SOCS1作为免疫抑制靶点在T细胞免疫耐受调控中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体地说，本发明主要涉及SOCS1作为免疫抑制靶点在T细胞免疫耐受调控中的应用。

背景技术

G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factor)起初被定义为粒细胞刺激因子，可以刺激骨髓中髓系祖细胞增殖并向成熟粒细胞分化发育。对于健康供者给予G-CSF预处理，不仅可以将骨髓中CD34

此外，G-CSF不仅可应用于造血干细胞中预处理供者促使移植物中免疫细胞形成免疫耐受态，此外还可应用于自身免疫疾病的治疗中。在多种免疫疾病小鼠模型中，同样证实G-CSF具有诱导Th2类因子分泌，产生耐受的DCs并进一步促进Treg分化的功能。而在前期临床研究中则发现，G-CSF对于治疗克罗恩病(Crohn’s disease)安全且有效。患者在疾病活跃期接受连续12周的300μg G-CSF治疗后病症得到显著缓解并伴随有IL-10和耐受型DCs水平的增加(P.J.Mannon,F.Leon,I.J.Fuss,B.A.Walter,M.Begnami,M.Quezado,Z.Yang,C.Yi,C.Groden,J.Friend,R.L.Hornung,M.Brown,S.Gurprasad,B.Kelsall,W.Strober,Successful granulocyte-colony stimulating factor treatment of Crohn's diseaseis associated with the appearance of circulating interleukin-10-producing Tcells and increased lamina propria plasmacytoid dendritic cells.Clin ExpImmunol 155,447-456(2009))。此外，在一项1型糖尿病的临床试验中提示，联合使用G-CSF和抗胸腺细胞球蛋白(ATG)可使Treg细胞比例增加并保护β细胞功能(M.J.Haller,S.E.Gitelman,P.A.Gottlieb,A.W.Michels,S.M.Rosenthal,J.J.Shuster,B.Zou,T.M.Brusko,M.A.Hulme,C.H.Wasserfall,C.E.Mathews,M.A.Atkinson,D.A.Schatz,Anti-thymocyte globulin/G-CSF treatment preserves beta cell function in patientswith established type1diabetes.J Clin Invest 125,448-455(2015))。

鉴于G-CSF的免疫调节作用不仅适用于造血干细胞移植中抑制GVHD的发生，同时在多种自身免疫疾病中仍可对免疫细胞产生调节作用。因此深入研究G-CSF调控免疫耐受的分子机制，对于寻找新的免疫耐受靶点，指导临床预防及治疗GVHD、自身免疫病等具有重要意义。

SOCS1(Suppressor of Cytokine Signaling 1)属于SOCS家族蛋白的重要成员。人类中的SOCS1基因位于16p13，包含有2个外显子，其全长序列请参见SEQ ID NO.1，CDS序列请参见SEQ ID NO.2，SOCS1蛋白由211个氨基酸编码组成SOCS1蛋白(其氨基酸序列请参加安SEQ ID NO.3)，其中在SOCS1的启动子区域包含有STAT结合位点。有人推测SOCS1对细胞因子相关信号通路可能有着调控作用，例如有人报道，SOCS1对于IFN-γ信号通路有着重要的调控作用(W.S.Alexander,R.Starr,J.E.Fenner,C.L.Scott,E.Handman,N.S.Sprigg,J.E.Corbin,A.L.Cornish,R.Darwiche,C.M.Owczarek,T.W.Kay,N.A.Nicola,P.J.Hertzog,D.Metcalf,D.J.Hilton,SOCS1 is a critical inhibitor of interferongamma signaling and prevents the potentially fatal neonatal actions of thiscytokine.Cell 98,597-608(1999))。此外，由于在SOCS1基因的启动子区域包含有STAT结合位点，因此推测SOCS1与JAK-STAT信号通路相关的多种细胞因子如IL-6、IL-2、IL-4、IL-7等的调控可能相关。但是，在实验性自身免疫性脑炎模型(EAE)中，敲除Socs1则减轻小鼠模型的炎症反应，提示Socs1基因在不同的疾病模型中，调节作用可能不一样。

