一种基于CRISPR/Cas9基因编辑构建晚花水稻的方法

技术领域

本发明属于植物分子生物学和CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9基因编辑构建晚花水稻的方法。

背景技术

水稻(Oryza sativa)是世界主要粮食作物之一，抽穗是水稻由营养生长向生殖生长转变的重要发育过程，抽穗期决定水稻的开花时间，在合适的时间开花对水稻的生长繁衍和作物产量极为重要。因此，寻找水稻抽穗期诱导调控的方法，从而提出精确控制水稻抽穗时间的策略，对作物遗传改良具有重要价值和现实意义。

WRKY转录因子是植物中最大的转录调控因子家族之一，在植物的生长发育、衰老、非生物和生物胁迫等众多过程中发挥重要作用。近年来，WRKY转录因子调控植物生长发育和响应生物与非生物胁迫方面的生物学功能已得到广泛研究。此外，多项研究表明WRKY转录因子能够调控多种植物的开花时间，但其是否具有调控水稻开花诱导的功能仍然未知。我们前期的研究发现，OsWRKY11基因突变导致水稻抽穗期明显延迟，我们推测OsWRKY11可能参与调控水稻开花诱导。因此，本发明旨在基于CRISPR/Cas9基因编辑技术以OsWRKY11基因为例来构建导致水稻抽穗期延迟的一种突变体。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于CRISPR/Cas9基因编辑构建晚花水稻的方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

一种基于CRISPR/Cas9基因编辑构建晚花水稻的方法；包括如下步骤：步骤一、基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建水稻OsWRKY11基因突变体：

步骤二、构建OsWRKY11基因的CRISPR/Cas9敲除载体并转化水稻植株。

进一步的，所述步骤二中，所述CRISPR/Cas9敲除载体为pYLCRISPR/Cas9-MH-OsWRKY11。

进一步的，所述p YLCRISPR/Cas9-MH-OsWRKY11敲除载体的构建包括以下步骤：

S1.针对核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的OsWRKY11基因选择靶位点并设计PCR引物，

进行PCR扩增，获得含所述靶位点序列的线性DNA片段；

S2.将上述线性DNA片段连入p YLCRISPR/Cas9-MH载体，构建得到p YLCRISPR/Cas9-MH-OsWRKY11敲除载体。步骤S1所述靶位点的序列为：5'-catggcccctaccaccagca-3'。

进一步的，步骤S1采用的接头引物为：

WRKY11-OsU6a-up-R:

tgctggtggtaggggccatgCGGCAGCCAAGCCAGCACC

WRKY11-OsU6a-down-F:

catggcccctaccaccagcaGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT。

进一步的，所述步骤一中构建水稻OsWRKY11基因突变体的具体操作为：A：构建OsWRKY11的基因敲除突变体：通过CRISPR/Cas9技术，设计敲除靶点，将靶点连接sgRNA再构建到pMH载体上；将构建好的载体通过农杆菌介导的转基因技术转化进入日本晴水稻；

B：PCR鉴定得到oswrky11突变体；在靶位点序列上下游位置使用Primer Premier5设计了突变体检测引物，利用PCR程序鉴定突变体植株的类型，得到纯合突变体进行后续步骤的推进；

C：在不同的日照条件下培养并观察它们的抽穗期。从水稻萌发播种开始算起日期，直到水稻抽出第一株穗的时间为水稻开花时间；

D：提取不同日本晴水稻组织RNA，包括幼苗、根、茎，幼叶、老叶、叶鞘、幼穗和老穗。利用实时荧光定量PCR技术，检测不同组织中OsWRKY11基因表达水平，确定其时空表达模式；

E：通过GFP融合蛋白分析OsWRKY11蛋白的亚细胞定位。构建OsWRKY11基因编码序列和GFP的融合载体，在烟草叶片中瞬时表达，Confocal观察GFP荧光位置，以确定OsWRKY11蛋白的亚细胞定位。

进一步的，所述步骤二中：

所述OsWRKY11基因，登录号为LOC_Os01g43650或Os01g0626400；在水稻中是一个功能未知的新基因；基因OsWRKY11的核苷酸序列包含2223个碱基，CDS全长1140bp，编码一个由379个氨基酸组成的蛋白；OsWRKY11主要在叶鞘和叶片中表达，蛋白亚细胞定位于细胞核。

进一步的，水稻WRKY11基因的CDS区核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；

进一步的，水稻WRKY11基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示，gDNA序列如SEQ ID No.3所示；

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对水稻基因OsWRKY11进行改造，使得该基因功能缺失，从而延迟水稻抽穗期。

进一步地，所述方法包括：以水稻基因OsWRKY11的gDNA序列为靶标，设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas9的载体中，转化水稻，进而获得该基因功能缺失的转基因水稻。

