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PKH26标记骨髓基质干细胞与软骨脱细胞基质多孔支架在裸鼠体内异位构建组织工程化软骨的实验研究

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摘要

目的：研制天然软骨细胞外基质来源的新型组织工程软骨支架材料(CEDPS)，探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)向软骨方向诱导分化后与CEDPS构建的复合体在体外以及裸鼠体内成软骨的可行性，并结合PkH26荧光建立一种无创伤性荧光图像评估体内组织工程化组织的新方法。rn 方法：(1)将天然软骨经过系列物理化学处理，得到软骨细胞外基质来源的三维多孔支架(CEDPS)，并进行组织学、生物力学、生物相容性等系列评估。(2)BMSCs经成软骨诱导后，种植到支架上，体外培养1，3周后，进行电镜、Dead/Live免疫荧光染色、组织学等观察。(3)PKH26荧光标记成软骨诱导的BMSCs，接种到CEDPS支架上，异位植入裸鼠背部，4周后利用分子荧光活体成像系统无创伤性评估组织工程化组织在裸鼠体内生长情况，然后取材进行组织学以及Ⅱ型胶原免疫荧光检测，与荧光图象比较。rn 结果：(1)组织学显示CEDPS支架蕃红花“O”、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性；生化定量表明支架保留了大部分的细胞外基质；Micro-CT与扫描电镜结果显示支架内孔洞相互连通，具有良好的孔径和孔隙率；支架具有良好的吸水性能，支架的纵向弹性模量与软骨一个数量级；扫描电镜观察显示细胞在支架上生长良好，细胞毒性实验表明支架对细胞的生长、增殖无影响。(2)体外培养的BMSCs-CEDPS复合体形成了类软骨样组织，Dead/Live染色表明MSCs在支架内部活性良好，组织学结果表明蕃红花“O”、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性，电镜和组织学结果表明随着培养时间的增加，细胞在支架中增殖显著，细胞基质分泌增加。(3)PKH26标记不影响MSC的增殖率。4周后活体荧光示踪显示MSCs在支架内生长良好，无扩散趋势，MSCs-CEDPS复合体在裸鼠体内生成软骨样组织，番红O、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性，免疫荧光检查表明构建的软骨样组织内的细胞来源为接种的PKH26标记的MSCs。rn 结论：(1)CEDPS支架具备良好的结构和性能，可作为软骨组织工程的支架载体。(2)CEDPS能为BMSCs成软骨方向诱导分化提供理想的三维立体环境，BMSCs与CEDPS复合能在体外构建类软骨样组织。(3)利用BMSCs和CEDPS支架能够在裸鼠皮下异位构建类软骨样组织。PKH26标记与与分子荧光活体成像系统结合，能够无创伤性评估组织工程化组织的种子细胞在动物体内生长情况与转归，是组织工程研究的一种新工具。

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