丙酮酸脱羧酶基因FvPDC6及其在提高威尼斯镰刀菌菌丝蛋白产量中的应用

技术领域

本发明属于威尼斯镰刀菌基因工程技术领域，涉及丙酮酸脱羧酶基因

背景技术

我国是人口大国，蛋白资源需求量巨大，缺口超过1亿吨；加上人口增长、环境污染、气候变化等因素的影响，导致传统农畜牧业的蛋白供给不足。此外，随着消费者经济水平的提高，人们对肉类蛋白的需求也从基本的“保障供给”转向“营养健康”。因此，急需一种新的蛋白供给模式以保障肉类食品的营养价值、安全性和可持续性。威尼斯镰刀菌是从3000多株真菌中筛选到的可用于发酵生产菌丝蛋白的工业菌株，具有很好的安全性，已在全球18个国家获得食品原料上市许可。该菌株发酵产生的菌丝蛋白具有类似肉质的组织结构，并且脂肪含量低，氨基酸种类齐全，富含微量元素和维生素，同时还含有丰富的可食性粗纤维，是一种能够满足于现代人营养需求的肉类代用品。

当前，威尼斯镰刀菌发酵生产菌丝蛋白主要采用以葡萄糖为碳源的生产工艺，但是由于发酵过程副产物的产生导致其碳源转化效率低下，造成葡萄糖的过多损失，而葡萄糖的获取主要依赖于粮食作物。因此，无论是从控制菌丝蛋白的生产成本还是维护国家粮食安全出发，都有必要提高葡萄糖为碳源发酵生产菌丝蛋白时的碳源转化率。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明再有一个目的是提供一种丙酮酸脱羧酶基因

本发明另有一个目的是提供一种提高威尼斯镰刀菌菌丝蛋白产量的方法。

本发明还有一个目的是提供所述的丙酮酸脱羧酶基因

为此，本发明提供的技术方案为：

丙酮酸脱羧酶基因

a）如SEQ ID NO:6所示；

b）编码如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

c）在严谨杂交条件下与a）限定的核苷酸序列杂交且编码具有控制乙醇合成的核苷酸序列。

一种重组载体，其含有所述的丙酮酸脱羧酶基因

宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的丙酮酸脱羧酶基因

促进菌丝蛋白产量提高的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。

一株威尼斯镰刀菌，所述威尼斯镰刀菌为威尼斯镰刀菌TB6050，其分类命名为：威尼斯镰刀菌（

一种提高威尼斯镰刀菌菌丝蛋白产量的方法，包括如下步骤：

1）敲除镰刀菌体内的丙酮酸脱羧酶基因

2）将所述新的镰刀菌接种于液体培养基中进行培养，获取发酵液，并从生长的发酵液中收获菌丝蛋白。

优选的是，所述的提高威尼斯镰刀菌菌丝蛋白产量的方法中，得到所述新的镰刀菌的方法包括如下步骤：

以威尼斯镰刀菌TB01的DNA基因组为模板，以如SEQ ID NO:13和14所示的一组引物对为引物，通过PCR扩增得到内源5SrRNA启动子序列；

以如SEQ ID No:18所示的gRNA scaffold片段为模板，以如SEQ ID NO:15和16所示的一组引物对为引物，通过PCR扩增得到sgRNA

随后通过融合PCR进行两轮扩增，将所述内源5SrRNA启动子序列与所述sgRNA

将所述

优选的是，所述的提高威尼斯镰刀菌菌丝蛋白产量的方法中所述新的镰刀菌为菌株威尼斯镰刀菌TB6050，其分类命名为：威尼斯镰刀菌（

优选的是，所述的提高威尼斯镰刀菌菌丝蛋白产量的方法中，步骤2）中，所述液体培养基为发酵培养基，培养中，培养温度为26-30℃，培养时间为3-天，所述发酵培养基包含：40 g/L 葡萄糖， 0.5 g/L 酵母粉，6 g/L 硫酸铵，1.5 g/L 硫酸镁， 0.7 g/L 氯化钾，0.5 g/L 硫酸钠，2 g/L 磷酸二氢钾和0.5 g/L 碳酸钙。

所述的丙酮酸脱羧酶基因

本发明至少包括以下有益效果：

本发明通过敲除威尼斯镰刀菌一个内源丙酮酸脱羧酶可以完全切除发酵过程中副产物乙醇的合成，从而显著提高碳源向菌丝蛋白合成的流向，有效提高葡萄糖的利用率，降低菌丝蛋白发酵的生产成本。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1展示本发明实施例中威尼斯镰刀菌内源主效丙酮酸脱羧酶基因FvPDC6的挖掘：A图，各丙酮酸脱羧酶基因在不同发酵阶段表达水平的热图；B图，各丙酮酸脱羧酶基因的序列进化树和序列结构分析。