发明内容

本发明人通过深入研究，发现SOCS1是G-CSF诱导免疫耐受调控的关键靶分子。具体地说，本发明人通过对G-CSF动员前后健康供者的CD3

本发明在第一方面提供了SOCS1在制备用于检测、预防或治疗患者的疾病的药物或试剂盒中的应用，所述疾病为T细胞免疫耐受调控相关疾病。

在一些优选的实施方式中，所述药物检测用药物，所述试剂盒为检测用试剂盒，并且SOCS1基因或蛋白作为所述疾病的标记物；优选的是，所述药物或试剂盒包含与SOCS1基因互补的特异性核酸序列或抗SOCS1蛋白的特异性抗体。

本发明在第二方面提供了SOCS1在制备用于抑制患者的T细胞增殖的药物中的应用。

在另一些优选的实施方式中，所述抑制患者的T细胞增殖为诱导患者的T细胞进入耐受态。

本发明在第二方面提供了SOCS1在制备用于调节患者的如下关键靶点的药物中的应用：(1)TIGIT；(2)Th1因子，优选的是，所述Th1因子为IL-2和/或IFN-γ；(3)Th2因子，优选的是，所述Th2因子选自IL-4和/或IL-10；(4)Th17因子如IL-17；和(5)Ki67。

在另一些优选的实施方式中，所述药物为预防用药物或治疗用药物，并且SOCS1基因或蛋白作为所述疾病的调控靶点。

在另一些优选的实施方式中，所述药物包含用于增加患者体内SOCS1基因或蛋白的量的试剂，优选的是，所述试剂为SOCS1激动剂例如粒细胞刺激因子。

在另一些优选的实施方式中，所述增加患者体内SOCS1的量通过过表达患者体内SOCS1基因或蛋白来实现。

在另一些优选的实施方式中，所述疾病为肿瘤或移植物抗宿主病。

在另一些优选的实施方式中，所述疾病为实体肿瘤或血液系统恶性肿瘤；优选的是，所述血液系统恶性肿瘤为白血病；另外优选的是，所述疾病为异基因造血干细胞移植引起的疾病。

本发明证实SOCS1不仅是G-CSF诱导T细胞免疫耐受的关键靶点，同时，SOCS1的高水平表达可以抑制稳态T细胞的增殖活化，而在造血干细胞移植后发生移植物抗宿主病(GVHD)的患者中，SOCS1呈现低水平表达。因此，可以将SOCS1作为免疫抑制靶点，通过监测G-CSF动员后移植物中SOCS1表达水平，预测患者GVHD发生的概率；由于证实了SOCS1是G-CSF移植后诱导免疫耐受的关键靶点，如果G-CSF动员后的移植物中SOCS1表达水平未能上调，在移植后有可能发生严重的GVHD反应，因此可以对患者提前通过免疫抑制剂进行预防性预处理；而且，在移植后发生GVHD患者中，可通过SOCS1的激动剂或SOCS1蛋白，抑制T细胞的活化，从而治疗GVHD。总而言之，本发明明确SOCS1对于维持耐受态T细胞的关键调控作用，证实SOCS1是重要的免疫抑制靶点，为临床预防及治疗GVHD及自身免疫疾病提供新的靶分子。

附图说明

图1显示G-CSF动员前、后CD4(A)和CD8(B)T细胞亚群基因表达谱变化。

图2显示G-CSF体外可提高SOCS1表达水平。其中，(A)G-CSF体外作用于健康供者骨髓来源的T细胞不同时间检测SOCS1表达水平；(B)G-CSF体外作用T细胞72h后SOCS1表达水平；(C)G-CSF体外作用T细胞4h后SOCS1表达水平。

图3显示G-CSF可在体外抑制T细胞向Th1亚群分化。

(A)G-CSF体外作用T细胞72h后GCSFR的表达水平流式图；(B)G-CSF体外作用T细胞72h后GCSFR的表达水平统计图；(C)G-CSF体外作用T细胞72h后IL-2分泌水平流式图；(D)G-CSF体外作用T细胞72h后IL-2分泌水平统计图。

图4显示利用慢病毒在T细胞中过表达SOCS1时的表达水平。

图5显示体外水平T细胞中过表达SOCS1后抑制T细胞增殖，其中，(A)过表达SOCS1流式分析圈门策略；(B)过表达SOCS1后T细胞周期检测流式图；(C)CD4

图6显示T细胞中高表达SOCS1后TIGIT表达上升并且IL-10分泌增加，其中，(A)GFP

图7显示在G-CSF动员后的T细胞中敲降SOCS1，其中，(A)Q-PCR验证siRNA敲降效率；(B)流式检测敲降SOCS1后CD4+T细胞中IL-10分泌水平；(C)流式检测敲降SOCS1后CD8+T细胞中IL-10分泌水平；(D)ELISA检测敲降SOCS1后T细胞中IL-10分泌水平。