进一步的，所述方法获得的转基因水稻在植物育种中的应用。

进一步的，所述育种包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

含有基因OsWRKY11的质粒载体、表达盒。

CRISPR/Cas9基因编辑技术构建的基因OsWRKY11突变体用于负向调控水稻抽穗期的应用。

进一步的，所述应用具体为：在水稻中敲除该基因获得突变体时，使得植株抽穗时间延迟。

进一步的，所述应用还包括OsWRKY11基因的CRISPR/Cas9敲除载体或质粒在调控水稻抽穗期中的应用。

CRISPR/Cas9基因编辑技术构建的基因OsWRKY11突变体用于水稻品种改良的应用；

CRISPR/Cas9基因编辑技术构建的基因OsWRKY11突变体用于制备转基因植物的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

一种基于CRISPR/Cas9基因编辑构建晚花水稻的方法，WRKY转录因子能够调控多种植物的开花时间，但其是否具有调控水稻开花诱导的功能仍然未知，本发明基于如何利用CRISPR/Cas9基因编辑技术来构建晚花水稻，最终利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将OsWRKY11基因突变，导致水稻抽穗期明显延迟，证实OsWRKY11参与调控水稻抽穗期调控。

本发明不仅有助于完善利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在水稻开花诱导调控信号网络的方面的作用，还能为农业生产及育种提供精确控制水稻花期的生物学理论基础，与此同时，还能拓宽WRKY家族转录因子在植物发育过程中的生物学功能。

本发明基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了调控水稻抽穗期的基因OsWRKY11，该基因突变后水稻抽穗期较野生型延迟，本发明为深入了解植物抽穗期调节机理和水稻抽穗期育种提供了新的基因资源。

附图说明

图1.OsWRKY11基因突变体抑制水稻抽穗期。(A)为CRISPR/cas9基因编辑技术产生的oswrky11突变体突变形式模式图。5#和16#为两个独立的oswrky11突变体株系。Nip(Nipponbare)，日本晴水稻。(B)为Nip野生型、oswrky11#5和oswrky11#6基因突变体测序结果展示。(C)为oswrky11突变体在短日照条件下的表型。在自然短日照条件下的温室中生长的在萌发后第53天的野生型和oswrky11突变体。比例尺：10cm。(D)为水稻材料抽穗期统计数据及分析，点表示一个生物学重复。结果用均值标准差显示(****P<0.0001)。

图2.OsWRKY11蛋白亚细胞定位和OsWRKY11组织表达模式。

(A)35S:OsWRKY11-GFP和35S:GFP在烟草叶片中瞬时表达，DAPI染色指示细胞核位置，GFP作为对照。(B)RT-qPCR检测OsWRKY11在水稻幼苗(Seedling)、根(Root)、茎(Stem)、幼叶(Young leaves)、老叶(Old leaves)、叶鞘(Sheath)、茎尖(SAM)、幼穗(Youngpanicles)和老穗(Oldpanicles)中的表达水平。

序列表为OsWRKY11基因的CDS区核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。另外水稻WRKY11基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，gDNA序列如SEQ ID No.3所示。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：以下实施方法中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。

如图1-2所示，一种基于CRISPR/Cas9基因编辑构建晚花水稻的方法：

OsWRKY11基因(登录号为LOC_Os01g43650或Os01g0626400)在水稻中是一个功能未经报道的新基因，根据水稻WRKY11的基因号，查找到对应的CDS序列(如SEQ ID No.1所示)及gDNA序列(如SEQ ID No.3所示)，OsWRKY11基因编码的蛋白对应的氨基酸序列(如SEQID No.2所示)。然后基于CRISPR-GE：CRISPR靶位点设计网站设计敲除靶点，设计接头引物并构建转基因载体，构建CRISPR/Cas9基因敲除载体后转化Nip(Nipponbare)，日本晴水稻，植株抽穗期延迟，从而验证了基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建的OsWRKY11基因突变体调控水稻抽穗期的功能，即功能丧失型突变导致水稻抽穗期延迟。本发明为水稻抽穗期调控提供了新的基因资源。

实施例1：CRISPR/cas9基因编辑技术构建基因OsWRKY11突变体

1、利用CRISPR靶位点设计网站(http://skl.scau.edu.cn/home/)对日本晴Nip(Nipponbare)进行OsWRKY11基因敲除，具体过程如下：(1)利用网站(http://skl.scau.edu.cn/home/)的Target Design功能：输入水稻WRKY11的gDNA序列(如SEQ IDNo.3所示)，设计并选择出适合的目标靶序列(sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-catggcccctaccaccagca-3’)，选择要求：选择无“bad site waring”提示序列，靶点序列spCas9为20bp+NGG的序列(位于CDS序列区域)，GC含量适中，此处为65％，潜在靶位点(Potential off-target sites max score,)的最高分值小于0.4的，此位点为0.165，没有发夹结构(Pairing with sgRNA)，综合上述条件选出最优靶点序列。用于构建单靶点敲除载体，如图1A所示，对应引物序列为：

