CD47抗体在制备治疗高原红细胞增多症的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及CD47抗体在制备治疗高原红细胞增多症的药物中的应用。

背景技术

高原红细胞增多症(HAPC)是常驻/久居高原人群中发病率最高、危害最大的慢性高原病。HAPC患者全血容量绝对增加、血液粘滞度增加、微循环障碍；这种血液高凝状态进而加重各脏器缺血缺氧状态，从而导致恶性循环，临床表现为多器官缺氧性损伤，严重者可因血管栓塞而猝死。

目前高原红细胞增多症的防治措施主要采取改善缺氧、放血疗法等方法改善患者的临床症状，但尚不能从根本上达到防治高原红细胞增多症的有效措施。因此，寻找高原环境下红细胞增多症治疗的其它方法显得非常必要。

CD47是免疫球蛋白家族的细胞表面分子，是一种通过连接信号调节蛋白(SIRPα)来避免被吞噬细胞清除的强有力的“不要吃我”信号。正常生理条件下，CD47在包括红细胞在内的所有细胞类型中以不同水平广泛表达，并在各种恶性细胞中过度表达，包括实体瘤和血液系统恶性肿瘤。通过单克隆抗体阻断CD47或SIRPα，或同时阻断CD47和SIRPα的双特异性抗体在各种血液学临床前模型中显示出显著的抗肿瘤活性。缺乏CD47表达的红细胞被脾红髓巨噬细胞从血液中迅速清除。目前尚未有将CD47抗体用于高原红细胞增多症治疗的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供CD47抗体在制备治疗高原红细胞增多症的药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过CD47抗体的使用，可以显著改善高原红细胞增多症，这为高原红细胞增多症的治疗和预防提供了方向。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供CD47抗体在制备治疗和/或预防高原红细胞增多症的药物中的应用。

优选的是，所述高原红细胞增多症是由于高原低氧导致红细胞增多引起。

优选的是，通过CD47抗体的使用，降低CD47表面蛋白的表达，进而实现治疗和/或预防高原红细胞增多症。

优选的是，降低CD47表面蛋白表达是通过减少红细胞的产生或者促进红细胞被吞噬实现。

本发明还提供一种治疗和/或预防高原红细胞增多症的药物，包括CD47抗体以及药学上可接受的辅料和载体。

本发明公开了以下技术效果：

红细胞因氧气供应不足而大量增殖是高原红细胞增多症患者显著特征之一，导致红细胞生成加剧，全血容量绝对增加、血液粘滞度增加、微循环障碍，血液高凝状态进而加重各脏器缺血缺氧状态，从而导致恶性循环。本发明通过构建高原红细胞增多症模型小鼠，发现低压低氧条件下小鼠骨髓、脾脏及外周血中红细胞的显著增多，并且红细胞上的CD47表达增高，CD47表达升高可以促进早期红细胞的产生并抑制巨噬细胞对衰老红细胞的吞噬。通过对高原红细胞增多症小鼠进行CD47抗体干预可以抑制CD47表达，降低高原红细胞增多症小鼠红细胞数量及血红蛋白含量，有效缓解血液粘滞度，改善小鼠生存状态。

另外，经CD47抗体治疗后，不仅高原红细胞增多症小鼠红细胞数量、血红蛋白含量等得到有效缓解，而且无明显毒副作用，治疗实施方便。因此，本发明首次提出将CD47抗体用于制备治疗高原红细胞增多症药物的新靶点，对于筛选新药具有重要意义，也为高原红细胞增多症患者的治疗和预防提供一种新思路和方向。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为高原红细胞增多症小鼠模型建立期间小鼠外周血监测，A：外周血红细胞(RBC)含量；B血红蛋白(HGB)含量；“***”表示p<0.001；