图8显示Socs1是G-CSF延缓GVHD的关键靶分子。

图9显示白血病小鼠模型生存期。

图10显示移植后发生aGVHD与同期未发生aGVHD(None GVHD)患者T细胞内SOCS1表达水平。

具体实施方式

实施例1

本发明人对3例健康供者动员前、后CD3

实施例2

在本实施例中，本发明人将健康供者来源T细胞体外培养直接给予G-CSF刺激，探索G-CSF是否可以直接上调SOCS1表达并引起T细胞功能改变，具体步骤如下：

(1)收集健康供者骨髓标本，提取单个核细胞，利用CD3磁珠(Miltenyi Biotec,Bergische Gladbach,Germany)分选CD3

(2)确定刺激条件后，按照该刺激条件对健康供者CD3

(3)同时，利用流式细胞术及ELISA技术分析给予G-CSF后T细胞增殖和胞内因子(Th1类因子如IL-2、IFN-γ；Th2类因子如IL-4、IL-10；Th17如IL-17；Ki67)的分泌变化。流式细胞术实验具体操作方法：每管样品管中加入5×10

实施例3

在本实施例中，利用慢病毒载体在健康供者T细胞中过表达SOCS1基因，验证过表达SOCS1后是否可诱导T细胞免疫耐受，具体步骤如下：

(1)构建带有GFP荧光的SOCS1过表达慢病毒载体。包装并浓缩病毒后，将健康供者来源的CD3

(2)通过如实施例2所述的方法，利用Q-PCR验证SOCS1过表达水平。

(3)通过如实施例2所述的方法，利用流式分析过表达SOCS1后T细胞的增殖能力及T细胞耗竭相关表面分子如PD-1、TIGIT等的表达水平变化。通过流式和ELISA分析Th1及Th2类因子分泌的变化。

实施例4

在本实施例中，本发明人利用靶向SOCS1的siRNA，在动员后供者骨髓T细胞中敲降SOCS1，验证T细胞免疫耐受的表型是否消失，具体步骤如下：

(1)收集G-CSF连续预处理4天后供者的骨髓标本，提取单个核细胞，利用CD3磁珠分选CD3

(2)转染72h后收集T细胞，利用Q-PCR检测SOCS1敲降效率。

(3)利用流式分析过表达SOCS1后T细胞的增殖能力及T细胞耗竭相关表面分子如PD-1、TIGIT等的表达水平变化。通过流式和ELISA分析Th1及Th2类因子分泌的变化。

以下实施例5至7将通过体内水平T细胞特异性SOCS1基因敲除小鼠，明确SOCS1是否在维持T细胞的免疫耐受中起到重要调控作用。

实施例5

在本实施例中，本发明人对SOCS1

(1)将SOCS1

(2)在第6日处死小鼠，取出小鼠的胸腺、脾脏、骨髓细胞制备单细胞悬液，标记抗体流式上机检测以下指标：①T细胞免疫表型：CD3，CD4，CD8，CD44，CD62L，CD25，Foxp3；②T细胞因子分泌水平：CD3，CD4，CD8，Th1/2/17(如IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-10，IL-17。

实施例6

在本实施例中，本发明人建立GVHD移植小鼠模型，探索SOCS1敲除后，G-CSF诱导的T细胞免疫耐受是否受抑，具体步骤如下：

(1)将SOCS1

②SOCS1

④Cre

(2)受鼠BALB/c(H-2

②TCD-BM(5×10

③TCD-BM(5×10

④TCD-BM(5×10

⑤TCD-BM(5×10

(3)移植后观察并记录受鼠生存期。

实施例7

在本实施例中，本发明人在GVHD移植小鼠模型的受鼠体内检测供鼠来源的T细胞表型及功能变化，具体步骤如下：

(1)将SOCS1

②SOCS1

④Cre

(2)受鼠BALB/c(H-2

(3)在移植后受鼠发生GVHD时，处死小鼠，取脾脏细胞进行如下检测：

①T细胞免疫表型：CD3，CD4，CD8，CD44，CD62L，CD25，Foxp3；

②T细胞增殖水平：CD3，CD4，CD8，Ki67，DAPI；

③T细胞因子分泌水平：CD3，CD4，CD8，Th1/2/17(如IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-10，IL-17。