WRKY11-OsU6a-up-R:

tgctggtggtaggggccatgCGGCAGCCAAGCCAGCACC

WRKY11-OsU6a-down-F:

catggcccctaccaccagcaGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT

(2)载体具体构建流程如下：

反应1引物序列：

UP-T1：agcaccggtaaggcgcgTTGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG

WRKY11-OsU6a-up-R:tgctggtggtaggggccatgCGGCAGCCAAGCC AGCACC

反应2引物序列：

gR-R:

ctagctcgagaggcgcgAGTGGCGCGCCCCATCCACTCCAAGCTCTTG

WRKY11-OsU6a-down-F:catggcccctaccaccagcaGTTTTAGAGCTA GAAATAGCAAGT

进行PCR扩增。

将反应1和反应2的PCR产物，选择片段大小合适的样品，切胶回收，各取1μL为模板，进行第二轮PCR扩增

反应3引物序列：

UP-T1：agcaccggtaaggcgcgTTGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG

gR-R:

ctagctcgagaggcgcgAGTGGCGCGCCCCATCCACTCCAAGCTCTTG(小写表示PMH载体上切割下的末端同源b序列，以便后期能用同源重组方法将PMH载体和水稻WRKY11基因序列连接成功)

PCR反应结束后对产物进行琼脂糖凝胶电泳，对符合大小的条带进行切胶回收。

然后利用同源重组连接pYLCRISPR/Cas9-MH载体(酶切位点SpelAscl)：

将上述连接产物转化到DH5α感受态中，涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养。挑取平板上单菌落，用pYLCRISPR/Cas9-MH载体检测引物SP1和SP2序列在PCR中扩增，电泳出现目的条带后送往北京擎科生物科技有限公司进行测序验证，获得阳性菌株。提取质粒。将阳性单克隆菌液及质粒送至武汉艾迪晶生物科技有限公司进行转化。

(3)对T0代植株幼苗进行鉴定及测序

根据OsWRKY11的CDS序列，在靶位点序列上下游位置使用Primer Premier5设计了突变体检测引物oswrky11-F/R突变体鉴定引物序列如下：

wrky11-F

CCGCACCGAGACAGATTTAC

wrky11-R

CTCGTCACATCCACCGACAG

PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，选择目标片段大小合适的样品，送往擎科生物技术(上海)有限公司测序；突变体和野生型的测序结果利用网站(http://skl.scau.edu.cn/home/)的DSDecodeM功能进行序列比对(把包含靶点序列的前后300bp左右的DNA序列输入作为参考序列，选择测序结果，进行对比分析)。现有报道将CRISPR/Cas9技术获得的突变体分为三类：双等位基因纯合突变、双等位基因杂合突变和单条染色体突变。结果发现，在转基因T0代植株中获得2个双等位基因纯合突变株，我们选取两个独立的具有有效突变的株系oswrky11#5和oswrky11#16进行后续研究。其中，oswrky11#5在OsWRKY11第一个外显子上产生1-bp的插入，oswrky11#16在OsWRKY11第一个外显子发生2-bp的缺失，它们都产生移码突变，使得OsWRKY11蛋白翻译的提前终止(图1A，B)。

实施例2；CRISPR/cas9基因编辑技术构建基因OsWRKY11突变体的抽穗期表型观察；

从水稻播种开始算起日期，直到水稻抽出第一株穗的时间为水稻开花时间。培养在自然短日照条件下的温室中生长的野生型和oswrky11突变体，在萌发后第53天的野生型和oswrky11突变体进行抽穗期的表型及数据统计分析，发现与野生型相比，oswrky11突变体在自然短日照条件下的抽穗期明显延迟(图1C-D)。表明OsWRKY11可能促进水稻开花时间。

实施例3OsWRKY11蛋白亚细胞定位和OsWRKY11组织表达模式。

为了进一步探究基于CRISPR/cas9基因编辑技术构建的OsWRKY11基因突变体的生物学功能，我们通过将绿色荧光蛋白GFP融合在OsWRKY11蛋白的C端，并在烟草叶片中瞬时表达，观察GFP荧光位置来检测OsWRKY11蛋白的亚细胞定位。发现OsWRKY11-GFP的荧光位置与DAPI染色的细胞核位置重叠，表明OsWRKY11蛋白定位于细胞核中(图2A)，符合WRKY转录因子家族的特性。因此，OsWRKY11极有可能作为转录因子来发挥功能。

此外，为了探究OsWRKY11基因的时空表达模式，我们收集了水稻不同组织器官以及同一器官不同时期的样品，包括幼苗、根、茎、幼叶、老叶、叶鞘、幼穗和老穗。抽提各个样品的RNA，运用qRT-PCR检测OsWRKY11基因在各个组织器官中的表达水平。结果表明，OsWRKY11基因在叶鞘和叶片中表达水平较高，而幼苗、根中表达水平较低(图2B)，

表明OsWRKY11主要在水稻地上部分发挥功能。

一种通过CRISPR/cas9基因编辑技术构建的OsWRKY11基因突变体延迟水稻抽穗期。综上所述，我们得出结论：以上结果表明，基于CRISPR/cas9基因编辑技术构建的OsWRKY11基因的突变体延迟了水稻抽穗期，从而证实了基于CRISPR/cas9基因编辑技术构建晚花水稻突变体的方法的可行性。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。