图2展示本发明实施例中FvPDC6的基因编辑表达载体的构建：A图，

图3展示本发明实施例中

图4为本发明实施例中威尼斯镰刀菌发酵上清液中的乙醇含量检测图，WT，野生型威尼斯镰刀菌TB01（CGMCC NO.20740）；1-5，

图5为本发明实施例中威尼斯镰刀菌发酵4天后的生物量及葡萄糖向菌丝蛋白合成的转化率检测图：WT，野生型威尼斯镰刀菌TB01；1-5，

威尼斯镰刀菌为威尼斯镰刀菌TB6050，其分类命名为：威尼斯镰刀菌（

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明提供一个威尼斯镰刀菌TB01内源主效丙酮酸脱羧酶基因

具体地，包括如下步骤：

1）威尼斯镰刀菌主效丙酮酸脱羧酶基因

通过对不同发酵阶段（未开始产乙醇--产乙醇对数期--产乙醇饱和期）菌体的转录组学分析，从威尼斯镰刀菌6个内源丙酮酸脱羧酶基因中挖掘到一个控制乙醇合成的主效丙酮酸脱羧酶基因。对六个内源丙酮酸脱羧酶进行进化树和序列分析发现，相比其他5个丙酮酸脱羧酶基因（

2）威尼斯镰刀菌主效丙酮酸脱羧酶基因

以引物对5SrRNA-1/2从威尼斯镰刀菌TB01的DNA基因组中扩出内源5SrRNA启动子序列（FVRRES_5S_rRNA_393），以引物对sgRNA-1/2在人工合成的gRNA scaffold片段的基础上扩出sgRNA

3）威尼斯镰刀菌丙酮酸脱羧酶基因

提取上述阳性大肠杆菌的质粒，并通过PEG介导的原生质体转化法导入到威尼斯镰刀菌TB01中获得候选

4）

将菌株接种CMC-Na固体培养基上培养10天，随后制备5 × 10

5）

将上述发酵4天后的菌体进行离心，收获无细胞上清液。随后采用以异丁醇为内标利用气相色谱仪检测样品中的乙醇浓度。所用分离柱为HP - InnoWax 30 m × 0.32 mm× 0.25µm色谱柱，检测条件为进样口和检测器的温度分别为200 ℃和250 ℃；柱箱初始柱温为60 ℃，保持1 min，第一阶以10 ℃/min的速率升至100 ℃，保持2 min，第二阶以30℃/min的速率升至200 ℃，保持6 min。

6）

取100 mL上述发酵4天后的菌体进行抽滤，分别收获菌体和无细胞上清液。利用烘箱将菌体烘干至恒重，计算其生物量（g/L）；通过在线生化分析仪测定上清液中残留葡萄糖的浓度，最终计算葡萄糖向菌丝蛋白的转化效率（g/g），计算公式为：生物量/（初始糖浓度-残留糖浓度）

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：

实施例1：威尼斯镰刀菌主效丙酮酸脱羧酶基因

1.实验方法：

在威尼斯镰刀菌不同发酵阶段（未开始产乙醇--产乙醇对数期--产乙醇饱和期）菌体的转录组学中检索出6个丙酮酸脱羧酶基因

分析结果如图1所示，丙酮酸脱羧酶基因

实施例2：威尼斯镰刀菌丙酮酸脱羧酶基因

1.引物

2.片段扩增及同源重组程序

3.实验方法

以引物对5SrRNA-1/2（SEQ ID No:13和14）从威尼斯镰刀菌TB01的DNA基因组中扩出内源5SrRNA启动子序列（FVRRES_5S_rRNA_393 ，SEQID NO:17），以引物对sgRNA-1/2（SEQID NO:15和16）在人工合成的gRNAscaffold片段（SEQ ID NO:18）的基础上扩出sgRNA