图2为高原红细胞增多症模型小鼠骨髓、脾脏及外周血红细胞表面CD47的表达的流式检测(A)及统计结果(B)，“*”表示p<0.05，“***”表示p<0.001；

图3为高原红细胞增多症小鼠腹腔注射CD47抗体示意图；

图4为注射CD47抗体后骨髓、脾脏及外周血红细胞表面CD47的表达水平，A：流式检测结果；B：统计结果；“***”表示p<0.001；

图5为注射CD47抗体后外周血中红细胞(RBC)及血红蛋白(HGB)含量，A：分别注射IgG抗体和CD47抗体后外周血红细胞含量；B：分别注射IgG抗体和CD47抗体后外周血红细胞含量；“*”表示p<0.05，“**”表示p<0.001。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

在以下的实施例中，C57/BL6小鼠(8周龄)购自北京维通利华实验动物有限公司；CD71，Ter119，CD47流式抗体，CD47中和抗体及IgG均购于达科为生物科技公司。

实施例1高原红细胞增多症小鼠模型的建立

将上述购买的小鼠随机分组，分为正常对照组(control)和低氧组(HAPC)，其中低氧组小鼠连续12周每天20h暴露在模拟6000m海拔氧分压的条件下，常氧条件下的同窝对照为对照组，每组19-20只小鼠。每两周监测一次常氧和低氧条件下小鼠外周血(PB)。

在建模第12周时，取对照组与低氧组小鼠外周血2μL到装有50μL磷酸缓冲液的试管中，随后将小鼠颈椎脱臼法处死，并用75％酒精浸泡3min后取出小鼠股骨、胫骨与髂骨，用装有磷酸盐缓冲液的1mL注射器从骨头一端将骨髓细胞冲出，随后进行计数，取出小鼠脾脏进行研磨后过细胞筛使之成为单细胞悬液后进行计数。骨髓(BM)、脾脏(SP)细胞分别取出2×10

如图1所示，与常氧条件下相比，在低氧条件下小鼠外周血中红细胞(RBC)和血红蛋白(HGB)含量均显著升高。

如图2所示，高原红细胞增多症小鼠模型中常氧和低氧条件下骨髓中CD47表达水平无显著差异，而低氧组小鼠脾脏和外周血红细胞CD47表达显著升高。

实施例2CD47抗体的作用

向低氧饲养12周的小鼠分别注射IgG或CD47抗体，注射部位为腹腔，每天一次，连续注射两周，期间小鼠维持低氧饲养，在小鼠14天时检测小鼠外周血红细胞与血红蛋白含量。具体注射小鼠的流程见图3。

(1)小鼠腹腔注射：

抓取小鼠：左手的小指和无名指抓住小鼠的尾巴，另外三个手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下，腹腔中的器官自然倒向胸部，防止注射器刺入时损伤大肠、小肠等器官。

注射：用酒精棉球轻轻擦拭小鼠腹部皮肤，进针的动作要轻柔，防止刺伤腹部器官。每只小鼠分别注射IgG或CD47抗体125μL(注射剂量8mg/kg)。注射完药物后，缓缓拔出针头，并轻微旋转针头，防止漏液。

(2)给药两周后检测小鼠外周血指标：

固定小鼠：把小鼠放在小鼠固定器，让它的尾巴伸在外面，小鼠固定好后将其尾巴置于50℃热水中浸泡数分钟，使尾部血管充盈，擦干尾部。

取血：用剪刀或刀片剪去尾尖1～2mm，用装有120μL磷酸缓冲液的试管接流出的血液，同时自尾根部向尾尖部按摩。取血后用棉球压迫止血在伤口处止血，每次采血量为20μL，混匀后用SYSMEX XN-1000全自动模块血液体液分析仪测量小鼠外周血红细胞与血红蛋白含量，具体检测方法同实施例1。

图4和图5的结果表明，与注射IgG的小鼠相比，注射CD47抗体的小鼠红细胞表面CD47表达下降，且外周血红细胞与血红蛋白含量下降。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。