml 0.01M HCL中，制备得药物水溶液II。

3、悬浮聚合方案制备载miR-126-3p antagomir PBCA NPs

将药物水溶液I加入到药物水溶液II中，使用手提式高速分散器(S10型，宁波新芝)8000-15000rpm剪切90s，在可加热磁力搅拌器(MS-H280-pro大龙)上600-800rpm搅拌4h。用0.1M NaOH溶液中和以停止聚合(pH 6.7-7.0)(用精密pH试纸检测pH，若过碱溶液会呈现粉红色，需要HCL调回至pH 6.7-7.0)，再搅拌1h。离心机15000rpm离心60min，超纯水重悬清洗3次，每次在转速15000rpm和时间10min的条件下离心去除上清。最后一次清洗后将NPs重悬于质量分数的1％海藻糖二水合物(G8570索莱宝，Beijing，China)中后用冻干机冻干，最后制得载miR-126-3p antagomir PBCA NPs。

图14-19为实施例1中载miR-126-3p antagomir PBCA NPs的透射电子显微镜下形态，由图14-19可知载miR-126-3p antagomir PBCA NPs是形态呈圆形的纳米粒子，内部包含有miR-126-3p antagomir。

图20为实施例1中载miR-126-3p antagomir PBCA NPs的粒径分布，由图20可知载miR-126-3p antagomir PBCA NPs平均粒径428nm左右，粒径分布集中。

图21为实施例1中载miR-126-3p antagomir PBCA NPs的表面电位分布，由图21可知载miR-126-3p antagomir PBCA NPs表面带稳定的负电位-22.7mV。

4、IVUS-载miR-126-3p antagomir PBCA NPs靶向给药

在冠状动脉内实施IVUS操作，通过IVUS找到病变位置，通过指引导管在靠近成像导管处推注载miR-126-3p antagomir PBCA NPs 2ml，使成像导管保持在固定的位置上，持续1-2分钟。推注载miR-126-3p antagomir PBCA NPs，IVUS图像增强，识别病变部位分辨力提高，持续IVUS操作，提供超声辐射力，载miR-126-3p antagomir PBCA NPs浓聚向血管边缘，并透过病变处的血管内皮间隙，进入病变部位，即进入冠状动脉粥样硬化斑块内部，而后PBCA NPs自然水解，内部药物miR-126-3p antagomir得到释放，实现靶向给药，继而下调斑块内的miR-126-3p，影响其下游相关因子及蛋白，抑制血管再生，增强斑块稳定性，达到治疗冠状动脉粥样硬化斑块的效果。

实施例2

IVUS-载miR-126-3p PBCA NPs靶向基因调控，其实施步骤如下：

1、制备药物水溶液I

取miR-126-3p 2OD(29*2ug)和0.5g BCA(2-氰基-2-丙烯酸丁酯，B895525麦克林，Shanghai，China)溶解于20ml0.01M HCL中，制备得药物水溶液I。

2、制备药物水溶液II

将质量分数1％的Poloxamer 188[聚(乙二醇)-block-聚(丙二醇)-block-聚(乙二醇)，P131347阿拉丁，Shanghai，China)]溶解于20ml 0.01M HCL中，制备得药物水溶液II。

3、悬浮聚合方案制备载miR-126-3p PBCA NPs

将药物水溶液I加入到药物水溶液II中，使用手提式高速分散器(S10型，宁波新芝)8000-15000rpm剪切90s，在可加热磁力搅拌器(MS-H280-pro大龙)上600-800rpm搅拌4h。用0.1M NaOH溶液中和以停止聚合(pH 6.7-7.0)(用精密pH试纸检测pH，若过碱溶液会呈现粉红色，需要HCL调回至pH 6.7-7.0)，再搅拌1h。离心机15000rpm离心60min，超纯水重悬清洗3次，每次在转速15000rpm和时间10min的条件下离心去除上清。最后一次清洗后将NPs重悬于质量分数1％海藻糖二水合物(G8570索莱宝，Beijing，China)中后用冻干机冻干，最后制得载miR-126-3p PBCA NPs。

4、IVUS-载miR-126-3p PBCA NPs靶向基因调控

在冠状动脉内实施IVUS操作，通过IVUS找到病变位置，通过指引导管在靠近成像导管处推注载miR-126-3p PBCA NPs 2ml，使成像导管保持在固定的位置上，持续1-2分钟。推注载miR-126-3p PBCA NPs，IVUS图像增强，识别病变部位分辨力提高，持续IVUS操作，提供超声辐射力，载miR-126-3p PBCA NPs浓聚向血管边缘，并透过病变处的血管内皮间隙，进入病变部位，即进入冠状动脉粥样硬化斑块内部，而后PBCA NPs自然水解，内部药物miR-126-3p得到释放，实现靶向给药，继而上调斑块内的miR-126-3p，影响其下游相关因子及蛋白，促进血管再生，达到靶向基因调控的效果。

实施例3

用于提升IVUS分辨力的增强超声造影剂的制备，其实施步骤如下：

1、制备药物水溶液I

取0.5g BCA(2-氰基-2-丙烯酸丁酯，B895525麦克林，Shanghai，China)溶解于20ml 0.01M HCL中，制备得药物水溶液I。

2、制备药物水溶液II

将质量分数1％的Poloxamer 188[聚(乙二醇)-block-聚(丙二醇)-block-聚(乙二醇)，P131347阿拉丁，Shanghai，China)]溶解于20ml 0.01M HCL中，制备得药物水溶液II。

3、悬浮聚合方案制备PBCA NPs

将药物水溶液I加入到药物水溶液II中，使用手提式高速分散器(S10型，宁波新芝)8000-15000rpm剪切90s，在可加热磁力搅拌器(MS-H280-pro大龙)上600-800rpm搅拌4h。用0.1M NaOH溶液中和以停止聚合(pH 6.7-7.0)(用精密pH试纸检测pH，若过碱溶液会呈现粉红色，需要HCL调回至pH 6.7-7.0)，再搅拌1h。离心机15000rpm离心60min，超纯水重悬清洗3次，每次在转速15000rpm和时间10min的条件下离心去除上清。最后一次清洗后将NPs重悬于质量分数1％的海藻糖二水合物(G8570索莱宝，Beijing，China)中后用冻干机冻干，最后制得PBCA NPs。

4、IVUS-PBCA NPs超声增强

在冠状动脉内实施IVUS操作，通过IVUS找到病变位置，通过指引导管在靠近成像导管处推注载PBCA NPs 2ml，使成像导管保持在固定的位置上，持续1-2分钟，IVUS图像增强，识别病变部位分辨力提高，有利于分辨斑块的稳定性，指导临床治疗。

实施例1中，IVUS-PBCA NPs靶向给药通过搭载其他药物也可以达到类似的效果，并不仅限于miR-126-3p antagomir；给药的部位可以是其他部位，并不仅限于冠状动脉。

实施例2中，IVUS-PBCA NPs基因调控通过搭载其他的药物也可以达到类似的效果，并不仅限于miR-126-3p的基因调控；调控的部位可以是其他部位，并不仅限于冠状动脉。

实施例3中，IVUS通过PBCA NPs得到增强，其他类似的纳米粒子也可以达到类似的效果，并不仅限于bca的多聚体，也可以是其他类型的纳米粒子。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。