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猪圆环病毒2型感染性DNA的构建及体外拯救

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感染性分子克隆是研究病毒复制和致病机制的有力工具。本研究首次应用PCR诱变技术解决了外源片段易于自连的难题,成功将两个PCV2 SD1株全基因组(DQ346683)头尾相接插入到真核生物表达载体pSK的多克隆位点中,构建重组质粒pSK-2PCV2;另外构建含单个PCV2全基因组的pSK-PCV2和自身环化质粒ds-PCV2。pSK-PCV2中含有一个线性化PCV2全基因组,长1767bp,载体中PCV2从496nt开始,其起始位点(Ori)含有保守序列的茎环结构未被破坏;ds-PCV2为单个全基因自连产物。将所得3种质粒分别转染无PCV污染的PK-15细胞系,经10次连续传代后,间接免疫荧光试验检测显示三者均在细胞核中含有大量的病毒抗原;提取mRNA后经RT-PcR检测都有PCV2特异性基因转录;透射电镜下可观察到直径约为17-20nm的典型PCV2病毒粒子;经测序鉴定所拯救出的病毒与亲本病毒核苷酸同源性为100%。所构建的3种重组质粒均可表达并在体外组装出有感染性的PCV2病毒粒子,拯救出的PCV2与亲本病毒具有相同的病毒学及分子生物学特性。本研究在国内首次应用PCR诱变技术成功构建PCV2双拷贝感染性克隆,并经体外拯救证实其具有感染性,为进行PCV2分子特性、疫苗免疫及致病机理研究打下了基础。

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来源
《中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十三次学术研讨会》|2009年|553-557|共5页
会议地点南宁
作者
李俊; 于周; 徐绍建; 程凯慧; 王金宝;
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作者单位

中国畜牧兽医学会;

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会议组织
正文语种
原文格式 PDF
中图分类 S858.28:S852.659.2;
关键词
猪圆环病毒2型; 感染性DNA; PK-15细胞系; 体外拯救; PCR诱变技术;

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