实施例8

在本实施例中，本发明人通过建立MLL-AF9诱发的非照射小鼠白血病模型，利用该模型进一步明确在白血病环境下SOCS1对于T细胞的调控作用，具体步骤如下：

(1)复苏已冻存的人融合基因MLL-AF9诱发的小鼠AML细胞，通过台盼蓝染色计数活细胞，并通过流式细胞术检测GFP

(2)将准备好的细胞悬液通过尾静脉注射，移植到非照射的SOCS1

(3)观察并记录白血病小鼠生存期。

实施例9

在本实施例中，本发明人通过检测在造血干细胞移植后的人原代T细胞中检测SOCS1表达水平，分析SOCS1表达水平与GVHD发生的相关性，具体步骤如下：

(2)(1)利用Ficol试剂提取患者外周血单个核细胞，收取造血干细胞移植后发生GVHD的患者外周血标本，同时收取移植后相同时间点未发生GVHD患者外周血标本作为对照；利用美天旎磁珠分选CD3

(3)进行荧光定量PCR，利用Q-PCR检测SOCS1基因表达水平。

从以上实施例所述的实验可以得到如下结果(1)G-CSF上调CD3

本发明人发现，SOCS1在G-CSF动员后的两个耐受态T细胞亚群中表达水平均显著升高(图1)，提示SOCS1可能是G-CSF诱导T细胞免疫耐受的关键靶点。

(2)G-CSF可在体外直接提高SOCS1的表达水平

为了进一步明确SOCS1是否是G-CSF诱导T细胞免疫耐受的关键靶分子。本发明人中通过体外对稳态T细胞直接给予G-CSF刺激，检测G-CSF是否可直接调控SOCS1。首先，本发明人探索了G-CSF(100ng/ml)体外刺激CD3

(3)G-CSF可在体外抑制T细胞向Th1亚群分化

本发明人进一步检测了G-CSF体外对T细胞功能的调控。首先，本发明人通过FACS检测了G-CSF刺激72h后的T细胞表面G-CSF受体表达水平。流式分析结果提示，G-CSF可以激活CD4

(4)体外水平利用慢病毒在T细胞中过表达SOCS1

为了探索SOCS1的高表达是否可以诱导T细胞免疫耐受，本发明人在体外稳态T细胞中过表达SOCS1。首先将SOCS1 mRNA克隆至带有绿色荧光蛋白的慢病毒载体中(LV-h-SOCS1-3xflag-ZsGreen-PURO载体，购自上海生工公司)。将SOCS1或空载对照(CT)慢病毒感染健康供者骨髓来源的CD3

(5)T细胞中过表达SOCS1可抑制T细胞的增殖

对于过表达SOCS1后T细胞表型进行流式检测，图5A为流式圈门策略。首先本发明人检测了过表达SOCS1后T细胞的增殖水平，结果提示T细胞增殖能力显著下降，在SOCS1过表达组大部分T细胞主要被阻滞于G0期，无法进入细胞周期(图5B)。统计结果表明，SOCS1OE组中CD4

(6)T细胞中过表达SOCS1后耗竭相关分子表达上升并且IL-10分泌增加此外，过表达SOCS1后，T细胞耗竭相关Marker TIGIT表达水平也显著上调(图6A)。同时，流式分析表明，过表达SOCS1后，IL-10的分泌有所增加，但无统计学差异(图6B)。以上结果提示，过表达SOCS1可促使T细胞表面耗竭相关分子的表达，同时促使T细胞呈现向Th2类亚型分化的趋势。

(7)在G-CSF动员后的健康供者T细胞中敲降SOCS1后IL-10分泌下降

为了进一步验证SOCS1在G-CSF诱导的耐受态T细胞中的调控作用，本发明人收集了经G-CSF动员后的健康供者骨髓来源的CD3

(8)敲除SOCS1后G-CSF无法延缓GVHD小鼠生存期

为了进一步验证SOCS1是否是G-CSF诱导免疫耐受的关键靶点，本发明人利用Cre/Loxp系统构建了T细胞特异性敲除SOCS1转基因小鼠模型。首先本发明人检测了敲除Socs1后对稳态条件下T细胞的影响。本发明人发现，T细胞中特异性敲除Socs1后，敲除组(cKO)相较于野生型(WT)