4.结果

实验结果如图2所示，电泳结果和序列测序比对结果显示，融合片段5SrRNA-sgRNA

实施例3：威尼斯镰刀菌丙酮酸脱羧酶基因

1.培养基

YEPD: 酵母粉3g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，定容到1L

溶解酶的缓冲液：0.7 M氯化钠

STC：0.8 M山梨醇；50 mM CaCl

SPTC:含40% PEG6000的STC

再生培养基：酵母提取物1 g，胰蛋白胨1 g，蔗糖274 g，琼脂糖10 g，定容1 L

筛选培养基：葡萄糖30 g，酵母粉6 g，琼脂粉15 g，定容到1 L

菌丝裂解液：取1.2 gNaOH用去离子水溶解后定容至100 mL。

菌丝中和液：10 mL 1M Tris-HCl（pH8.0），40 mL 0.3 M HCl，用去离子水定容至800 mL。

2.引物

3.片段扩增程序

4.实验方法

1.原生质体转化

1）吐温80制备威尼斯镰刀菌TB01孢悬液，涂于GY固体培养基上，28℃，培养7-10 d产孢。

2）制备孢悬液接于YEPD液体培养基中（加玻璃珠），28℃，200 rmp培养至萌发菌丝长度为孢子的3-4倍（16 h）。

3）4℃，13000 rpm，15 min收集孢子，并用无菌0.7 M氯化钠洗涤1次。

4）酶裂解液制备原生质体（20 mg崩溃酶+40 mg蜗牛酶溶于10 ml 0.7 M氯化钠，并过滤除菌），30℃ 100 rpm裂解2 h

5）三层擦镜纸过滤后4℃，7000 rpm，10 min

6）STC洗涤2次，按上述离心后用STC重选原生质体（浓度106），放于冰上备用。

7）取80 μl上述原生质体悬浮液，加入20 μl SPTC，轻轻混匀，加入FvPDC6的基因编辑表达载体（800 ng/μl）20 μl，轻轻混匀后放置冰上30 min

8）加入1 ml SPTC轻轻混匀，室温放置20 min

9）混合液加到40℃左右的再生培养基中，摇匀倒板，28℃培养过夜（12h左右）

10）倒上筛选培养基，28℃培养长出转化子（3-4 d）

11）针对筛选培养基上长出的转化子，利用菌丝裂解液和中和液对其制备简易模板（取少量菌丝体于8 μl菌丝裂解液中，98℃处理2 min，随后加入170 μl菌丝中和液即为简易模板），并通过引物对PDCyz-1/2（SEQ ID NO:20和21）扩增包含编辑位点的FvPDC6基因片段。

对扩增片段进行测序比对，鉴定出靶标基因编辑转化子。

5. 结果

实验结果如图3所示，

鉴于与野生型菌株（未被编辑）相比各转化子在乙醇合成和葡萄糖转化效率方面表现出的一致性，选取其中一株2号命名为菌株威尼斯镰刀菌TB6050并进行保藏，其分类命名为：威尼斯镰刀菌（

实施例4：FvPDC6基因编辑突变体1 L摇瓶发酵

1.培养基

发酵培养基：40 g/L 葡萄糖, 0.5 g/L 酵母粉, 6 g/L 硫酸铵, 1.5g/L 硫酸镁, 0.7 g/L 氯化钾, 0.5 g/L 硫酸钠, 2 g/L 磷酸二氢钾, 0.5g/L 碳酸钙

2.实验方法

将威尼斯镰刀菌菌株接种CMC-Na固体培养基上培养10天进行产孢，随后制备5 ×10

实施例5：

1.试剂

内标液的配制：将3.5 g的异丁醇溶于1 M盐酸中，混合均匀，过滤除菌。

2.实验方法

将实施例3中发酵4天后的菌体进行离心，收获无细胞上清液。随后将上清液与内标液异丁醇按4:1进行混合并用0.22μm过滤器进行过滤。上述混合样品利用气相色谱仪（天美）检测乙醇浓度。所用分离柱为HP - InnoWax 30 m × 0.32 mm × 0.25µm色谱柱（安捷伦），检测条件为进样口和检测器的温度分别为200 ℃和250 ℃；柱箱初始柱温为60 ℃，保持1 min，第一阶以10 ℃/min的速率升至100 ℃，保持2 min，第二阶以30 ℃/min的速率升至200 ℃，保持6 min。

3.实验结果

实验结果如图4所示，相比野生型菌株，敲除

实施例6：

1.实验方法

取100 mL实施例3中发酵4天后的菌体进行抽滤，分别收获菌体和无细胞上清液。收集的菌体利用烘箱烘干至恒重，计算其生物量（g/L）；收集的上清液稀释100倍后通过在线生化分析仪测定其中残留葡萄糖的浓度，最终计算葡萄糖向菌丝蛋白的转化效率（g/g），计算公式为：生物量/（初始糖浓度-残留糖浓度）。

2.实验结果

实验结果如图5所示，相比威尼斯镰刀菌野生型菌株，

这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。