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首页> 中文会议>中华中医药学会中药实验药理分会2014年学术年会 >欧当归内酯A通过SYK激酶活性和IκBα降解改善内皮细胞活化和IL-32表达

欧当归内酯A通过SYK激酶活性和IκBα降解改善内皮细胞活化和IL-32表达

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目的:白介素-32(IL-32)是一种新发现的促炎细胞因子,虽然IL-32受体还没有被确定,但是,IL-32可诱导巨噬细胞炎性细胞因子释放.各种组织的内皮细胞内IL-32也呈高水平表达.一些研究表明,IL-23可能参与动脉粥样硬化的发病机制.欧当归内酯A是从伞形科植物中分离到的苯酞二聚体,其药理活性所知很少.在本研究中,试图观察欧当归内酯A对TNFα或LPS诱导的内皮细胞活化的抑制效果以及机制.rn 方法:使用NF-κBκ荧光素酶报告质粒测定NF-κB活性。使用实时定量PCR检测mRNA表达。用单核细胞粘附实验评价内皮细胞活化。通过免疫印迹法检测蛋白表达和磷酸化水平。RNA干扰法沉默Syk表达。SYK体外活性测定由ADP激酶测定系统测定。rn 结果:1、欧当归内酯A和新当归内酯对NF-κB荧光素酶报告活性的影响。使用NF-κBκ荧光素酶检测系统，探讨了不同类型的苯酞二聚体欧当归内酯A和新当归内酯对TNF-α。诱导NF-κB激活作用的抑制效果。HEK293细胞转染NF-κB萤火虫荧光素酶报告基因质粒，同时共转染海肾荧光素酶质粒作为内控指标。使用l0ng/mL TNF- α刺激NF-κB荧光素酶活性，欧当归内酯A或新当归内酯在10-9～10-4M范围内能够减弱NF-κB活性，而且欧当归内酯A比新当归内酯更有效。欧当归内酯A的IC50为29.0 μM。2、欧当归内酯A对促炎性细胞因子mRNA表达的抑制作用。用实时定量PCR检测欧当归内酯A对炎症基因表达的抑制效果。欧当归内酯A非常显著地抑制TNF-α诱导的内皮细胞的TNF-α、IL-1β,MCP-1和VCAM-1的mRNA的表达。同时欧当归内酯A也显著地抑制IL-32β和IL-32γ的mRNA表达，并且其24小时的阻断效果明显高于6小时。3、欧当归内酯A抑制LPS刺激的人脐静脉内皮细胞与单核细胞的粘附。血管内皮细胞的VCAM-1表达与动脉粥样硬化的单核细胞粘附具有密切关系。100ng/ml的LPS与人脐静脉内皮细胞孵育16小时，贴壁的U937单核细胞明显增加到74±3.9细胞数/平方毫米。鼠抗人单克隆抗VCAM-1的E1/6抗体几乎完全阻断这种勃附。欧当归内酯A剂量依赖性地减少U937单核细胞粘附，其抑制效果为34.5±6.4细胞数/平方毫米(5μM,P<0.05)到20.0±2.8细胞数/平方毫米(100μM,P<0.005)。4、欧当归内酯A阻止LPS诱导的IBκα而不是IκBβ降解。LPS刺激可触发MyD88依赖的早期阶段的IκBα/NF-κB的活化和TRIF依赖的后期的IκBβ降解的NF-κB活化。为此，免疫印迹法观察到欧当归内酯A抑制IβBα瞬态降解而非IκBβ降解，有力地提示欧当归内醋A阻断MyD88依赖早期炎症反应。5、欧当归内酯A对Syk活性的影响。Syk激酶对MyD88依赖NF-κB活性是需要的。欧当归内酯A剂量依赖性抑制LPS诱导的Syk磷酸化和蛋白向上移位。还使用一个Syk激酶和ADP GLOTM激酶检测试剂盒观察了欧当归内酯A的细胞外直接抑制效果，发现欧当归内酯A剂量依赖性地减弱SYK活性，其IC50为0.129μM。6、酪氨酸激酶Syk沉默抑制LPS诱导NF-κB活化。为T验证SYK作为NF-κB的上行信号，使用了Syk的RNA干扰法抑制Syk蛋白表达。结果表明，与siRNA CTRL相比，siRNA-SYK显著减弱LPS诱导的Syk的磷酸化，并阻止IκBα降解。同时，Syk的沉默也降低VCAM-1的表达。rn 结论:研究结果表明，欧当归内酯A改善内皮细胞活化和IL-1β,IL-32等细胞因子的表达。发现欧当归内酯A阻止IκBα而非IκBβ降解，抑制NF-κB荧光素酶报告基因活性。欧当归内酯A也剂量依赖性地抑制Syk磷酸化及直接活性，其IC50为0.129μM。上述结果支持假设研究，欧当归内酯A抑制内皮细胞活化和IL-32等细胞因子的表达是通过syk-IκBα/NFκB通路的。

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