(9)T细胞中特异性敲除SOCS1可显著延长白血病小鼠生存期

为了探索不同病理环境下，SOCS1对于T细胞免疫抑制功能的调控作用，本发明人构建了MLL-AF9诱发的非照射急性髓系白血病小鼠模型。本发明人将MLL-AF9小鼠白血病细胞移植至非照射野生型(WT)或T细胞特异性敲除SOCS1(KO)小鼠体内。生存期结果显示，T细胞特异性敲除SOCS1后，白血病小鼠生存期相较于野生型显著延长(图9)。这一结果提示，缺失SOCS1的T细胞更为活化，可能具有更强的抗白血病作用。

(10)SOCS1在异基因造血干细胞移植后发生GVHD患者的T细胞内表达水平降低

本发明人选取了行异基因造血干细胞移植术后发生急性GVHD(aGVHD)的患者，以移植后同期未发生aGVHD患者为对照。收集外周血标本，富集CD3

通过研究，本发明人明确了SOCS1是G-CSF诱导免疫耐受调控的关键靶分子。本发明人通过体外原代T细胞水平实验，证实G-CSF可以直接上调SOCS1的表达水平。同时T细胞中高水平表达SOCS1可以抑制T细胞增殖，并上调耗竭相关分子TIGIT表达，提示SOCS1诱导T细胞进入耐受状态。通过GVHD小鼠模型，在体内水平本发明人证实当T细胞缺失SOCS1，G-CSF则无法诱导T细胞进入免疫耐受态并降低GVHD的发生。本发明人的工作本发明人进一步通过T细胞中特异性SOCS1基因敲除鼠证实，当敲除SOCS1后，G-CSF无法诱导T细胞进入耐受态。此外，在小鼠白血病模型中证实，缺失SOCS1的T细胞更为活跃，具有更强的抗白血病作用。同时，在临床标本中，本发明人发现异基因造血干细胞移植后，发生aGVHD患者体内T细胞中的SOCS1表达水平，与同期未发生GVHD患者相比，显著降低。提示SOCS1在T细胞内的低水平表达与aGVHD的发生密切相关。本发明人的工作，明确了SOCS1对于维持耐受态T细胞的关键调控作用，提示SOCS1是重要的免疫抑制靶点，为临床预防及治疗GVHD及自身免疫疾病提供新的靶分子以及实验证据的支持。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京大学人民医院

<120> SOCS1作为免疫抑制靶点在T细胞免疫耐受调控中的应用

<130> GY21100066

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1788

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

gaacagagcg agctgcggcc gtggcagctg cacggctcct ggccccggag catgcgcgag 60

agccgccccg gagcgccccg gagccccccg ccgtcccgcc cgcggcgtcc cgcgccccgc 120

cgccaggtga gccgggccct gggcgaggag gcgggaggga ggagggaggg gagtccaggg 180

cagccaggag tcgggcgagc ctcgggggct gcagaatggg gtcgcggccg cgatgcccct 240

gaccctcgcc ggccccaccc aggccgcccc ccgcgcgcgg ggctcccgca gcacagcctt 300

tctccggccc tagcccaaat cgcccagacc aggcgcggat cccagcctgg ccagcaggcg 360

gcgggcgcgg ggcggcgagc cggggccgga cggctggagc cagaaccggc tgctctccac 420

gcccccctct cggtgctgcc cggaggccgg actccgcctc caccgagccc ccacccgccg 480

ggaagagctc cgcggagtac agagcccatt ttctagctgt gtccactgag gctgaacgga 540

tccgcgcgga cttggtgctc cgtgctcgcc ccctagggcc gggtccgccg ggagcgccgc 600

cctccggagt tgtccggccg gcgcacacct gcccggcccc gcagcgcccc agctcacctc 660

tttgtctctc ccgcagcgca cccccggacg ctatggccca cccctccggc tggccccttc 720

tgtaggatgg tagcacacaa ccaggtggca gccgacaatg cagtctccac agcagcagag 780

ccccgacggc ggccagaacc ttcctcctct tcctcctcct cgcccgcggc ccccgcgcgc 840

ccgcggccgt gccccgcggt cccggccccg gcccccggcg acacgcactt ccgcacattc 900

cgttcgcacg ccgattaccg gcgcatcacg cgcgccagcg cgctcctgga cgcctgcgga 960

ttctactggg ggcccctgag cgtgcacggg gcgcacgagc ggctgcgcgc cgagcccgtg 1020

ggcaccttcc tggtgcgcga cagccgccag cggaactgct ttttcgccct tagcgtgaag 1080

atggcctcgg gacccacgag catccgcgtg cactttcagg ccggccgctt tcacctggat 1140

ggcagccgcg agagcttcga ctgcctcttc gagctgctgg agcactacgt ggcggcgccg 1200

cgccgcatgc tgggggcccc gctgcgccag cgccgcgtgc ggccgctgca ggagctgtgc 1260

cgccagcgca tcgtggccac cgtgggccgc gagaacctgg ctcgcatccc cctcaacccc 1320

gtcctccgcg actacctgag ctccttcccc ttccagattt gaccggcagc gcccgccgtg 1380

cacgcagcat taactgggat gccgtgttat tttgttatta cttgcctgga accatgtggg 1440

taccctcccc ggcctgggtt ggagggagcg gatgggtgta ggggcgaggc gcctcccgcc 1500

ctcggctgga gacgaggccg cagacccctt ctcacctctt gagggggtcc tccccctcct 1560

ggtgctccct ctgggtcccc ctggttgttg tagcagctta actgtatctg gagccaggac 1620

ctgaactcgc acctcctacc tcttcatgtt tacatatacc cagtatcttt gcacaaacca 1680

ggggttgggg gagggtctct ggctttattt ttctgctgtg cagaatccta ttttatattt 1740

tttaaagtca gtttaggtaa taaactttat tatgaaagtt tttttttt 1788

<210> 2

<211> 636

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

atggtagcac acaaccaggt ggcagccgac aatgcagtct ccacagcagc agagccccga 60

cggcggccag aaccttcctc ctcttcctcc tcctcgcccg cggcccccgc gcgcccgcgg 120

ccgtgccccg cggtcccggc cccggccccc ggcgacacgc acttccgcac attccgttcg 180

cacgccgatt accggcgcat cacgcgcgcc agcgcgctcc tggacgcctg cggattctac 240

tgggggcccc tgagcgtgca cggggcgcac gagcggctgc gcgccgagcc cgtgggcacc 300

ttcctggtgc gcgacagccg ccagcggaac tgctttttcg cccttagcgt gaagatggcc 360

tcgggaccca cgagcatccg cgtgcacttt caggccggcc gctttcacct ggatggcagc 420

cgcgagagct tcgactgcct cttcgagctg ctggagcact acgtggcggc gccgcgccgc 480

atgctggggg ccccgctgcg ccagcgccgc gtgcggccgc tgcaggagct gtgccgccag 540

cgcatcgtgg ccaccgtggg ccgcgagaac ctggctcgca tccccctcaa ccccgtcctc 600

cgcgactacc tgagctcctt ccccttccag atttga 636

<210> 3

<211> 211

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Met Val Ala His Asn Gln Val Ala Ala Asp Asn Ala Val Ser Thr Ala

1 5 10 15

Ala Glu Pro Arg Arg Arg Pro Glu Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser

20 25 30

Pro Ala Ala Pro Ala Arg Pro Arg Pro Cys Pro Ala Val Pro Ala Pro

35 40 45

Ala Pro Gly Asp Thr His Phe Arg Thr Phe Arg Ser His Ala Asp Tyr

50 55 60

Arg Arg Ile Thr Arg Ala Ser Ala Leu Leu Asp Ala Cys Gly Phe Tyr

65 70 75 80

Trp Gly Pro Leu Ser Val His Gly Ala His Glu Arg Leu Arg Ala Glu

85 90 95

Pro Val Gly Thr Phe Leu Val Arg Asp Ser Arg Gln Arg Asn Cys Phe

100 105 110

Phe Ala Leu Ser Val Lys Met Ala Ser Gly Pro Thr Ser Ile Arg Val

115 120 125

His Phe Gln Ala Gly Arg Phe His Leu Asp Gly Ser Arg Glu Ser Phe

130 135 140

Asp Cys Leu Phe Glu Leu Leu Glu His Tyr Val Ala Ala Pro Arg Arg

145 150 155 160

Met Leu Gly Ala Pro Leu Arg Gln Arg Arg Val Arg Pro Leu Gln Glu

165 170 175

Leu Cys Arg Gln Arg Ile Val Ala Thr Val Gly Arg Glu Asn Leu Ala

180 185 190

Arg Ile Pro Leu Asn Pro Val Leu Arg Asp Tyr Leu Ser Ser Phe Pro

195 200 205

Phe Gln Ile

210